En utilisant les cultures primaires Neurosphère à étudier primaire Cilia

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des méthodes de culture basées sur la neurosphère pour les cellules neurales, souches et progénitrices primaires afin d’étudier la biogenèse et le trafic du cil primaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des cils primaires, telles que la biogenèse des cils et le trafic des molécules de cils vers les cils primaires. Dans les cellules souches neurales primaires, les progéniteurs neuraux et les neurones.

Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons utiliser les critères cellulaires primaires des cellules souches neurales, des progéniteurs neuraux et des neurones pour analyser la biogenèse et les voies ciliaires dans le contexte du cil primaire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car la culture de cellules souches neurales est techniquement difficile pour les débutants. Nous montrerons qu’une démonstration de cette méthode est essentielle, car la dissection du ventricule latéral et des étapes telles que la culture des neurosphères et la quantification des cils primaires sont facilement apprises en observant les étapes critiques.

Commencez cette procédure avec une zone sous-ventriculaire du ventricule latéral disséquée chez une souris adulte en utilisant la méthode de dissection de montage entier. Placez le tissu contenant le SVZ dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans du PBS et incubez 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Après l’incubation, ajoutez 500 microlitres de milieu d’arrêt et pipetez doucement 20 à 30 fois à l’aide d’un embout de 1 millilitre. Évitez de former des bulles d’air pendant le pipetage. Après cela, faites tourner les cellules à 500 fois G pendant huit minutes.

Jetez le surnageant, puis ajoutez 1 millilitre de PBS et remettez les cellules en suspension en pipetant doucement cinq fois à l’aide d’un embout de 1 millilitre. Centrifuger à 500 fois G pendant huit minutes. Aspirez ensuite le milieu à l’aide d’un embout de 1 millilitre et ajoutez 1 millilitre de milieu basal.

Après avoir compté les cellules, plaquez les cellules d’une SVZ dans une boîte de 10 centimètres avec 10 millilitres de milieu NSC et cultivez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après cinq à sept jours, les neurosphères peuvent être observées. Pour analyser les cellules des neurosphères attachées par immunomarquage, transférez 1 millilitre de milieu contenant plusieurs neurosphères dans un tube de 1,5 millilitre et tournez à 500 fois G pendant huit minutes.

Après avoir retiré le fluide, fixez les sphères avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 minutes. Après avoir éliminé le paraformaldéhyde, incubez les sphères avec 30 % de saccharose, pendant la nuit. Et puis centrifuger à nouveau.

Laver avec du PBS. Ensuite, après avoir centrifugé comme précédemment, retirez et jetez le surnageant. Ensuite, installez une pipette avec une pointe coupée de 1 millilitre et pipetez 500 microlitres de solution OCT sur les neurosphères.

Transférez la solution OCT contenant les neurosphères dans un moule de congélation en plastique jetable. Ensuite, congelez le moule sur de la glace sèche pendant au moins 15 minutes. Coupez des sections avec un cryostat.

Pour visualiser les cellules souches de la neurosphère, effectuez une immunocoloration contre le marqueur de cellules souches Nestin. Pour visualiser les cils primaires dans une neurosphère, effectuez une immunocoloration contre ARL13B. Commencer cette expérience un à deux jours après l’ensemencement de cellules souches neurales dissociées adhérentes sur des lamelles enrobées de poly-L-lysine et de laminine.

Changer le milieu dans les puits expérimentaux en milieu de famine et en milieu NSC frais dans les puits témoins. Incuber pendant 24 heures supplémentaires. Le lendemain, fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante.

Après la fixation, laver avec du PBS deux fois pendant cinq minutes chacune, à température ambiante. Et puis effectuer l’immunofluorescence à l’aide de protocoles standard. Montez les lamelles de recouvrement avec la solution de montage.

Ensuite, séchez le verre de la lame pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Le lendemain, acquérez des images sur un microscope composé avec le grossissement nécessaire. La caméra et les objectifs du microscope doivent être contrôlés à l’aide du logiciel qui les accompagne.

Prenez suffisamment de sections z à des intervalles de 0,5 à 0,8 micron. Pour l’analyse quantitative de la localisation ciliaire dans les cellules adhérentes, sélectionnez trois à huit champs consécutifs avec des cellules confluentes en visualisant le canal DAPI. Acquérez des piles d’images à partir de chaque champ.

Quantifiez le nombre de cils primaires à l’aide d’ImageJ. Ouvrez la boîte de dialogue Analyses des plug-ins et sélectionnez l’outil Compteur de cellules pour compter les cellules avec des cils positifs au RCPG. Utilisez des paramètres d’intensité d’image et de contraste similaires pour toutes les images de la même expérience à des fins de comptage et d’exportation.

24 heures après la culture des cellules dissociées dans le milieu NSC ou le milieu de famine, les cellules ont été fixées et immunomarquées contre GPR161 en vert, ARL13B en rouge et l’ADN en bleu. Des cils positifs au GPR161 sont observés dans les cellules témoins à gauche et les cellules affamées à droite. Comme on le voit dans ces vues agrandies.

Les flèches blanches et les pointes de flèches indiquent respectivement les cils positifs et négatifs du GPR161. Cette image montre la quantification des cellules ciliées positives à ARL13B. La quantification est effectuée à partir de deux champs de vision, chacun à partir de deux répliques techniques d’une même expérience.

Le pourcentage de cellules ciliées positives pour l’ARL13B augmente en cas de famine. Cette image montre la quantification de la localisation de GPR161 dans les cils positifs à ARL13B dans les cellules témoins et les cellules affamées. Le pourcentage de localisation de GPR161 dans les cils positifs à ARL13B augmente également en cas de famine.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures si elle est exécutée correctement. À la suite de cette procédure, une autre méthode de culture de cellules primaires dérivées de tumeurs peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le rôle des cils dans la genèse tumorale. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des cils primaires pour explorer la biogenèse ciliaire et le trafic dans les systèmes neurosphériques primaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les cils primaires dans les cellules souches neurales, les progéniteurs neuraux et les neurones dérivés de cultures basées sur la neurosphère.