Mise à l'échelle de l'ingénierie vasculaire Greffes Utilisation 3D Printed Guides et Méthode d'empilage Anneau

L’objectif global de cette méthode est de générer de manière robuste et cohérente des vaisseaux sanguins modifiés de n’importe quelle taille. Cette technique permet une ingénierie fiable et efficace des vaisseaux sanguins. Le principal avantage de cette technique est que les récipients de toutes tailles peuvent être fabriqués facilement et de manière fiable.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous discutions de la façon de concevoir un tube de tissu et avons comparé notre méthode à la construction de tunnels routiers, un segment à la fois. Pour préparer les inserts imprimés en 3D, ajoutez d’abord une fine couche de deux, quatre ou six ml de silicone non durci au fond d’une boîte de Pétri de 35, 60 ou 100 millimètres, respectivement. Pour créer des poteaux pour les plaques de 35 mm, versez le PDMS dans une autre plaque de 100 mm à une hauteur de sept mm, puis chauffez le PDMS sur une plaque chauffante à 60 degrés Celsius pendant deux à trois heures.

Lorsque le PDMS est durci, utilisez un poinçon de biopsie de cinq mm pour créer des tenons cylindriques. Utilisation d’une petite quantité de PDMS non durci pour fixer les cylindres au centre de chaque plaque de 35 mm. Placez une coque extérieure imprimée en 3D d’environ 66,7 mm de diamètre, à égale distance du poteau, dans les plaques de 100 mm.

Avant que le PDMS au bas des plaques de 60 et 100 mm ne soit durci, placez des poteaux imprimés en 3D de 10 et 20 mm de diamètre au centre de chaque plaque de 60 et 100 mm respectivement. Laissez la vaisselle durcir à l’air libre sur la plaque chauffante à 60 degrés Celsius pendant deux à trois heures, suivie de dix-huit heures de dégazage des polymères. À la fin du dégazage, stérilisez l’intérieur de toutes les plaques avec de l’éthanol à 70 % et couvrez chaque plaque pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement l’éthanol de chaque plaque pour permettre le séchage à l’air. Lorsque les plaques sont sèches, transférez-les dans une enceinte de sécurité biologique à côté de leurs couvercles correspondants. et exposer les matériaux à la lumière UV pendant 30 minutes pour terminer la stérilisation.

Pour préparer l’hydrogel de fibrine, ajoutez d’abord 0,5, 1,1 et 1,81 ml de milieu de croissance complété par du gel de fibrine et des boîtes de culture de 35, 60 et 100 mm, respectivement. Ensuite, ajoutez 40, 88,4 et 145 microlitres de Thrombin aux plaques de 35, 60 et 100 mm respectivement, et faites tourner doucement chaque plaque à la main. Lorsque la thrombine est uniformément répartie, ajoutez 160, 354 et 580 microlitres de fibrinogène avec un mouvement circulaire en forme de goutte au mélange moyen de thrombine dans les plaques de 35, 60 et 100 mm, respectivement, et faites tourner doucement les plaques pour répartir uniformément l’hydrogel.

Laissez l’hydrogel durcir pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Ensuite, essayez de synthétiser les cellules musculaires lisses d’intérêt, en expansant des plaques de culture cellulaire de 150 mm, et collectez les cellules détachées par centrifugation. Remettez les pastilles en suspension dans trois ml de milieu de différenciation et utilisez une pipette de deux ml pour triturer vigoureusement les cellules afin de briser les amas cellulaires.

Après le comptage, divisez les cellules en 2/10 10 puissance 6, 1/10 10 puissance 7 et 1,4 x 10 puissance 7 cellules par mL d’aliquotes dans des tubes coniques de 50 ml, étiquetés en fonction de leurs plaques de culture correspondantes. Ajouter un milieu de différenciation à chaque tube pour obtenir des volumes d’ensemencement finaux de deux, quatre et cinq mL pour chaque plaque de 35, 60 et 100 mm respectivement. Ensuite, ajoutez soigneusement les solutions cellulaires goutte à goutte sur l’hydrogel préparé dans chaque plaque correspondante pour l’expansion dans l’incubateur de culture cellulaire. Au bout de deux à quatre jours, les anneaux se seront complètement contractés vers leurs postes.

Ajoutez donc 10, 20 ou 35 ml de TGF Beta 1 à chaque anneau de 35, 60 et 100 mm, respectivement. Pour assembler la construction vasculaire du vaisseau de 35 mm, coupez une section de deux pouces à partir du haut d’un tube conique en polycarbonate de 50 ml et collez le bord supérieur dans une plaque de 35 mm pour créer une grande plaque pour l’empilement d’anneaux. Pour les récipients de 60 et 100 mm, des plaques d’empilage à anneaux hauts découpent un tube en polycarbonate de 1,75 pouce de diamètre en sections de 2,5 pouces dans le sens de la longueur pour servir de parois de plaques hautes.

Pour les fonds de grandes assiettes, coupez une feuille de polycarbonate de 0,125 pouce d’épaisseur en morceaux de cercle de deux pouces de diamètre. À l’aide de ciment solvant acrylique, liez les sections de tube en polycarbonate aux pièces coupées circulaires. Imprimez en 3D des poteaux de cinq, dix et 20 mm de diamètre d’une longueur de 50 mm.

Ajoutez ensuite 10 ml de silicone non durci dans chaque récipient, en plaçant au centre chaque poteau imprimé en 3D dans chaque récipient de 35, 60 et 100 mm avant que le PDMS ne soit complètement durci. Et placez les plats sur une plaque chauffante à 60 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Lorsque le PDMS est durci, stérilisez les plaques avec de l’éthanol à 70 % comme nous venons de le démontrer, puis exposez les récipients stérilisés à l’éthanol séché à la lumière UV pendant 30 minutes.

Maintenant, utilisez deux paires de pinces très fines pour soulever soigneusement d’abord un côté, puis l’autre, d’un anneau d’hydrogel musculaire lisse étroitement enroulé de son poteau. Ensuite, glissez délicatement un côté de l’anneau, puis l’autre sur le grand poteau du récipient correspondant de taille suivante, plus grand. En travaillant circonférentiellement, avec des mouvements doux et progressifs, poussez lentement l’anneau vers le bas du poteau, puis empilez des anneaux de tissu supplémentaires jusqu’à ce que la longueur de vaisseau souhaitée ait été obtenue.

Lorsque tous les anneaux ont été empilés, tournez les plaques de manière à ce que les poteaux soient parallèles à la surface de travail et ajoutez doucement 40, 80 et 160 microlitres de Thrombin à la surface extérieure de chaque récipient de 35, 60 et 100 mm respectivement tout en tournant lentement les plaques. Ensuite, ajoutez 40, 80 et 160 microlitres de fibrinogène à chaque construction de 35, 60 et 100 mm respectivement, aussi rapidement et uniformément que possible tout en tournant vivement la construction. La thrombine et le fibrinogène se fixent rapidement en un gel ferme lors du mélange.

Ajoutez ensuite 20 ml de milieu de différenciation dans chaque récipient de construction et placez les récipients dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. L’analyse histologique révèle une cellularité élevée dans toutes les tailles d’anneaux, avec une petite quantité de gel de fibrine résiduel observée sur les bords extérieurs des petits anneaux. Dans les anneaux plus grands, une partie du gel de fibrine est intercalée avec le contenu cellulaire, avec des indications de production de collagène apparentes à la fois dans les anneaux intermédiaires et les grands anneaux.

L’analyse des anneaux tissulaires pour l’expression de l’actine et de la tropomyosine dans le muscle lisse alpha révèle que toutes les tailles d’anneau sont positives pour les deux anticorps, confirmant que le phénotype du muscle lisse a été maintenu. Les essais de traction indiquent une tendance constante à l’augmentation de la résistance corrélée à l’augmentation de la taille de l’anneau et du récipient dans les trois tailles d’anneaux. Les numéros d’ensemencement des cellules pour la création des différentes tailles d’anneau sont également en corrélation avec la surface d’ensemencement.

Ces cuves sont également capables de résister à un écoulement allant jusqu’à cinq minutes à des débits de 100 à 417 ml par minute, avec seulement des fuites mineures observées là où les récipients se connectent au système de profusion. Une fois maîtrisés, les anneaux peuvent être fabriqués en une heure si la technique est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de bien mélanger les composants de l’hydrogel pour assurer la prise du gel et la formation correcte de l’anneau.

Après cette procédure, d’autres méthodes, comme la création d’anneaux d’autres types de cellules, peuvent être mises en œuvre pour concevoir d’autres types de tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la méthode d’empilement d’anneaux pour concevoir des tissus vasculaires de différentes tailles.