Un dosage de HS-MRM pour la Quantification des protéines de la cellule-hôte en protéine Biopharmaceuticals par chromatographie en phase liquide Ion Mobility QTOF spectrométrie de masse

L’objectif global du test HS-MRM est de réduire le phénomène d’interférence MRM qui affecte la quantification des peptides ou des protéines en combinant la séparation de la mobilité ionique des précurseurs peptidiques avec la détection spectrométrique de masse à haute résolution des ions fragmentaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la caractérisation biothérapeutique ainsi que de la quantification de biomarqueurs de protéines ou de peptides et de la protéomique quantitative. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de détecter des protéines de cellules hôtes peu abondantes qui pourraient être présentes dans les protéines biopharmaceutiques.

Tout d’abord, cliquez sur créer une méthode d’analyse dans le logiciel d’acquisition de données et choisissez générer et acquérir et traiter la méthode. Saisissez le nom et la description de la méthode, accédez au dossier de la méthode et cliquez sur Suivant. Pour le type d’analyse, choisissez Peptide map IMS et cliquez sur Suivant.

Sélectionnez ensuite la configuration actuelle du système et cliquez sur Suivant et terminez. Dans la méthode nouvellement créée, cliquez sur l’onglet instruments, sélectionnez le gestionnaire de solvants binaires et modifiez les paramètres de gradient pour obtenir une séparation peptidique à un débit de 0,2 millilitre par minute. Utilisez une dilution graduelle de 1 à 40 % de solvant B en 30 minutes, suivie d’un lavage sur colonne de deux minutes et d’un équilibrage de 10 minutes avec une autonomie totale de 45 minutes.

Ensuite, sélectionnez le gestionnaire d’échantillons et réglez la température de l’échantillon sur 10 degrés Celsius et la température de la colonne sur 60 degrés Celsius. Dans l’onglet instruments, sélectionnez l’instrument Vion IMS QTof. Dans la section des paramètres, sélectionnez la sensibilité pour le mode analyseur et entrez trois kilovolts pour la tension capillaire, 100 degrés Celsius pour la température source, 250 degrés Celsius pour la température de désolvatation, 50 litres par heure pour le débit de gaz conique et 500 litres par heure pour le débit de gaz de désolvatation.

Cliquez sur l’onglet Expérience et sélectionnez MSE haute définition pour le mode. Entrez ensuite 100 pour une faible masse, 2000 pour une masse élevée et 0,4 seconde pour le temps de balayage. Dans la section énergie de collision, tapez six électronvolts pour le réglage basse énergie et choisissez une rampe d’énergie élevée de 15 à 40 électronvolts.

Pour le temps d’acquisition, utilisez une durée d’exécution personnalisée comprise entre cinq et 30 minutes. Ensuite, cliquez sur l’onglet options et sélectionnez le mode de correction de verrouillage automatique avec un intervalle de correction de verrouillage automatique de cinq minutes. Sélectionnez ensuite l’option Continuer avec la correction du verrouillage et assurez-vous que la vérification automatique du détecteur est désactivée.

Dans le menu de configuration actuel du système, sélectionnez l’instrument Vion IMS QTof et cliquez sur outils. Entrez trois kilovolts pour la tension capillaire, 40 volts pour le cône d’échantillonnage, 100 volts pour le décalage de la source, 100 degrés Celsius pour la température de la source, 250 degrés Celsius pour la température de désolvatation, 50 litres par heure pour le débit de gaz de cône, 500 litres par heure pour le flux de gaz de désolvatation et trois kilovolts pour la tension capillaire de référence. Analysez un échantillon de 10 nanomolaires faussement enrichi préalablement préparé à l’aide du test LC-HDMSE que nous venons de décrire en injectant 10 microlitres d’échantillon dans l’instrument.

Les séquences individuelles de six étalons de peptide B phosphorylase contenus dans le mélange de faux peptides sont montrées ici, ainsi que leurs temps de rétention et leurs précurseurs les plus abondants observés dans l’expérience HDMSE. Les spectres HDMSE acquis pour l’un des faux peptides dopés dans le digest Infliximab sont affichés ici. Dans le logiciel d’acquisition de données, cliquez sur créer une méthode d’analyse et choisissez générer et acquérir et traiter la méthode.

Saisissez le nom et la description de la méthode, accédez au dossier de la méthode et cliquez sur Suivant. Pour le type d’analyse, choisissez quantifier, sélectionnez Quantifier le dosage de Tof 2D chromatographique et cliquez sur Suivant. Sélectionnez ensuite la configuration actuelle du système et cliquez sur Suivant et terminez.

Cliquez sur l’onglet instruments dans la méthode nouvellement créée. Sélectionnez le gestionnaire de solvants binaires et modifiez les paramètres de gradient pour obtenir une séparation peptidique à un débit de 0,2 millilitre par minute. Utilisez une dilution graduelle de un à 40 % de solvant B en 30 minutes, suivie d’un lavage sur colonne de deux minutes et d’un équilibrage de 10 minutes avec une autonomie totale de 45 minutes.

Dans l’onglet instruments, sélectionnez le gestionnaire d’échantillons et réglez la température de l’échantillon sur 10 degrés Celsius et la température de la colonne sur 60 degrés Celsius. Sélectionnez maintenant l’instrument Vion IMS QTof et, dans la section des paramètres, sélectionnez la sensibilité pour le mode analyseur. Entrez ensuite trois kilovolts pour la tension capillaire, 100 degrés Celsius pour la température de la source, 250 degrés Celsius pour la température de désolvatation, 50 litres par heure pour le flux de gaz de cône et 500 litres par heure pour le flux de gaz de désolvatation.

Cliquez sur l’onglet Expérience et, pour Type d’expérience, choisissez Table de fonctions une ou plusieurs fonctions MS, MSMS ou MRM. Supprimez la fonction d’acquisition par défaut, cliquez sur ajouter plus MRM et modifiez les paramètres de la fenêtre de rétention dans la section d’exécution. Dans l’éditeur de fonctions Tof MRM, entrez le rapport de charge principal du précurseur peptidique, sélectionnez faible pour la résolution du précurseur et entrez l’état de charge du précurseur.

Entrez ensuite le rapport de charge principal du produit de 16 électronvolts pour l’énergie de collision de démarrage, de 0,1 seconde pour le temps de balayage fixe et de large pour la colonne de spectre. À l’aide du bouton dupliquer, ajoutez 10 transitions MRM supplémentaires et utilisez différentes valeurs d’énergie de collision dans la plage de 18 à 36 électronvolts. Après avoir établi les trois meilleures transitions pour chaque peptide, une expérience Tof MRM a été réalisée pour trouver l’énergie de collision optimale afin de maximiser les signaux générés pour chaque peptide.

Ensuite, mettez en place une méthode HS-MRM contenant un seul ion fragmentaire par peptide. Modifiez la méthode Tof MRM précédemment créée en sélectionnant la fonction HS-MRM au lieu de la fonction Tof MRM. Dans l’éditeur de fonctions HS-MRM, entrez le rapport de charge principal, sélectionnez faible pour la résolution du précurseur et entrez l’état de charge du précurseur.

Entrez ensuite la valeur CCS du précurseur et sélectionnez faible pour la résolution CCS du précurseur. Pour l’ion produit, entrez son rapport de charge principal, sélectionnez l’énergie de collision optimale, choisissez un temps de balayage de 0,4 seconde et sélectionnez un réglage à large spectre pour inclure tous ses isotopes. Le test HS-MRM final ne retient que la meilleure transition pour chaque peptide et est utilisé pour analyser tous les échantillons enrichis.

Dans la méthode d’analyse créée pour la méthode d’acquisition de données HS-MRM, cliquez sur l’onglet Objectif et choisissez Gérer les composants. Dans le menu déroulant sous Type d’expérience, sélectionnez l’option HS MSMS/HS MRM. Cliquez sur créer et entrez le nom du composant, le temps de rétention prévu, la fenêtre de temps d’extraction et le taux de charge principal du précurseur.

Sélectionnez le mode d’extraction XIC et saisissez la valeur CCS attendue. Pour l’ion fragment, entrez son état de charge et son rapport de charge principal. Entrez ensuite tous les composants peptidiques surveillés par le test HS-MRM.

Dans l’onglet objectif de la même méthode d’acquisition HS-MRM, cliquez sur les quantités par défaut et entrez 0,1, un, 10 et 100 nanomolaires pour tous les composants de faux peptides. Après avoir entré la première valeur, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez l’option de remplissage pour entrer la même concentration pour tous les composants. Répétez la même procédure pour les quatre concentrations de la courbe d’étalonnage.

Passez maintenant à l’onglet Traitement et cliquez sur Paramètres d’extraction. Entrée 10 PPM pour la tolérance de masse. Cliquez ensuite sur Tolérance de temps de dérive CCS et entrez 5 % pour la tolérance CCS.

Dans l’onglet Traitement, sélectionnez les paramètres de traitement de pointe. Dans la section Lissage, sélectionnez Moyenne comme algorithme de lissage, une comme demi-largeur et une comme itérations. Dans la section intégrer, assurez-vous que les options de largeur de crête automatique et de détection automatique sont toutes deux cochées.

Ensuite, sélectionnez les paramètres d’écran ciblés dans l’onglet Traitement et sélectionnez l’option la plus proche de RT dans la fenêtre RT. Entrez ensuite 0,2 minute pour la tolérance de temps de rétention. Sélectionnez les paramètres de quantification et, dans le menu d’étalonnage, choisissez linéaire pour le type d’ajustement de la courbe d’étalonnage, un sur x au carré pour le type de poids, concentration pour le type de valeur du composant, millimoles par litre pour les unités de valeur du composant et aucun pour calculer les points d’étalonnage en faisant la moyenne.

Dans le menu de quantification, sélectionnez zone comme valeur de réponse. Des exemples de chromatogrammes HS-MRM générés pour les faux peptides à toutes les concentrations sont présentés ici. Les courbes d’étalonnage obtenues pour chaque peptide suite à l’intégration des pics HS-MRM sont affichées ici.

L’écart-type relatif de l’aire du pic calculé sur la base de quatre injections répétées est résumé ici. Étant donné que le test MRM à haute sélectivité intègre à la fois la séparation des précurseurs de mobilité ionique et la détection spectrométrique de masse ciblée à haute résolution, il présente un grand potentiel pour devenir un test de surveillance rapide et à haut débit pour plusieurs protéines de la cellule hôte dans des lots de produits biopharmaceutiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en place d’un test MRM à haute sélectivité sur un instrument Vion IMS QTof.