Name: Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans lembryon de souris par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez la caractérisation des progéniteurs hématopoïétiques du sac vitellin et de leur descendance chez la souris par marquage du destin induit au tamoxifène et cytométrie de flux.

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Les auteurs remercient le professeur Frédéric Geissmann et le professeur Christian Schulz pour des discussions approfondies; Dr Hannah Garner pour la lecture critique du manuscrit, le Dr Xavier Montagutelli et le Dr Jean Jaubert et le personnel de l&#39;établissement animalier Institut Pasteur pour le soutien à l&#39;élevage de souris; Et Pascal Dardenne et Vytaute Boreikaite, un Amgen Scholar, pour leur assistance technique. La recherche dans le laboratoire EGP est financée par l&#39;Institut Pasteur, le CNRS, le Cercle FSER (FRM et un paquet de départ de l&#39;Institut Pasteur et le consortium REVIVE. LI est soutenu par une bourse de doctorat du consortium REVIVE.

Les procédures animales ont été effectuées conformément au comité institutionnel approuvé de soins et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Institut Pasteur (CETEA). 1. Dans l&#39; étiquetage du pouls Utero dans les embryons Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP <ol><li> Préparer la solution mère de 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM, 50 mg / mL). <ol><li> Sous la fumée, ouvrir le flacon de 25 mg de OH-TAM et ajouter 250 μL d&#39;éthanol (100%). </li><li> Transférer la solution OH-TAM à un tube de microcentrifugeuse de 2 mL avec une extrémité tronquée et un vortex à la vitesse maximale pendant 10 minutes. </li><li> Sonicate 30 min dans un bain sonicateur. </li><li> Ajouter 250 μL d&#39;huile de ricin PEG-35 sous l&#39;humidité pour obtenir une solution mère de 50 mg / ml. NOTE: L&#39;huile de ricin PEG-35 est un solvant avec des propriétés amphiphiles qui lient des molécules hydrophobes et les solubilise dans des solvants aqueux. </li><li> Vortex pendant environ 5 minutesÀ vitesse maximale et sonicate 30 min dans un bain sonicateur. </li><li> Aliquote de 90 μL (4,5 mg) par tube de microcentrifugeuse (1 aliquote par injection). </li><li> Conserver à 4 ° C pendant 1 semaine ou à -20 ° C à long terme comme décrit précédemment 13 . </li></ol></li><li> Préparer la solution mère de progestérone (10 mg / mL) <ol><li> Ajouter 250 μL d&#39;éthanol 100% à 25 mg de progestérone pour préparer une suspension de 10 mg / 100 μl sous l&#39;humidité. Vortex doucement. </li><li> Ajouter 2250 μL d&#39;huile de tournesol autoclavée pour préparer 10 mg / ml de solution de progestérone sous le capot. </li><li> Vortex pendant environ 5 min à la vitesse maximale, aliquote et conserver à 4 ° C. Notez que la solution est claire lorsqu&#39;elle est stockée. </li></ol></li><li> Administration du tamoxifène NOTE: Le développement embryonnaire a été estimé en fonction du jour de la formation de bouchons vaginaux en tant que jour embryonnaire (E) 0,5. La recombinaison est induite par injection unique à E8.5Chez les femelles Csf1r MeriCreMer enceintes 12 . Supplément OH-TAM avec 37,5 μg par g de Progestérone pour réduire les taux d&#39;avortement après l&#39;administration de tamoxifène. Injecter à 13 heures (pour le bouchon vaginal observé le matin). <ol><li> Le matin de l&#39;injection, soignez une portion aliquote de la solution OH-TAM pendant 10 minutes (ou jusqu&#39;à la remise en suspension complète). </li><li> Ajouter 360 μL de NaCl 0,9% sous l&#39;humidité pour obtenir une solution de 10 mg / ml de OH-TAM et tourbillonner complètement. Sonicate jusqu&#39;à ce que la solution soit claire et complètement remis en suspension (au moins 30 minutes). </li><li> Préchauffer la progestérone à température ambiante. </li><li> Mélanger 450 μL de OH-TAM et 225 μL de progestérone dans un tube de microcentrifugeuse. Vortex. </li><li> Sonicate au moins 10 min et charge sur une seringue de 1 mL avec une aiguille 25G. </li><li> Dans l&#39;établissement animal, pesez la femme enceinte (les femelles Csf1r MeriCreMer sont dans un fond génétique de la FVB consanguine et pèsent typiquement entre ellesEn 25 et 33 g). </li><li> Effectuer une injection intra-péritonéale en injectant lentement le volume calculé dans la souris. Après avoir retiré l&#39;aiguille, appuyez doucement sur la blessure par ponction et masser l&#39;abdomen pour distribuer le OH-TAM. NOTE: La dose d&#39;injection de OH-TAM est de 75 mg / kg et la dose de Progestérone est de 37,5 mg / kg. Le tableau 1 fournit le volume à injecter chez les femmes enceintes. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Poids de la souris (g) </td><td> Volume total à injecter à partir du mélange (μL) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Volume d&#39;injection du 4-OH-tamoxifène (OH-TAM). Volume nécessaire pour une injection unique à E8,5 de 75 μg par g (poids corporel) de OH-TAM additionné de 37,5 μg par g de progestérone. 2. Dissection du Yolk Sac (YS) et Foetal Liver (FL) REMARQUE: Des techniques stériles rigoureuses ne sont pas nécessaires lors de la manipulation d&#39;embryons, sauf si elles vont être utilisées pour une culture à long terme. Néanmoins, la zone de travail doit être propre et recouverte de papier d&#39;aluminium sous du papier absorbant. <ol><li> Préparer une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS) et un mélange de digestion (PBS contenant 1 mg / mL de collagénase D, 100 U / mL de désoxyribonucléase I (DNase I) et 3% de sérum bovin fœtal). </li><li> Sacrifiez les femmes enceintes par cerLuxation sexuelle au jour de gestation souhaité ( p. Ex. Stade embryonnaire E10.5). </li><li> Pincer la peau juste au-dessus des organes génitaux et faire une petite incision à la ligne médiane avec des ciseaux. Tirez la peau vers la tête pour exposer complètement la paroi du corps sans fourrure. Couper les muscles abdominaux pour exposer les organes internes et pousser l&#39;intestin pour exposer les deux cornes utérines. </li><li> Avec des pinces mijoteuses de taille moyenne, saisissez le bloc-gouttes attaché à l&#39;ovaire et tirez délicatement l&#39;utérus. Couper au niveau cervical des cornes utérines et soulever les cornes de la cavité péritonéale. Retirez le tampon gras pour libérer complètement les cornes utérines et couper les cornes de l&#39;ovaire de chaque côté. </li><li> Mettez les cornes dans du PBS glacé dans une boîte de Petri de 10 mm. Attaque rapidement les couches musculaires de l&#39;utérus à une extrémité (extrémité cervicale) et faites glisser des ciseaux fins entre la couche musculaire et le tissu décalé pour libérer les embryons avec le tissu décalé environnant. NOTE: Muscle a tendance à se contracter rapidement aprèsL&#39;extraction, donc cette étape doit être aussi rapide que possible. </li><li> Utilisez une paire de pinces fines pour couper la membrane de Reichert et le placenta. </li><li> Retirez doucement le sac jaune et placez-le dans une plaque de culture tissulaire de 24 po avec 0,5 ml de mélange de digestion. REMARQUE: à cette étape, le sang embryonnaire peut être collecté. <ol><li> Immédiatement après la séparation des vaisseaux ombilicaux et vitellinois, transférer l&#39;embryon dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits contenant 10 mM d&#39;acide éthylènediaminetétracétique glacé (EDTA). Décapiter l&#39;embryon à l&#39;aide de ciseaux fins et fins, en essayant de limiter autant que possible la dilaceration des tissus. Incuber sur de la glace pendant 10-15 min et recueillir l&#39;EDTA contenant le sang. </li></ol></li><li> Retirer l&#39;amnium entourant l&#39;embryon. </li><li> Pour les étapes &lt;E11.5, comptez le nombre de paires somites pour une meilleure mise en scène des embryons et une meilleure résolution du temps (chaque paire somite se développe en ~ 1 h 30 min). </li><li> Coupez la tête de l&#39;embryon nousDes pinceaux ou des ciseaux fins. Transférer la tête vers une plaque à 24 puits avec 0,5 mL de mélange de digestion. NOTE: Le neuroectoderme et le cerveau à des stades ultérieurs sont encore disséqués pour l&#39;analyse de cytométrie en flux; Retirez soigneusement le plexus vasculaire environnant. </li><li> Couper l&#39;embryon au-dessus du membre postérieur et retirer les membres avant. </li><li> Pour isoler le foie, ouvrez le thorax en utilisant une pince fine. Pinche vers l&#39;avant du cœur et tirez doucement pendant l&#39;utilisation du deuxième pincement pour libérer les organes du corps. <ol><li> Séparez soigneusement le foie foetal du cœur et de l&#39;intestin. Transférer le foie foetal à une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de mélange de digestion. Surveillez attentivement le transfert sous microscope de dissection. </li></ol></li><li> Recueillir la région de la queue (ou toute autre partie de l&#39;embryon) pour le génotypage par dosage par réaction de polymérase en chaîne (PCR). NOTE: D&#39;autres tissus et organes peuvent être récoltés à partir d&#39;embryons E10.5 pour une analyse similaire utilisant la cytométrie en flux. Sang, tête de skiN, la région aorta-gonad-mésonephros (AGM), le cœur et le neuroectoderme peuvent être collectés à E10.5. Aux étapes ultérieures, le poumon, le rein, la rate et le pancréas peuvent également être collectés. Une description détaillée de la dissection de l&#39;AGA à différents stades de développement a déjà été décrite 14 . </li></ol> 3. Traitement des tissus embryonnaires pour la cytométrie de flux <ol><li> Incuber les organes (placés dans le mélange de digestion) pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Transférer le tissu et la solution enzymatique sur un filtre de 100 μm placé dans une plaque de culture de tissu de 6 puits remplie de 6 ml de tampon FACS (albumine de sérum bovin à 0,5% (BSA) et EDTA 2 mM dans 1x PBS). Dissociez mécaniquement en faisant tremper doucement avec le piston en caoutchouc noir d&#39;une seringue de 2 ml pour obtenir une suspension à une seule cellule. REMARQUE: à partir de maintenant, toutes les étapes doivent être effectuées à 4 ° C. </li><li> Recueillir la suspension cellulaire avec une pipette Pasteur et la transférer dans un tube de 15 mL. </li><li> SpiN pendant 7 min à 320 xg à 4 ° C. Jeter le surnageant par aspiration. </li><li> Remettre en suspension la pastille dans 60 μL de tampon bloquant Fc (anticorps bloquant CD16 / CD32 dilué 1/50 dans un tampon FACS). <ol><li> Transférer 50 μL de la suspension à une seule cellule par puits dans une plaque à 96 puits multiples à fond rond. Incuber pendant au moins 15 minutes sur de la glace. REMARQUE: La coloration peut également être effectuée dans 5 ml de tubes FACS en polystyrène lors de la manipulation d&#39;un petit nombre d&#39;échantillons. </li><li> Transférer les 10 μL restants dans un tube FACS en polystyrène de 5 ml pour obtenir un pool d&#39;échantillons de chaque tissu. Ce pool servira de témoins ( c&#39;est-à-dire des échantillons non colorés et des témoins fluorescents moins un (FMO) pour chaque fluorochrome). Transférer 50 μL de la piscine pour chaque contrôle fluorescent moins (FMO) (un par fluorochrome) à la plaque multi-puits 96. NOTE: Chaque contrôle FMO contient tous les anticorps couplés au fluorochrome du panneau d&#39;anticorps, à l&#39;exception de celuiQui est mesuré. Les FMO sont utilisés pour identifier les limites des barrières et pour contrôler le chevauchement spectral dans les panneaux multicolores. Pour traiter correctement les variations de fond et l&#39;autofluorescence entre différents tissus, il est important de préparer ces contrôles à partir du pool d&#39;échantillons de chaque tissu. Le contrôle approprié pour l&#39;expression de YFP sera les échantillons d&#39;embryons Cre-négatifs, qui sont confirmés par le génotypage par PCR. </li></ol></li></ol> 4. Coloration antigénique en surface <ol><li> Préparer le mélange d&#39;anticorps dans le tampon FACS (tableau 2). Préparer 50 μL de mélange d&#39;anticorps par échantillon. <ol><li> Utiliser les anticorps couplés au fluorochrome suivants: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-kit (clone 2B8); Et anti-Ter119 (clone Ter119). </li><li> Préparez six mélanges d&#39;anticorps pour les contrôles FMO dans le tampon FACS. Préparer 50 μL de mélange d&#39;anticorps par échantillon témoin. NONTE: La dilution d&#39;anticorps dans le mélange d&#39;anticorps est deux fois plus concentrée que la concentration finale indiquée dans la table des matériaux. Pour un panneau avec six anticorps couplés au fluorochrome, 6 contrôles FMO sont préparés. Le tableau 2 fournit la composition du mélange d&#39;anticorps et des témoins FMO pour un tube. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Volume (μL) d&#39;anticorps (Volume final 50 μL) </td></tr><tr><td> Anticorps </td><td> Cloner </td><td> Mélange d&#39;anticorps </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> Kit FMO </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> Anti-CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-kit </td><td> 2B8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Tampon FACS </td><td> 45,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>Tableau 2: Volume des anticorps utilisés pour la coloration et les contrôles Fluorescent moins un (FMO). Volume (μL) d&#39;anticorps requis pour un volume final de 50 μL. <ol start="2"><li> Ajouter 50 μL du mélange d&#39;anticorps aux échantillons dans la plaque 96-multiwell (le volume final pendant la coloration est de 100 μL). Incorporer délicatement les pipettes deux fois et incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Faire tourner la plaque à 96 puits multiples pendant 7 min à 320 xg à 4 ° C et jeter le surnageant. Resuspendre dans 200 μL de tampon FACS. </li><li> Répéter la procédure de lavage (étape 4.3) deux fois avec 150 μL de tampon FACS. </li><li> Filtrer les échantillons et les témoins (FMO et échantillons de pool non étayés) dans des tubes de 5 ml de polystyrène dans un filtre de 70 μm. Stocker sur la glace jusqu&#39;à l&#39;acquisition. </li></ol> 5. Identification des EMP et des macrophages dérivés de YS par cytométrie de flux REMARQUE: Ce protocole a été optimisé à l&#39;aide d&#39;un cytomètre à flux laser 4 eqMis au point avec un laser Violet de 405 nm, un laser bleu de 488 nm, un laser jaune de 562 nm et un laser rouge de 638 nm. <ol><li> Préparer des perles de compensation pour chaque anticorps couplé suivant les instructions du fabricant. Utilisez des échantillons non étagés et des perles de compensation pour optimiser les intensités laser. </li><li> Pour identifier les limites des barrières, utilisez les contrôles FMO (Fluorescence moins un) pour chaque anticorps. </li><li> Afin d&#39;exclure les cellules mortes, ajouter 1 μL de DAPI (1 mg / ml) au tube (contenant 200 μL de suspension de cellules colorées) 1 minute avant l&#39;acquisition. Utilisez le signal DAPI fort et le paramètre dispersé vers l&#39;avant (FSC) pour effectuer l&#39;exclusion des cellules mortes et des débris. REMARQUE: utilisez le logiciel du cytomètre de flux pour attirer les portes pendant l&#39;acquisition. La matrice de compensation et l&#39;analyse peuvent être effectuées après l&#39;acquisition de l&#39;échantillon en utilisant d&#39;autres logiciels disponibles dans le commerce. </li><li> Utilisez la diffusion directe et latérale (FSC vs SSC) pour effectuer une discrimination de cellules vivantes et de doublet par rapport aux événements totaux. </li><li> Créez des diagrammes de points de fluorescence dans l&#39;axe de l&#39;échelle logarithmique et tirez les portes filles pour, d&#39;abord, exclure les érythrocytes (Ter119 + ) et ensuite identifier les cellules progénitrices (Kit + ) et les cellules hématopoïétiques (CD45 + Kit neg ) (voir la figure 1 ). </li><li> Créez des histogrammes de fluorescence pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;étiquetage du YFP parmi les différentes populations identifiées dans le YS ( Figure 2 ), le foie foetal ( Figure 3 ) et le cerveau ( Figure 4 ). </li></ol>

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<li>Yona, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+origins+and+dynamics+of+monocytes+and+tissue+macrophages+under+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.</a> Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).</li>
<li>Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+Tissue-Resident+Macrophages+Except+Microglia+Are+Derived+from+Fetal+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells.</a> Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les différentes ondes de cellules précurseurs hématopoïétiques se chevauchent partiellement dans un court laps de temps, ce qui rend l&#39;analyse de la contribution de chaque onde d&#39;hématopoïèse du développement aux cellules immunitaires techniquement très difficile. Les systèmes créateurs inducibles au tamoxifène offrent l&#39;opportunité de marquer des cellules spécifiques de façon inducible dans le temps et d&#39;effectuer une analyse de lignage chez des embryons ou des adultes, sans...

Il existe plusieurs vagues de progéniteurs hématopoïétiques successifs mais se chevauchant pendant le développement dont la descendance myéloïde reste à l&#39;âge adulte. Tout d&#39; abord, unipotentes progéniteurs « primitives » apparaissent dans le sac vitellin de la souris 1, 2 entre E7.5-E8.25 et donnent lieu à des macrophages embryonnaires sans intermédiaire monocytaire. Que les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs persistent dans le cerveau adulte car la microglie reste un sujet d&#39;investigation active. Deuxièmement, les précurseurs érythro-myéloïdes (EMP) apparaissent dans le sac jaune chez E8.5, entre dans la circulation sanguine et colonisent l&#39;embryon. Les EMP sortent de l&#39;endothélium hémogène du sac vénitien dans une transition endothélial-hématopoïétique dépendant de Runx1 3 , 4 . Alors que EMP peut se différencier en macrophages dans le sac jaune, ils colonisent également le foie foetal du jour embryonnaire (E) 9 5 et différentDans les érythrocytes, les mégacaryocytes, les macrophages, les granocytes monocytes et les mastocytes 6 . Les macrophages qui proviennent des EMP présentent une capacité proliférative dans les tissus de développement et adultes. La question de savoir si les macrophages dérivés de l&#39;EMP contournent le stade de la différenciation des monocytes est encore controversée car on sait très peu de choses sur leur voie de différenciation 7 , 8 . Enfin, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) émergent à E10.5 dans l&#39;embryon proprement dite de la région aorte-gonade-mésonephros et migrent vers le foie foetal. Les HSC avec une capacité de repeuplement à long terme ne sont détectés qu&#39;après E11 (au stade de la paire 42 somite) 9 . Là, ils se développent et se différencient de E12.5 jusqu&#39;à ce que l&#39;hématopoïèse définitive commence à se déplacer vers la moelle osseuse, ce qui devient le site prédominant de la production de globules sanguins pendant la durée de la vie postnatal 10 . Le spLe chevauchement temporel et temporel dans l&#39;émergence, ainsi que les marqueurs immuno-phénotypiques partagés ont jusqu&#39;à présent entravé notre capacité à distinguer les contributions spécifiques de ces ondes de progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires. Alors que EMP et HSC sont générés de manière dépendante de Runx1 et expriment le facteur de transcription Myb et le récepteur du facteur de croissance Csf1r (Récepteur Factor 1 de Colony-Stimulating, également connu sous le nom de Récepteur de Facteur Stimulant de colonie de Macrophage) parmi d&#39;autres, les EMP peuvent être distingués de HSC par leur manque de potentiel lymphoïde, in vitro et in vivo , leur manque de potentiel de repopulation à long terme et le manque d&#39;expression superficielle du marqueur de lignée Sca-1 11 . Des modèles de cartographie du sort génétique sont nécessaires pour caractériser l&#39;ontogénie des macrophages, car ils permettent de cibler les progéniteurs embryonnaires de manière spécifique à chaque cellule et à chaque fois. Nous présentons ici le protocole de cartographie du destin utilisé dans notre laboratoire pour discriminer les deux lignéesS des macrophages présents dans la plupart des tissus adultes: les macrophages infiltrés dérivés de HSC et les macrophages résidents indépendants de HSC. Les macrophages résiduaires de tissus ont été remontés aux cellules précurseurs indépendantes de Myb exprimant le récepteur de cytokine Csf1r 12 et sont présents dans l&#39;embryon à E8.5-E10.5 en utilisant trois stratégies complémentaires de cartographie du sort 6 . Pour étudier l&#39;hématopoïèse des sacs vésicaux sans étiquetage des HSC foetaux, nous utilisons une souche transgénique, Csf1r MeriCreMer , exprimant une protéine de fusion inducible au tamoxifène de Cre recombinase améliorée et deux récepteurs d&#39;œstrogènes de souris (Mer-iCre-Mer) sous le contrôle de Le promoteur Csf1r. Par conséquent, la recombinase Cre sera active dans Csf1r -expressing cells pendant une fenêtre temporelle limitée. Lorsqu&#39;il est utilisé avec une souche rapportrice contenant une protéine fluorescente en aval d&#39;une cassette Lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), elle conduira à la permanenceL&#39;étiquetage génétique des cellules présentes au moment de l&#39;induction mais aussi de leur descendance. L&#39;administration à E8.5 de la forme active du tamoxifène, du 4-hydroxytamoxifène (OH-TAM), des EMP et des macrophages, sans étiquetage des progéniteurs &quot;primitifs&quot; ou des HSC foetaux unipotents. Ainsi, nous avons caractérisé l&#39;immunophénotype des EMP et leur descendance pendant le développement embryonnaire, ainsi que la contribution des macrophages dérivés du sac vésiculaire aux pools de macrophages adultes. Un travail supplémentaire est nécessaire pour caractériser si les macrophages dérivés de progéniteurs primitifs sont également étiquetés en utilisant cette approche et s&#39;ils peuvent contribuer à des pools de macrophages adultes.

<table><tbody><tr><td>#5 Pince droite</td><td>Outils de science fine</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19/B Pascheff-Wolff Ciseaux à ressort&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux droits de 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>dilution 1/200 dans les FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>dilution 1/100 dans les FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>Dilution 1/100 dans les FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>Dilution 1/200 dans les FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>Dilution 1/100 dans les FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>Dilution 1/200 dans le FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/CD32 (Souris BD Fc Block, clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase D&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Désoxyribonucléase I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 6 puits</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 12 puits</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 24 puits</td><td>Fischer Scientific</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Culture tissulaire à fond en forme de U assiette</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Seringue Plastipak 2 mL&nbsp ;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Grille en nylon 100 & micro ; crépines à cellules m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Grille en nylon 70 & micro ; Crépines à cellules m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubes Falcon</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GP Kit de filtration Millipore, 0.2 &mu ; m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFÈNE 25mg</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG</td><td>Des précautions particulières doivent être prises lors de la préparation et du travail avec le tamoxifène et ses dérivés. Utilisez toujours un équipement de protection individuelle approprié</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>Utilisez toujours un équipement de protection individuelle approprié</td></tr><tr><td>PEG-35 huile de ricin (Kolliphor/Cremophor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>Huile de tournesol</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td> Toujours <td>utiliser un équipement de protection individuelle approprié et l’utiliser sous la hotte</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML DANS L’EAU)</td><td>fischer Scientific</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 CytoFLEX CytoFLEX</td><td>B75408</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Daily QC Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter&nbsp ;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>VersaComp Kit de perles de capture d’anticorps (2x5 mL)</td><td>Beckman Coulter&nbsp ;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Les macrophages sont des phagocytes professionnels du bras inné du système immunitaire. À l&#39;état stable, les macrophages sessiles se retrouvent dans les tissus adultes où ils agissent comme des sentinelles de front d&#39;infection et des lésions tissulaires. Alors que d&#39;autres cellules immunitaires sont continuellement renouvelées à partir de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) situées dans la moelle osseuse, une lignée de macrophages, connue sous le nom de macrophages résidents, s&#39;est révélée être auto-entretenue dans les tissus sans apport de HSPC de moelle osseuse. Cette lignée est illustrée par la microglie dans le cerveau, les cellules de Kupffer dans le foie et les cellules de Langerhans dans l&#39;épiderme parmi d&#39;autres. La lamelle intestinale et la lame de côlon sont les seuls tissus adultes dépourvus de macrophages résidents indépendants de HSPC. Des recherches récentes ont révélé que les macrophages résidents proviennent de l&#39;hématopoïèse extra-embryonnaire des sacs vésicaux à partir de progéniteurs distincts des cellules souches hématopoïétiques fœtales (HSC). Chez l&#39;hématopoïèse définitive du sac jaune, eLes progéniteurs rythromyélidiques (EMP) donnent naissance à la fois aux cellules érythroïdes et myéloïdes, en particulier les macrophages résidents. EMP ne sont générés que dans le sac jaune entre E8.5 et E10.5 jours de développement et ils migrent vers le foetus foetal dès que la circulation est connectée, où ils se développent et se différencient jusqu&#39;à au moins E16.5. Leur descendance comprend les érythrocytes, les macrophages, les neutrophiles et les mastocytes, mais seuls les macrophages dérivés de l&#39;EMP persistent jusqu&#39;à l&#39;âge adulte dans les tissus. La nature transitoire de l&#39;émergence de l&#39;EMP et le chevauchement temporel avec la génération HSC rend difficile l&#39;analyse de ces progéniteurs. Nous avons établi un protocole de cartographie du sort inducible au tamoxifène basé sur l&#39;expression du promoteur Csf1r du récepteur des cytokines des macrophages pour caractériser les cellules dérivées de l&#39;EMP et de l&#39;EMP in vivo par cytométrie de flux.

La cartographie du sort génétique a été obtenue par administration à E8.5 de OH-TAM dans des femelles Csf1r-Mer-iCre-Mer associées à des mâles portant un reporter Rosa26-LSL-eYFP. En présence de OH-TAM, l&#39;excision de la cassette d&#39;arrêt conduit à l&#39;expression permanente de YFP dans les cellules exprimant Csf1r . Nous avons recueilli deux tissus hématopoïétiques: le sac jaune et le foie foetal et un tissu non hématopoïétique, le neuroectoderme, des embryons à E10,5. L...

Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

L'objectif général de cette expérience est de caractériser les progéniteurs hématopoïétiques du sac vitellin et leurs descendants in vivo à l'aide d'un système de cartographie du destin induit par le tamoxifène chez la souris et de la cytométrie en flux. Cette approche peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie concernant le développement et la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques distincts des cellules souches hématopoïétiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de marquer les progéniteurs hématopoïétiques durant une fenêtre de temps limitée et de suivre leurs descendants, tels que les macrophages résidents, tout au long du développement et à l'âge adulte.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la quantité importante de cellules présentes dans le tissu embryonnaire et du grand volume des échantillons traités simultanément. Pour commencer l'expérience, transférez d'abord les cornes utérines de souris disséquées dans une boîte de Pétri de 10 millimètres remplie d'environ 30 millilitres de PBS glacé. Immédiatement après, saisissez les couches musculaire

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Une méthode cytométrie en flux pour l'identification et l'analyse moléculaire de la différenciation-spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes murines et précurseurs, directement dans la moelle osseuse de souris fraîchement récoltés, de la rate ou du foie fœtal. Le test repose sur la surface des cellules CD71 marqueurs, Ter119, et la taille des cellules.

Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes.

Identification d&#39;une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.

Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins

Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.

Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Ici, nous présentons un protocole de culture des arcs pharyngiens pour étudier la biologie des cellules progénitrices cardiaques et musculaires et de leur microenvironnement.

Culture ex vivo des pharyngée Arches pour étudier cardiaques et musculaires progéniteurs et leur niche

Nous décrivons une stratégie de tri pour les spermatides de souris à l’aide de la cytométrie en flux. Les spermatides sont classées en quatre populations très pures : rondes (étapes 1 à 9 de la spermiogenèse), allongées précoces (étapes 10 à 12 de la spermiogenèse), allongées tardives (étapes 13 et 14 de la spermiogenèse) et spermatides allongées (étapes 15 et 16 de la spermogenèse). La coloration de l’ADN, la taille et la granulosité sont utilisées comme paramètres de sélection.

-Étape spécifique de tri Spermatides souris par cytométrie en flux

Découvrez la caractérisation des progéniteurs hématopoïétiques du sac vitellin et de leur descendance chez la souris par marquage du destin induit au tamoxifène et cytométrie de flux.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l'embryon de souris par cytométrie de flux

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