Identification des protéines végétales se liant à glace par l'évaluation de l'inhibition de recristallisation de glace et isolement utilisant purification Ice-affinité

L’objectif global de ce protocole est d’identifier de nouvelles protéines de liaison à la glace ou IBP à partir de plantes en testant l’activité de liaison à la glace et en isolant les peptides natifs à l’aide de la purification par affinité avec la glace. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la tolérance au gel des plantes, en particulier les protéines de liaison à la glace. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous permet d’isoler les protéines de liaison à la glace à partir d’extraits natifs sans avoir recours à des méthodes de purification compliquées.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la configuration de l’appareil peut être difficile à conceptualiser. Commencez ce protocole par la configuration de l’appareil splat comme décrit dans le protocole texte. Pour induire l’expression de protéines de liaison à la glace, ou IBP, dans les graminées tolérantes au gel ou d’autres espèces végétales tolérantes au gel, les plantes s’acclimatent au froid jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius dans des conditions de faible luminosité.

Obtenez environ 0,1 gramme de tissu foliaire en coupant à la base de la tige puis en le plaçant dans un tube de 1,5 millilitre. Congelez immédiatement l’échantillon dans de l’azote liquide et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé. Pour lyser les cellules, broyez l’échantillon de tissu en une poudre fine à l’aide d’un mortier et d’un pilon sous azote liquide.

Assurez-vous que l’azote liquide ne s’évapore pas pendant le processus d’homogénéisation. Placez immédiatement les échantillons de sol sur de la glace et laissez l’azote liquide s’évaporer complètement. Ajoutez ensuite un millilitre d’un tampon d’extraction de protéines natives et pipetez pour mélanger.

Agitez doucement les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius et effectuez les autres étapes à la même température. Le lendemain, éliminez les débris cellulaires en centrifugeant les échantillons à environ 1 600 fois G pendant cinq minutes. Conservez la fraction soluble et centrifugez pendant cinq minutes supplémentaires si les débris cellulaires persistent.

Les échantillons clarifiés peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur utilisation. Versez 100 millilitres d’hexane dans la chambre externe configurée avec le film polarisé et ajoutez cinq à six billes de dessiccation pour éviter l’accumulation d’humidité sur les lames. Ajoutez ensuite une petite quantité de graisse sous vide dans la plaque recouvrant le bain et tournez-la pour assurer une étanchéité et empêcher l’évaporation de l’hexane.

40 minutes avant de commencer l’expérience, placez le bloc de refroidissement dans une boîte en polystyrène directement sous le tube en plastique et couvrez-le complètement de glace sèche. Avant de commencer le test, assurez-vous que le tube est de niveau. Retirez ensuite la glace carbonique du haut du bloc froid.

Tout d’abord, testez cette procédure avec de l’eau pour déterminer où l’échantillon tombera sur le bloc de refroidissement. Trempez l’embout jetable fixé à une pipette automatique dans de l’huile d’immersion, ce qui permettra à l’échantillon de tomber plutôt que d’adhérer à l’extérieur de la pipette. Utilisez une serviette en papier pour enlever tout excès d’huile.

Aspirez ensuite 10 microlitres d’eau. Placez la pipette directement sur le tube en plastique avant de libérer l’eau. Un bruit d’éclaboussure distinct devrait être entendu lorsque l’eau frappe le bloc de refroidissement, créant une monocouche de cristaux de glace.

Ensuite, placez une lame de couvercle de microscope en verre sur la marque de goutte qui a été déterminée avec de l’eau. Immédiatement avant de commencer le test, allumez la source de lumière et grattez la glace qui s’est formée au fond de la chambre en verre. Effectuez ensuite le test d’éclaboussures avec l’échantillon, comme cela a été fait pour l’eau, en libérant 10 microlitres de l’échantillon sur la lame de couverture en verre pour créer une monocouche de cristaux de glace.

Retirez rapidement et soigneusement la lame de microscope du bloc froid à l’aide d’une pince à épiler et placez-la dans le bain d’hexane sur le film polarisant. En regardant sous le microscope, placez la lame du microscope dans le champ de vision et ajustez la lentille de l’objectif de sorte que la polarisation croisée permette de visualiser des cristaux de glace à contraste élevé. Fixez l’appareil photo au microscope et ajustez les paramètres sur macro pour permettre une visualisation claire des cristaux de glace et capturer l’image.

Répétez ces étapes pour tous les échantillons. Placez généralement jusqu’à six lames avec un échantillon différent dans la chambre à hexane. Une fois terminé, éteignez la source de lumière.

Placez ensuite une plaque en plastique sur le bain d’hexane, en assurant une étanchéité parfaite, et laissez les cristaux de glace recuire pendant la nuit. Après l’incubation, capturez des images des films de glace comme auparavant. Après avoir acclimaté à froid les tissus végétaux comme précédemment, prélevez environ 100 à 150 grammes de biomasse broyée dans des tubes de 20 millilitres.

Congelez immédiatement les échantillons et conservez-les à moins 80 degrés Celsius avant de les utiliser. Préparez l’échantillon comme précédemment, en utilisant un rapport de un pour un pour la remise en suspension du tissu foliaire. Utilisez des comprimés inhibiteurs de protéase supplémentaires pour éviter la dégradation des IBP par les protéases endogènes.

Pour éliminer les débris cellulaires, tamisez le lysat à travers deux couches d’étamine trois fois. Granulez les débris par centrifugation à 30 000 fois G pendant 40 minutes à quatre degrés Celsius. Augmentez ensuite le volume de l’échantillon à 120 millilitres à l’aide d’un tampon d’extraction de protéines natives et utilisez immédiatement la lysade pour la purification de l’affinité glaciaire afin d’éviter toute perte d’activité de liaison de la glace.

Après avoir refroidi le doigt de glace à moins 0,5 degré Celsius, immergez-le ensuite dans un tube de 50 millilitres contenant de l’eau distillée froide. Ajoutez quelques éclats de glace pour faciliter la nucléation de la glace et laissez une fine couche de glace se former sur le doigt. Ce processus prend généralement entre 20 et 30 minutes.

Placez l’échantillon dans un bécher en verre de 150 millilitres contenant une petite barre d’agitation magnétique, qui est placée dans un récipient en polystyrène sur le dessus de l’agitateur magnétique. Assurez-vous que le doigt de glace est centré et abaissé au moins à mi-chemin dans l’échantillon liquide. Fermez ensuite le récipient.

Laissez le programme s’exécuter pendant environ deux jours, en vérifiant toutes les 24 heures. Une fois que 50 % de l’échantillon est congelé, arrêtez le programme. L’incorporation d’IBP dans l’hémisphère glaciaire entraînera une gravure sur glace.

Pour enlever l’hémisphère de glace, réchauffez la sonde à quatre degrés Celsius. Ensuite, rincez l’hémisphère avec de l’eau distillée pour éliminer les protéines non liées et décongelez à quatre degrés Celsius. Si l’hémisphère de glace contient encore du pigment, ou pour augmenter la purification de l’échantillon, répétez les étapes de purification deux à trois fois.

On voit ici des extraits prélevés à partir d’un témoin tampon dépourvu d’IBP et des extraits d’Arabidopsis thaliana de type sauvage qui n’en contiennent pas. Après 18 heures, le contrôle tampon et les extraits d’A.thaliana sont incapables de limiter la croissance des cristaux de glace. En revanche, les petits cristaux de glace observés avec les extraits d’A. thaliana transgénique exprimant des IBP de Lolium perenne acclimaté au froid limitent considérablement la croissance des cristaux de glace.

Après le premier cycle de purification, le degré élevé de gravure de la glace à la surface de l’hémisphère indique que les IBP se sont adsorbés sur la glace et ont modifié la croissance des cristaux de glace. Pour éliminer les solutés, les pigments et les protéines contaminantes supplémentaires, un deuxième cycle d’affinité pour la glace a été utilisé, ce qui a permis d’obtenir un hémisphère de glace plus clair. À la suite de cette procédure, la mise en forme de la glace et l’hystérésis thermique peuvent être évaluées à l’aide d’un osmomètre de nanolitres afin de caractériser davantage les protéines de liaison à la glace.

De plus, des fractions isolées peuvent être envoyées pour la spectométrie de masse afin d’identifier les séquences peptidiques.