Name: Identification des protéines végétales se liant à glace par lévaluation de linhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Découvrez l'identification des protéines végétales se liant à glace par évaluation de l'inhibition de recristallisation et isolement par purification ice-affinité. Cette méthode simplifiée permet d'isoler ces protéines sans techniques complexes.

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Ce travail a été financé par une subvention du CRSNG à VKW (Canada).

1. Appareil d&#39;installation Splat <ol><li> Remplir un bain à circulation d&#39;eau à température programmable avec l&#39;éthylène glycol (50% v / v dans l&#39;eau). REMARQUE: l&#39;éthylène glycol automobile vert peut être utilisé. </li><li> Pour assembler la chambre externe, utiliser un tube en plastique isolant pour fixer le bain d&#39;eau dans un bol en verre à double paroi. Isoler le bol en verre avec de la mousse de polystyrène et couvrir d&#39;un couvercle de boîte de Pétri en plastique. Découper un trou 3-4 pouces dans le fond de la chambre de polystyrène de sorte que la source de lumière peut être vu à travers la chambre de verre. </li><li> Monter la chambre externe sur un microscope de dissection, muni d&#39;un port d&#39;appareil photo et un objectif polarisé 4X avec une lentille oculaire de 10x. Placer une pièce supplémentaire de pellicule polarisée dans le fond de la chambre externe. </li><li> Fixer un tube de 1 à 1,5 m (~ 5 cm de diamètre) sur un support de cornue et place à l&#39;intérieur d&#39;un grand récipient en polystyrène, avec un bloc de refroidissement placé en dessous du tube au niveau de la base du support de cornue. </li></ol> 2. Préparation de la protéine native extraits pour IRI Analyse <ol><li> Pour induire l&#39;expression de IBP dans les herbes de congélation à tolérance ou d&#39;autres espèces de plantes tolérantes au gel, les plantes de s&#39;acclimater à froid pendant 1 semaine à 4 ° C, dans des conditions de faible éclairage (6 h de lumière / 18 h d&#39;obscurité). Cela ne concerne pas les échantillons prélevés sur le terrain qui ont déjà été exposés à des conditions de basse température et des périodes d&#39;acclimatation. </li><li> Obtenir environ 0,1 g de tissu de feuille en coupant à la base de la tige et placer dans un tube de 1,5 mL. clignote immédiatement congeler l&#39;échantillon dans l&#39;azote liquide et stocker à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour lyser les cellules, broyer l&#39;échantillon de tissu en une poudre fine en utilisant un mortier et un pilon sous azote liquide. Assurez-vous que l&#39;azote liquide ne s&#39;évapore pas pendant le processus d&#39;homogénéisation. </li><li> Immédiatement placer des échantillons de sol sur de la glace et de permettre à l&#39;azote liquide à évaporer complètement. Ajouter 1 ml d&#39;une protéine native de extractile tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, NaCl 25 mM (pH 7,5), avec deux comprimés d&#39;inhibiteur de protease exempt d&#39;EDTA a été ajoutée immédiatement avant utilisation. Pipette à mélanger; ne pas vortexer. REMARQUE: Des additifs supplémentaires peuvent devoir être utilisés si le lysat contient des métabolites secondaires (voir la discussion). </li><li> Agiter doucement pendant une nuit échantillons (18-24 h) à 4 ° C. Effectuer les étapes suivantes à 4 ° C. </li><li> Retirer les débris cellulaires par centrifugation des échantillons à ~ 16 000 g pendant 5 min. Maintenir la fraction soluble et centrifuger pendant 5 min de plus si les débris cellulaires persiste. échantillons éclaircis peuvent être conservés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Splat dosage pré-montage expérimental <ol><li> Verser 100 ml d&#39;hexane dans la chambre externe mis en place avec le film polarisé et ajouter 5-6 perles de dessiccation pour empêcher l&#39;accumulation d&#39;humidité sur les diapositives. Ajouter une petite quantité de graisse à vide à la plaque de recouvrement du bain et de le tordre pour assurer un joint étanche et d&#39;empêcher l&#39;évaporation de l&#39;hexane. </li&gt; <li> On refroidit le bain d&#39;hexane entre -4 ° C et -6 ° C en utilisant un bain d&#39;eau programmable environ 2-3 h avant de commencer l&#39;expérience. Assurez-vous de vérifier la température de l&#39;hexane avec un thermomètre avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Placer le bloc de refroidissement dans une boîte de polystyrène directement en dessous du tube en matière plastique et recouvrir complètement avec de la glace sèche, 40 min avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Avant de commencer l&#39;essai, assurez-vous que le tube soit de niveau. Pour déterminer où le bloc de refroidissement de l&#39;échantillon baissera, premier test de la procédure avec de l&#39;eau et indiquer où l&#39;échantillon tombe avec un marqueur (comme décrit ci-dessous). </li><li> Retirer la glace sèche de la partie supérieure du bloc froid et placer un couvercle microscope en verre coulissant sur la marque de baisse qui a été déterminée avec de l&#39;eau. </li><li> Immédiatement avant le dosage de départ, allumer la source de lumière et gratter la glace qui est formé sur le fond de la chambre de verre. Evitez de garder la source de lumière à moins que des cristaux de glacesont visualisées pour empêcher le chauffage de l&#39;hexane. </li></ol> 4. Effectuer le test Splat <ol><li> Tremper l&#39;embout jetable fixé à une pipette automatique (1-20 ul) dans de l&#39;huile d&#39;immersion, en utilisant une serviette en papier enlever tout excès d&#39;huile. Cette étape permettra à l&#39;échantillon à l&#39;automne plutôt que d&#39;adhérer à l&#39;extérieur de la pipette. REMARQUE: Enlever l&#39;huile en excès de la pipette est essentielle pour faire en sorte que des gouttelettes d&#39;huile ne forment pas sur les cristaux de glace, ce qui rend la visualisation difficile. </li><li> Pipeter 10 uL de l&#39;échantillon et de la pipette lieu directement au-dessus des tubes en plastique avant de libérer l&#39;échantillon. Un son « Splat » distincte doit être entendu lorsque l&#39;échantillon touche la lamelle de verre, créant ainsi une monocouche de cristaux de glace. </li><li> Enlever rapidement et soigneusement la lame de microscope à partir du bloc à froid en utilisant des pinces et les placer dans le bain d&#39;hexane sur le dessus du film polarisant. </li><li> Regarder sous le microscope, mettre la lame de microscope dans le champ de vision et annoncejuste l&#39;objectif de sorte que la polarisation croisée permet de visualiser des cristaux de glace de contraste élevé. Régler le grossissement de 40x. </li><li> Fixez l&#39;appareil photo au microscope et régler les paramètres de « macro » pour permettre la visualisation claire des cristaux de glace et de capturer l&#39;image. NOTE: En attente jusqu&#39;à 1 h pour permettre des cristaux de glace se développer peut donner une image plus claire. </li><li> Répétez les étapes pour 04.01 à 04.05 tous les échantillons. Typiquement, placer jusqu&#39;à 6 coulisse avec un autre échantillon dans la chambre d&#39;hexane. </li><li> Éteindre la source de lumière et placer une plaque en matière plastique sur le bain d&#39;hexane, assurant un joint étanche. Permettre aux cristaux de glace à hybrider pendant une nuit (12-24 h, en maintenant une période de recuit conforme dans un essai particulier). Après l&#39;incubation, de capturer des images des films de glace comme décrit ci-dessus. NOTE: Certains échantillons peuvent recristalliser plus rapidement que d&#39;autres. Si aucune recristallisation est apparente après 12 h, permettre aux cristaux de recuire jusqu&#39;à 24 h pour veiller à ce qu&#39;aucun recrystallisation se produira. </li></ol> 5. Splat Essai d&#39;analyse des données <ol><li> Téléchargez les photos sur un ordinateur et comparer directement la taille des cristaux de glace avant et après recuit. Les échantillons ayant une activité de recristallisation de la glace ne se développera pas, tandis que les échantillons sans aucune activité IRI recristalliser la formation de cristaux de glace beaucoup plus grands. interférence de la lumière fera de grands cristaux de glace apparaissent dans des teintes légèrement différentes et sont donc faciles à voir. </li></ol> 6. Ice affinité Configuration Matériel de purification <ol><li> Remplir un bain à circulation d&#39;eau à température programmable avec l&#39;éthylène glycol. l&#39;éthylène glycol automobile vert peut être utilisé. </li><li> Connecter le bain à une sonde creuse, de laiton en utilisant un tube en matière isolante 15. </li><li> Construction d&#39;un récipient en polystyrène, dans lequel un bécher de 150 ml peut adapter snuggly. Créer un couvercle pour le récipient avec un trou au centre pour le laiton doigt froid. </li></ol> 7.Préparation des échantillons pour la purification Ice-affinité <ol><li> tissu végétal froid s&#39;acclimater comme décrit dans la section 2.1. </li><li> Recueillir ~ 100-150 g de la biomasse aérienne (étape 2.3) dans des tubes de 20 ml et immédiatement congeler clignoter. Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C avant utilisation. </li><li> Préparer l&#39;échantillon comme décrit dans les sections 2.3-2.5. Utilisez un rapport 1: 1 (mg de tissu: mL de tampon d&#39;extraction de la protéine native) pour la remise en suspension du tissu foliaire. Utilisation des comprimés d&#39;inhibiteur de protease supplémentaires pour éviter la dégradation de l&#39;IBP par des proteases endogènes. REMARQUE: si l&#39;échantillon de tissu est trop concentré, ajuster le rapport de 1: 2 ou 1: 3 (mg de tissu: mL de tampon d&#39;extraction de la protéine native). </li><li> Pour éliminer les débris cellulaires, du lysat tamis à travers 2 couches de gaze, 3 fois. Sédimenter les débris par centrifugation à 30 000 xg pendant 40 min à 4 ° C. </li><li> Augmenter le volume de l&#39;échantillon à 120 ml en utilisant un tampon d&#39;extraction de la protéine native. Utiliser immédiatement le lysat pour la purification par affinité de la glaceéviter toute perte d&#39;activité de liaison de la glace. </li></ol> 8. La conduite Purification Ice-affinité <ol><li> Avant purification, mettre le bain d&#39;eau pour refroidir programmable de -0,5 ° C à -3 ° C à une vitesse de -0,04 ° C / h. NOTE: La vitesse de refroidissement peut être ajustée en fonction du volume initial de l&#39;échantillon. </li><li> On refroidit le doigt de glace à -0,5 ° C et immerger ensuite dans un tube de 50 ml contenant de l&#39;eau distillée froide. Ajouter quelques morceaux de glace pour faciliter la nucléation de la glace et laisser une mince couche de glace se forme sur le doigt. Ce processus prend généralement entre 20 et 30 min. REMARQUE: Tous les morceaux sur le doigt enduit glace doivent être lissées avec une main gantée avant de placer dans l&#39;échantillon. Si une couche de glace ne se forme pas à -0,5 ° C, abaisser la température de -0,75 ° C. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans un bêcher en verre de 150 ml contenant un petit barreau d&#39;agitation magnétique dans un récipient en polystyrène au-dessus de l&#39;agitateur magnétique. Assurez-vous que le doigt de glacecentré et réduit au moins à moitié dans l&#39;échantillon liquide. Sceller le récipient. </li><li> Autoriser le programme à fonctionner pendant environ deux jours, vérifier toutes les 24 h. Une fois que 50% de l&#39;échantillon est gelé, arrêtez le programme. L&#39;incorporation de IBP dans l&#39;hémisphère de glace se traduira par « la glace de gravure ». REMARQUE: les expériences de purification peuvent être effectuées en utilisant des échantillons plus volumineux avec la durée au cours de laquelle le programme se exécute ajustés en conséquence. </li><li> Afin d&#39;éliminer l&#39;hémisphère de glace, réchauffer la sonde à 4 ° C, rincer l&#39;hémisphère avec de l&#39;eau distillée pour éliminer la protéine non liée, puis décongeler à 4 ° C. REMARQUE: La plupart IBP ne sont pas stables dans l&#39; eau et un tampon approprié ( par exemple Tris-HCl 50 mM, pH 8 ou 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium, pH 8) doit être ajoutée périodiquement au cours du processus de décongélation (approximativement 1 mL / 2 h) . hémisphères de glace peuvent être enveloppés dans une feuille d&#39;aluminium et conservés à -20 ° C avant la décongélation. </li><li> Si l&#39;hémisphère de glace contiennent encores pigment, ou pour augmenter la purification de l&#39;échantillon, répéter les étapes 2-3 8,1-8,5 fois. NOTE: Bien que la concentration IBP peut être inférieure à la suite de plusieurs cycles de purification, la pureté est plus précieux que le rendement si les échantillons purifiés seront analysés à l&#39;aide de MS. Si le matériel disponible est suffisante, trois cycles de purification de la glace affinité est recommandée. </li></ol> 9. Identification des IBP <ol><li> Depuis IBP sont contenus dans un grand volume après la décongélation de l&#39;hémisphère de glace, concentrer les échantillons. échantillons concentré contenant ~ 100 g de tissu de ~ 1-3 ml en utilisant des tubes centrifuges de concentration avec un poids moléculaire de 3000 Da coupure pour éviter la perte de petites protéines. </li><li> Avant d&#39;envoyer des échantillons de sclérose en plaques, déterminer la concentration de protéine en utilisant un essai de quantification de protéine tel qu&#39;un BCA ou le dosage de Bradford. Estimer la pureté des échantillons par électrophorèse sur gel tels que le SDS-PAGE. Testez les protéines purifiées pour l&#39;activité IRI avant sePour MS pour s&#39;assurer que la protéine active a été conservée par les étapes de purification et de concentration. </li><li> Utiliser des échantillons concentrés directement pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse 10 . </li></ol>

<ol><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-stable+antifreeze+protein+from+grass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256(2000).</li>
<li>Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+and+ice+nucleator+proteins+in+terrestrial+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods.</a> Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).</li>
<li>Davies, P. L., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+fish+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of fish antifreeze proteins.</a> FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+L%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).</li>
<li>Yeh, Y., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins%3A+structures+and+mechanisms+of+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function.</a> Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).</li>
<li>Smolin, N., Daggett, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+ice-like+water+structure+on+the+surface+of+an+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein.</a> J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).</li>
<li>Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine-rich+antifreeze+proteins+from+snow+fleas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas.</a> Science. 310 (5747), 461(2005).</li>
<li>Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+proteins+in+the+Antarctic+springtail%2C+Gressittacantha+terranova%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%22%5BJournal%5D)">Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova.</a> J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).</li>
<li>Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+expand+the+repertoire+of+protein+structures+that+bind+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).</li>
<li>Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+a+Bacterial+Antifreeze+Protein+as+an+Adhesin+with+Ice-Binding+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity.</a> PLoS One. 7 (11), e48805(2012).</li>
<li>Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+antifreeze+protein+in+a+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hyperactive antifreeze protein in a fish.</a> Nature. 429 (6988), 153(2004).</li>
<li>Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+antifreeze+activity+of+carrot+antifreeze+protein+and+its+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants.</a> Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).</li>
<li>Gupta, R., Dreswal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+stress+modulated+secretome+analysis+and+purification+of+antifreeze+protein+from+Hippophae+rhamnoides%2C+a+Himalayan+wonder+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant.</a> Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).</li>
<li>Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antifreeze+proteins+by+adsorption+to+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biphys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice.</a> Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).</li>
<li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ice-binding+proteins+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants.</a> Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).</li>
<li>Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-binding+proteins+confer+freezing+tolerance+in+transgenic+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.</a> Plant Biotechnol. J. , (2016).</li>
<li>Olijve, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+rapid+ice+crystal+growth+through+nonbasal+plane+adsorption+of+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).</li>
<li>Zakharov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+Recrystallization+in+a+Solution+of+a+Cryoprotector+and+Its+inhibition+by+a+Protein%3A+Synchrotron+X-Ray+Diffraction+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study.</a> J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).</li>
<li>Capicciotti, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+ice+recrystallization+inhibitors+enable+freezing+of+human+red+blood+cells+with+reduced+glycerol+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations.</a> Sci. Rep. 5, 9692(2015).</li>
<li>Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal+surface+planes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li>
<li>Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiourea%3A+the+antioxidant+of+choice+for+the+purification+of+proteins+from+phenol+rich+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues.</a> Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).</li>
<li>Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-shell+purification+of+ice-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice-shell purification of ice-binding proteins.</a> Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).</li>
<li>Basu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+ice-binding+planes+of+antifreeze+proteins+by+fluorescence-based+ice+plane+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity.</a> J. Vis. Exp. (83), e51185(2014).</li>
<li>Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+a+cold+stress+associated+gene+family+in+cold+tolerant+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses.</a> BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).</li>
<li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Pour l&#39;analyse réussie et la purification de IBP, il est important de comprendre la nature sensible à la température de certaines de ces protéines. Certaines plantes IBP instable à des températures supérieures à 0 ° C, ce qui se déroule, les précipitations et l&#39;inactivité. Afin d&#39;obtenir IBP actifs, il est souvent indispensable que les plantes sont traitées dans une chambre froide (~ 4 ° C) et les échantillons sont maintenus sur de la glace pendant l&#39;expérimentation. Un autre facteur à considérer lors de...

Des protéines de liaison glace (IBP) sont une famille diversifiée de protéines protectrices qui ont été découvertes dans un certain nombre d&#39;organismes , y compris les plantes, les insectes 1 2 3, les poissons et les microbes 4. La principale caractéristique de ces protéines est leur capacité unique à adsorber spécifiquement et efficacement aux cristaux de glace, modifiant leur croissance. IBP possède plusieurs propriétés documentées, avec les deux plus bien caractérisés étant hystérésis thermique (TH) et l&#39;inhibition de la recristallisation de la glace (IRI). l&#39;activité TH est plus facilement observée dans IBP chez les animaux de gel intolérants. Cette activité se traduit par abaissement du point de congélation des fluides circulatoires ou interstitiel organismes pour éviter le gel. En revanche, dans les organismes de gel tolérant, qui inévitablement geler à des températures inférieures à zéro, IBP semblent avoir une activité faible TH. En dépit de la faible activité TH, une forte activité IRI pour limiter le cri de la glacela croissance Stal est souvent observée avec ces protéines. Pour l&#39;organisme tolérant le gel, cette activité IRI permet vraisemblablement de protéger les cellules de la croissance incontrôlée de la glace dans les compartiments extracellulaires. Le modèle « bouton de matelas » peut être utilisé pour décrire le mécanisme par lequel IBP prévenir la croissance des cristaux de glace 5. Selon ce modèle, IBP adsorber spécifiquement à la surface des cristaux de glace à des intervalles, de telle sorte que les molécules d&#39;eau ne peuvent incorporer avec le réseau cristallin de la glace de plus en plus dans l&#39;espace entre IBP lié. Cela crée une courbure qui rend l&#39;incorporation de molécules d&#39;eau supplémentaires défavorables, un événement qui peut être décrit par l&#39;effet Gibbs-Thomson 6. L&#39;hypothèse ancrée de l&#39;eau de clathrate fournit un mécanisme pour la liaison spécifique de IBP à la surface des cristaux de glace de sorte que la présence de résidus chargés, en particulier placés sur le site de liaison de protéine de la glace, les résultats dans le reorganism des molécules d&#39;eau afin qu&#39;ils correspondent à un ou plusieurs plans du réseau cristallin de la glace 7. activité TH peut être quantifiée en mesurant la différence entre les températures de fusion et de congélation d&#39;un seul cristal de glace en présence d&#39;un IBP. Bien que l&#39;activité TH est une méthode d&#39;évaluation de l&#39;activité de IBP, le faible écart de TH largement acceptée produite par l&#39;usine IBP (typiquement seulement une fraction d&#39;un degré) exige normalement une concentration élevée en protéines, un équipement spécialisé et de l&#39;expérience de l&#39;opérateur. Bien que non-IBP peut limiter la croissance des cristaux de glace, il est une propriété partagée par tous IBP et tester ainsi l&#39;activité IRI est un écran initial efficace pour la présence de IBP, en particulier pour ceux qui ont une faible activité TH. La méthode utilisée pour tester cette activité est connu comme un « essai de floc », par lequel un échantillon de protéine est éclair congelée pour produire une monocouche de petits cristaux de glace, qui sont observées sur une période de temps pour déterminer sila croissance des cristaux de glace est limité. Contrairement à d&#39;autres méthodes utilisées pour cribler un échantillon de tissu source pour la présence d&#39;IBP, cette technique est applicable à de faibles concentrations de protéines dans l&#39;intervalle de 10 à 100 ng, utilise un équipement facilement fabriqué, et génère des données qui sont rapidement et facilement interprétée. Cependant, il est important de souligner que cette analyse fournit un écran initial pour IBP qui devrait être suivi par la détermination de la TH et mise en forme de cristaux de glace. L&#39;isolement des protéines natives est difficile, ce qui nécessite souvent des informations sur les propriétés structurales et biochimiques d&#39;une protéine d&#39;intérêt. L&#39;affinité des IBP pour la glace permet l&#39;isolement de ces protéines en utilisant de la glace en tant que substrat à des fins de purification. Etant donné que la majorité des molécules sont poussés en avant de la limite de l&#39;eau glacée pendant la croissance des cristaux de glace, la croissance lente d&#39;une hémisphère de la glace en présence d&#39;un échantillon des résultats d&#39;IBP dans un échantillon hautement purifié, exempt de grande quantits de protéines contaminantes et des solutés. Cette méthode a été utilisée pour identifier des insectes IBP 8, 9, 10, 11 les bactéries, les poissons et les plantes 12 13, 14. En outre, les fractions enrichies en IBP obtenus par ce procédé peuvent également être utilisés pour l&#39;analyse biochimique en aval. Le présent document décrit l&#39;identification de IBP dans les plantes par l&#39;induction et l&#39;extraction de IBP, l&#39;analyse de l&#39;activité IRI pour confirmer la présence de protéines, et l&#39;isolement des protéines en utilisant une purification par affinité de la glace.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL microcentrifugetubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Prise de laboratoire réglable</td><td>Fisher</td><td>S63080</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse</td><td>Desaga MC2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonde en laiton</td><td>Fabrication</td><td></td><td></td>sur mesure</tr><tr><td>Caméra/port de caméra</td><td>Canon</td><td></td><td>Canon Power Shot SX110 Caméra numérique ; port</td></tr> <tr><td>de microscope sur mesureÉtamine</td><td>Purewipe/Fisher Scientific</td><td>06-665-25A</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de concentration (0,5 mL)</td><td>Tubes de concentration EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Tubes</td> coniques <td>UFC900308</td> Thermo Fisher AM12502 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>13259</td><td>Utiliser un bloc</td></tr> <tr><td>chauffant en métalDéshumidificateur</td><td>Whirlpool</td><td></td><td>50 pinte Déshumidificateur Energy Star ; acheter auprès du fournisseur local</td></tr><tr><td>Dessciation beads</td><td>t.h.e. Dessicant/VWR</td><td>EM-DX0017-2</td><td>6-8 taille de maille ; 100 % indiquant</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bol en verre à double paroi</td><td>Générique</td><td></td><td>Acheter auprès du fournisseur local de verrerie de laboratoire</td></tr><tr><td>Glace sèche</td><td>Générique</td><td></td><td>Utiliser un fournisseur local ; dangereux&nbsp ;</td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de l’EDTA-protéase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Roche cOmplete mini</td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Générique</td><td></td><td>Green automotive ethylene glycol peut être acheté dans n’importe quelle quincaillerie locale (i.e. Home Depot)</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090</td><td>Anhydre, 95 %; dangereux</td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56822</td><td></td></tr><tr><td>JA10/20 centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grande boîte de Pétri en plastique</td><td>Générique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Générique</td><td></td><td>Utiliser le fournisseur local ; dangereux&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque d’agitation magnétique</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI190M</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture de microscope</td><td>Fisher</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Tube en plastique</td><td>Générique</td><td></td><td>Acheter un tuyau en PVC dans une quincaillerie locale</td></tr><tr><td>Film polarisé</td><td>Edmund Optics</td><td>43-781</td><td></td></tr><tr><td>Mousse de polystyrène</td><td>Générique</td><td></td><td>Peut être construit à partir de boîtes d’expédition en polystyrène</td></tr><tr><td>Mortier et pilon Poreclain</td><td>Fisher</td><td>FB961</td><td></td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77627</td><td>110 &micro ; m granulométrie</td></tr> Support <tr><td>d’autoclave</td><td>Fisher</td><td>12-000</td><td></td></tr><tr><td>Petite barre d’agitation</td><td>Fisher</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie programmable en fonction de la température</td><td>VWR</td><td>13271-118</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide</td><td>Dow Corning/Sigma Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Tube en vinyle</td><td>Générique</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification des protéines végétales se liant à glace par l&#39;évaluation de l&#39;inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification ice-affinité

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

protéines se liant à glace (IBP) appartiennent à une famille de protéines de stress induit qui sont synthétisés par certains organismes exposés à des températures inférieures à zéro. Chez les plantes, les dommages se produit lorsque le gel des cristaux de glace extracellulaire se développent, entraînant la rupture des membranes plasmiques et la mort cellulaire possible. Adsorption de IBP à des cristaux de glace limite la croissance par un procédé connu sous le nom d&#39;inhibition de la glace recristallisation (IRI), réduisant ainsi les dommages cellulaires. IBP démontrent également la capacité d&#39;abaisser le point de congélation d&#39;une solution en dessous du point de fusion d&#39;équilibre, une propriété connue sous le nom de l&#39;activité hystérésis thermique (TH). Ces propriétés protectrices ont suscité un intérêt dans l&#39;identification de nouveaux IBP en raison de leur utilisation potentielle dans des applications industrielles, médicales et agricoles. Ce document décrit l&#39;identification de la plante IBP par 1) l&#39;induction et l&#39;extraction de IBP dans le tissu végétal, 2) le criblage d&#39;extraits pour l&#39;activité IRI, et 3) l&#39;isolement et la purification de IBP. Suite à l&#39;induction de l&#39;IBP par exposition à basse température, les extraits sont testés pour l&#39;activité IRI en utilisant un « test de splat », qui permet l&#39;observation de la croissance des cristaux de glace à l&#39;aide d&#39;un microscope optique standard. Ce test nécessite une faible concentration en protéine et génère des résultats qui sont obtenus rapidement et facilement interprétables, en fournissant un écran initial de l&#39;activité de liaison de la glace. IBP peut ensuite être isolé à partir de protéines contaminantes en utilisant la propriété de IBP pour adsorber à la glace, par une technique appelée «purification par affinité de la glace. L&#39;utilisation lysats de cellules recueillies à partir d&#39;extraits de plantes, un hémisphère de glace peut être cultivé lentement sur une sonde en laiton. Celui-ci incorpore IBP dans la structure cristalline de la glace polycristallin. Ne nécessitant aucune connaissance biochimique ou structurelle a priori de l&#39;IBP, ce procédé permet la récupération de la protéine active. fractions protéiques de glace purifiés peuvent être utilisés pour des applications en aval, y compris l&#39;identification des pepséquences de marées par spectrométrie de masse et l&#39;analyse biochimique des protéines natives.

Pour faciliter l&#39;installation, la figure 1 et Figure 2 sont inclus comme des représentations visuelles de l&#39;équipement utilisé pour l&#39; analyse et la purification IRI glace-affinité, respectivement. Résultats de l&#39; analyse IRI en utilisant des extraits recueillis à partir des mauvaises herbes de moutarde avec et sans IBP sont représentés sur la figure 3. Ces résulta...

Le présent document décrit l&#39;identification des protéines de liaison à la glace à partir de plantes tolérantes au gel grâce à l&#39;évaluation de l&#39;activité d&#39;inhibition de la recristallisation de la glace et l&#39;isolement subséquent de IBP natives en utilisant une purification par affinité de la glace.

Identification des protéines végétales se liant à glace par l&#39;évaluation de l&#39;inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

L'objectif général de ce protocole est d'identifier de nouvelles protéines liant la glace, ou IBPs, provenant de plantes, en testant leur activité de liaison à la glace et en isolant des peptides natifs par purification d'affinité à la glace. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la tolérance au gel des plantes, notamment concernant les protéines liant la glace. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'isoler des protéines liant la glace à partir d'extraits natifs sans recourir à des méthodes de purification complexes.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la configuration du dispositif peut être difficile à conceptualiser. Commencez ce protocole par la mise en place de l'appareil de projection, comme décrit dans le protocole écrit. Pour induire l'expression des protéines liant la glace, ou IBPs, chez les graminées tolérantes au gel ou d'autres espèces végétales tolérantes au gel, acclimatez les plantes au froid pendant une semaine maximum à quatre degrés Celsius dans des conditions de faible luminosité.Prélevez environ 0,1 gramme de tissu foliaire en coupant à la base de la tige, puis placez-le dan

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Ici, nous décrivons une nouvelle technique quantitative en protéomique pour identifier les complexes protéiques chez Saccharomyces cerevisiae. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode SILAC avec purification par affinité suivie par spectrométrie de masse en tandem afin d'identifier avec une grande spécificité les partenaires de liaison d'une protéine ER, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Protéines de liaison de glace (IBP), également appelées protéines antigel, inhiber la croissance de la glace et sont un additif prometteur pour une utilisation dans la cryoconservation des tissus. Le principal outil utilisé pour étudier IBP est le osmomètre nanolitre. Nous avons développé une maison conçue étape de refroidissement monté sur un microscope optique et contrôlé à l'aide d'une routine sur mesure LabVIEW. L'osmomètre nanolitre décrit ici manipulé la température de l'échantillon d'une...

LabVIEW fonctionnant Osmomètre nanolitre Novel des enquêtes de glace Binding Protein

Nous décrivons ici un protocole pour la purification et la caractérisation de complexes de protéines végétales. Nous démontrons que par immunoprécipitation une seule protéine dans un complexe, afin que nous puissions identifier ses modifications post-traductionnelles et ses partenaires d'interaction.

Identification des modifications post-traductionnelles des protéines végétales Complexes

Les protéines antigel (AFPs) se lient à des plans de glace spécifiques pour prévenir ou ralentir la croissance de la glace. L’analyse d’affinité du plan de glace (APIE) basée sur la fluorescence est une modification de la méthode originale de gravure sur glace pour la détermination des plans de glace liés à l’AFP. Les ADP sont marqués par fluorescence, incorporés dans des cristaux de glace simples macroscopiques et visualisés sous la lumière UV.

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

Ce protocole combine la caractérisation d’un échantillon de protéines par électrophorèse capillaire et une projection de liaison rapide avec les ligands chargés par électrophorèse capillaire en affinité. Il est recommandé pour les protéines avec une structure souple, comme les protéines intrinsèquement désordonnées, afin de déterminer les différences dans la liaison des différents conformères.

Analyse de AtHIRD11 désordre intrinsèque et la liaison vers les Ions métalliques par électrophorèse capillaire et l’électrophorèse capillaire affinité

Nous présentons des approches pour la caractérisation biophysique et structurelle des glycoprotéines avec le pli de l’immunoglobuline par interférométrie biolayer, calorimétrie isotherme de titration et cristallographie aux rayons x.

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Nous présentons un protocole pour la détection optique en temps réel des protéines sans étiquette simples car elles sont sécrétées par les cellules vivantes. Celle-ci repose sur la microscopie interférométrique diffusion (iSCAT), qui peut être appliquée à une variété de configurations et différents systèmes biologiques.

Label-Free Imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iSCAT microscopie

Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.

Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines

Cet article présente une méthode pour générer des cristaux protéiques dérivés de l’I3C (acide 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) utilisant le microsédage pour générer de nouvelles conditions de cristallisation dans des écrans matriciels clairsemés. Les plateaux peuvent être mis en place à l’aide de robots de distribution liquide ou à la main.

Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour réaliser l’expérience de marquage de proximité (PL) chez le concombre (Cucumis sativus L.) en utilisant la protéine AT4G18020 (APRR2)-AirID comme modèle. La méthode décrit la construction d’un vecteur, la transformation d’une construction par agroinfiltration, l’infiltration de biotine, l’extraction de protéines et la purification de protéines marquées à la biotine par une technique de purification par affinité.

Marquage de proximité basé sur AirID pour l’interaction protéine-protéine chez les plantes

Découvrez l'identification des protéines végétales se liant à glace par évaluation de l'inhibition de recristallisation et isolement par purification ice-affinité. Cette méthode simplifiée permet d'isoler ces protéines sans techniques complexes.

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