Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l'embryon de souris par cytométrie de flux

L'objectif général de cette expérience est de caractériser les progéniteurs hématopoïétiques du sac vitellin et leurs descendants in vivo à l'aide d'un système de cartographie du destin induit par le tamoxifène chez la souris et de la cytométrie en flux. Cette approche peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie concernant le développement et la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques distincts des cellules souches hématopoïétiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de marquer les progéniteurs hématopoïétiques durant une fenêtre de temps limitée et de suivre leurs descendants, tels que les macrophages résidents, tout au long du développement et à l'âge adulte.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la quantité importante de cellules présentes dans le tissu embryonnaire et du grand volume des échantillons traités simultanément. Pour commencer l'expérience, transférez d'abord les cornes utérines de souris disséquées dans une boîte de Pétri de 10 millimètres remplie d'environ 30 millilitres de PBS glacé. Immédiatement après, saisissez les couches musculaires de l'utérus à l'extrémité cervicale de la corne et insérez délicatement une paire de ciseaux fins entre la couche musculaire et un tissu décidual pour libérer les embryons.

Ensuite, retirez à l’aide de fines pinces la membrane de Reichert et enlevez le placenta. Disséquez délicatement le sac vitellin et transférez-le dans une plaque de culture tissulaire 24-puits contenant 0,5 millilitre de solution de digestion. Après avoir sectionné les vaisseaux ombilicaux et vitellins, transférez immédiatement l’embryon dans une plaque de culture tissulaire 12-puits contenant 2 millilitres d’EDTA glacé à 10 millimolaire.

Après avoir retiré la tête de l'embryon à l'aide de ciseaux fins et pointus, incuber le corps et la tête sur de la glace pendant 10 à 15 minutes, puis retirer l'embryon et recueillir l'EDTA contenant le sang. Ensuite, retirer l'amnios entourant l'embryon. Puis, retirer les membres postérieurs et les membres étrangers de l'embryon.

À l’aide d’une pince fine, ouvrez le thorax. Ensuite, saisissez l’extrémité antérieure du cœur et tirez doucement sur le tissu tout en détachant les organes internes du corps à l’aide d’une deuxième pince. Au microscope stéréoscopique, séparez le foie fœtal du cœur et de l’intestin.

Et transférez l'organe dans une plaque de 24 puits remplie de 0,5 millilitre de la solution de digestion. La connexion anatomique avec le système cardiovasculaire est essentielle pour l'identification du foie fœtal. Le foie fœtal se trouve encore à ce stade de développement, et plus les embryons sont jeunes, plus la dissection peut être difficile.

Pour préparer des suspensions de cellules primaires, incuber les organes prélevés dans la solution de digestion à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Déposer le tissu dans la solution enzymatique sur un tamis de 10 micromètres placé au-dessus d'un puits d'une plaque de culture tissulaire à six puits contenant 1 millilitre de tampon FACS. Utiliser un piston en caoutchouc noir provenant d'une seringue de 2 millimètres pour dissocier le tissu en le broyant doucement afin d'obtenir une suspension de cellules uniques.

Ensuite, aspirez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez la suspension à 320 ×g à 4 °C pendant 7 minutes. Après la centrifugation, aspirez et jetez le surnageant.

Ensuite, préparez un tampon de blocage Fc frais et resuspendez le culot dans 60 microlitres. Puis, transférez 50 microlitres de la suspension monocellulaire dans un puits d'une plaque de 96 puits à fond rond. Incubez la plaque sur de la glace pendant au moins 15 minutes.

Ensuite, transférez les 10 microlitres restants de la suspension dans un tube FACS en polystyrène de 5 millilitres afin d'obtenir un échantillon composé de prélèvements provenant de différents tissus. Transférez 50 microlitres de ce mélange dans la plaque multipuits de 96 pour les témoins FMO de chaque fluorochrome. Pour procéder au marquage des antigènes de surface, utilisez un ensemble de six anticorps marqués avec des fluorochromes afin de préparer une solution d'anticorps et du tampon FACS.

Préparez ensuite six solutions d'anticorps et du tampon FACS utilisé pour la coloration de contrôle FMO. Ajoutez ensuite 50 microlitres des solutions d'anticorps aux échantillons dans la plaque multipuits 96. Mélangez les échantillons par pipetage doublé léger, puis incubez la plaque sur de la glace pendant 30 minutes.

Centrifuger la plaque multipuits 96 à 320 ×g à 4 degrés Celsius pendant 7 minutes et éliminer le surnageant. Laver les cellules avec 200 microlitres de tampon FACS et centrifuger à nouveau la plaque une fois supplémentaire. Une attention particulière doit être portée à l'élimination du surnageant par retournement de la plaque.

La plaque à 96 puits doit être retournée d'un seul mouvement sec du poignet afin d'éviter de détacher les cellules. Enfin, à l'aide d'un tamis de 70 micromètres, filtrer les échantillons de tissu et les échantillons témoins dans des tubes en polystyrène de 6 millimètres. L'analyse par cytométrie en flux peut désormais être réalisée.

Une population de cellules uniques cytotiques vivantes non érythrocytaires a été analysée pour l'expression du marqueur de précurseur kit et du marqueur de cellule hématopoïétique CD45. Au sein de la population ciblée, trois sous-populations cellulaires différentes ont été distinguées : KIT positif CD45 négatif, KIT positif CD45 faible et KIT négatif CD45 positif.

Parmi les progéniteurs positifs pour le kit du sac vitellin, les populations cellulaires CD45 négatives et CD45 faibles contenaient des cellules positives pour AA4.1 exprimant la protéine fluorescente jaune ou YFP, indiquant que les progéniteurs immatures positifs pour KIT expriment d'abord AA4.1 indépendamment de l'expression de CD45. Les cellules positives pour AA4.1 et positives pour YFP dans le foie et le cerveau n'ont été observées que dans la population de progéniteurs KIT positifs et CD45 faibles, et correspondent très probablement à des progéniteurs circulants issus des progéniteurs du sac vitellin. Les macrophages ont été trouvés dans la population CD45 positive et kit négative, et ont été identifiés comme des cellules F480 brillantes et CD11B positives.

Les macrophages du sac vitellin, du foie et du cerveau ont été efficacement marqués par une seule administration de 4-hydroxy tamoxifène, ce qui pourrait indiquer leur origine à partir des ENP. Une fois maîtrisée, la procédure d'isolement et de marquage des cellules peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de toujours conserver les échantillons sur de la glace dès qu'ils sont prélevés.

Les tampons FACS frais doivent être préparés quotidiennement et filtrés. En suivant cette procédure, d'autres souches rapporteuses de mosaïque ou de flux, telles que les lignées Rosa MTMG ou Rosa confetti, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur le potentiel d'indifférenciation et de phase proto des cellules marquées postérieurement.