Le suivi in vivo du développement de l'œdème et de la pathologie microvasculaire dans un modèle de paludisme cérébral expérimental utilisant l'imagerie par résonance magnétique
8 juin 2017
Nous décrivons un modèle murin de paludisme cérébral expérimental et montrons comment la pathologie inflammatoire et microvasculaire peut être suivie in vivo à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique.
L’objectif global de cette méthode est de surveiller les changements pathologiques du paludisme cérébral expérimental in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la pathogenèse du paludisme cérébral expérimental, car elle nous permet de visualiser in vivo comment la pathologie de l’ensemble du cerveau évolue dans l’espace et au fil du temps. La technique permet ainsi une évaluation détaillée de la pathologie cérébrale et peut être utilisée pour évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies de traitement du paludisme cérébral.
La configuration de l’IRM sera assurée par Manuel Fischer, notre responsable de laboratoire. Commencez par collecter les moustiques femelles de leur cage, 17 à 22 jours après le repas de sang. À l’aide d’une pince, placez trois à quatre moustiques sur une lame de verre, combinée à une goutte de milieu RPMI froid.
Ensuite, placez la lame sous un microscope. Étirez soigneusement le moustique entre la tête et le corps à l’aide d’une pince et utilisez une seringue et une aiguille pour isoler la glande salivaire. Ensuite, récupérez les glandes salivaires de la lame de verre en les aspirant avec une pipette en verre et en les transférant dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Ensuite, utilisez un petit bâtonnet en plastique pour écraser les glandes salivaires isolées dans le tube de centrifugation pendant trois minutes afin d’isoler les sporozoïtes du tissu des glandes salivaires. Centrifugez pendant trois minutes à 1 000 fois g et quatre degrés Celsius pour purifier les sporozoïtes des tissus restants. Pipetez le surnageant, qui contient les sporozoïtes, dans un nouveau tube à centrifuger, et comptez les sporozoïtes purifiés dans un hémocytomètre Neubauer.
Les sporozoïtes présentent un mouvement typique dans le sens inverse des aiguilles d’une montre. Ensuite, ajustez la concentration des sporozoïtes purifiés à 10 000 par millilitre en ajoutant une solution saline tamponnée au phosphate. Enfin, placez une souris C57BL/6 dans une contention et mettez sa queue dans de l’eau chaude pour mieux visualiser la veine de la queue.
Ensuite, injectez un total de 1 000 sporozoïtes, soit 0,1 millilitre, dans la veine de la queue pour initier l’infection. Commencez par approcher la souris d’un scanner d’imagerie par résonance magnétique pour petits animaux de 9,4 T, ou IRM, qui utilise un résonateur de volume pour la transmission des radiofréquences. Ensuite, appliquez la pommade oculaire au dexpanthénol sur les deux yeux.
Allumez le bain-marie à température contrôlée à 42 degrés Celsius afin de maintenir la température corporelle de la souris. Ensuite, placez un cathéter de veine caudale dans la veine de la queue de la souris. Ensuite, positionnez la souris pour l’IRM en la plaçant couchée et le dos croqué sur un lit d’animal équipé d’un serre-tête et d’une barre à dents pour minimiser les mouvements de la tête.
Veillez à ne pas redresser la colonne cervicale de la souris. Connectez un système d’injection d’agent de contraste rempli de 0,3 millimole par kilogramme de Gd-DTPA au cathéter de veine de la queue. Ensuite, placez la bobine de tête du récepteur de surface à réseau phasé à 4 canaux sur la tête de la souris.
Enfin, placez un coussin respiratoire sur le dos de la souris et vérifiez la respiration sur l’appareil de surveillance. Allumez le laser de position en appuyant sur F2 sur le panneau de configuration et déplacez la souris jusqu’à ce que la lumière de position horizontale se trouve au milieu de la plus petite partie de la bobine, qui recouvre la tête de la souris. Éteignez le laser de position en appuyant à nouveau sur F2, puis déplacez la souris dans la position finale en appuyant sur F3 sur le panneau de configuration.
Commencez par effectuer un balayage localisant pour vous assurer que le cerveau de la souris est dans l’isocentre de l’aimant. Évaluer qualitativement l’œdème vasogénique à l’aide de l’imagerie 3D pondérée en T2. Sélectionnez une séquence RARE à plusieurs tranches et ajustez la position de la tranche, en vous assurant que tout le cerveau, du nez au cervelet, est couvert.
Après avoir ajusté les tranches de saturation, démarrez la séquence et attendez 10 minutes et 48 secondes pour acquérir les images. Ensuite, effectuez une relaxométrie T2 pour évaluer quantitativement l’œdème vasogène en sélectionnant une séquence d’écho à plusieurs coupes et plusieurs spins. Ajustez la position de la tranche et lancez l’acquisition de la séquence, qui dure huit minutes et 53 secondes.
Pour évaluer quantitativement à la fois l’œdème vasogénique et l’œdème cytotoxique, effectuez une imagerie pondérée en diffusion en sélectionnant une séquence de diffusion EPI à écho de spin. Ajustez la position de la tranche et la tranche de saturation. Démarrez ensuite la séquence et attendez sept minutes et 56 secondes jusqu’à ce que les images brutes soient acquises.
Ensuite, évaluez les microhémorragies à l’aide de l’imagerie 3D T2 pondérée en étoiles. Sélectionnez une séquence FLASH compensée en débit, ajustez la position de la tranche et démarrez la séquence, qui dure 15 minutes et 40 secondes. Ensuite, évaluez la perméabilité artérielle à l’aide de l’angiographie à temps de vol en sélectionnant une séquence FLASH 3D.
Ajustez la position de la tranche, démarrez la séquence, puis attendez sept minutes et 16 secondes jusqu’à ce que les images soient acquises. Enfin, évaluez la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Sélectionnez une image 3D pondérée T1 avec une séquence FLASH, ajustez la position de la tranche et démarrez la séquence.
Attendez une minute et 14 secondes jusqu’à ce que des images sans contraste soient acquises. Ensuite, injectez un produit de contraste de 0,3 millimole par kilogramme et répétez la mesure. Une augmentation de la perturbation de la barrière hémato-encéphalique et une augmentation du liquide indiquent un œdème vasogénique précoce dans le bulbe olfactif qui est déjà présent dans la maladie bénigne et commence à se propager vers le tronc cérébral à mesure que la gravité de la maladie augmente.
Sur les cartes T2, la gravité de l’œdème vasogénique peut être quantifiée en dessinant les régions d’intérêt dans des régions anatomiques spécifiques. Pour chaque région, un temps de relaxation T2 qui augmente avec l’augmentation de l’œdème peut être obtenu. De plus, le volume cérébral indiquant un œdème commence à augmenter de manière significative chez les souris modérément malades par rapport à la ligne de base, et augmente encore chez les souris gravement malades.
Enfin, la pathologie microvasculaire, mise en évidence par des microhémorragies et une augmentation du contraste de susceptibilité des vaisseaux, survient après les premiers signes de rupture de la barrière hémato-encéphalique dans l’œdème vasogénique. Ces microhémorragies se produisent principalement dans le bulbe olfactif. Si l’ensemble du protocole IRM est obtenu, toutes les images, y compris le positionnement, peuvent être obtenues en une heure, si elles sont effectuées correctement.
Le protocole minimal doit inclure une séquence pondérée T2 ou une relaxométrie T2, et une séquence pondérée en étoile T2 afin de juger de la présence d’un œdème vasogène, d’une charge microhémorragique et d’une déficience microvasculaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont l’IRM du cerveau entier visualise les changements pathologiques dans le paludisme cérébral expérimental, y compris des changements tels que l’enflure du cerveau, qui est difficile à détecter ex vivo.
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Aperçu
Cet article décrit un modèle murin de paludisme cérébral expérimental et montre comment la pathologie inflammatoire et microvasculaire peut être suivie in vivo par imagerie par résonance magnétique (IRM). Cette méthode permet de visualiser l'évolution de la pathologie cérébrale dans le temps, contribuant ainsi à la compréhension de la progression de la maladie et de l'efficacité des traitements.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Maladies infectieuses
- Techniques d'imagerie
Contexte
- Le paludisme cérébral expérimental est une complication grave du paludisme.
- Comprendre sa pathogenèse est essentiel pour développer des traitements efficaces.
- Les techniques d'imagerie in vivo peuvent fournir des informations sur l'évolution de la maladie.
- L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une méthode non invasive permettant d'évaluer la pathologie cérébrale.
Objectif de l'étude
- Surveiller les modifications pathologiques dans le paludisme cérébral expérimental.
- Visualiser l'évolution de la pathologie cérébrale dans l'espace et le temps.
- Évaluer l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Méthodes utilisées
- Modèle murin de paludisme cérébral expérimental.
- Imagerie par résonance magnétique (IRM) pour le suivi in vivo.
- Évaluation de la pathologie inflammatoire et microvasculaire.
- Collecte de moustiques femelles pour la mise en place expérimentale.
Résultats principaux
- Surveillance réussie de la pathologie cérébrale par IRM.
- Visualisation des réponses inflammatoires dans le cerveau.
- Apercus sur l'évolution spatiale et temporelle de la maladie.
- Implications potentielles pour l'évaluation de l'efficacité du traitement.
Conclusions
- L'étude fournit un outil précieux pour comprendre le paludisme cérébral.
- L'imagerie in vivo peut améliorer l'évaluation des stratégies thérapeutiques.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer les interventions thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une surveillance non invasive et longitudinale de la rupture de la barrière hémato-encéphalique, de l'œdème et des atteintes microvasculaires dans un modèle translationnel de paludisme cérébral. En fournissant des données quantitatives par IRM sur l'évolution de la maladie, elle contribue à l'analyse mécanistique et à la réduction des risques associés aux voies neuroinflammatoires, ainsi qu'à l'évaluation prédictive de thérapeutiques ciblant le système nerveux central. L'approche améliore la validation des cibles en reliant les mécanismes vasculaires et inflammatoires à des biomarqueurs d'imagerie mesurables in vivo.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant l'évolution spatiale et temporelle de la rupture de la barrière hémato-encéphalique et de l'œdème in vivo.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles impliquées dans la neuroinflammation et les pathologies microvasculaires grâce à un imagerie longitudinale.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en quantifiant le développement de l'œdème et la charge en microhémorragies comme biomarqueurs transposables de la gravité de la maladie.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Prépare des systèmes validés et pertinents pour la maladie en établissant des phénotypes IRM de base pour l'œdème vasogénique et cytotoxique, en vue de criblages ultérieurs.
- Résultats quantitatifs : Fournit des temps de relaxation T2 et des mesures de volume cérébral permettant une évaluation standardisée et reproductible de l'œdème entre les différents groupes de traitement.
- Réutilisation de la plateforme : Met en place une plateforme d'imagerie évolutive pour évaluer les effets de composés sur l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique et la pathologie microvasculaire dans des modèles de maladies du système nerveux central.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Modélise des caractéristiques clés du paludisme cérébral humain, notamment l’œdème, le gonflement cérébral et la pathologie microvasculaire, soutenant ainsi l’alignement des biomarqueurs translationnels.
- Continuité préclinique : Assure le lien entre la découverte et la validation préclinique en permettant un suivi non invasif de la pathologie, des stades précoces aux stades graves de la maladie.
- Décisions ajustées au risque : Guide les décisions d’aller ou de ne pas aller plus loin en corrélant les charges d’œdème et d’hémorragies microscopiques issues de l’IRM avec la détérioration neurologique et les résultats de survie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés candidats et jusqu'aux tests d'efficacité préclinique, en fournissant des critères d'évaluation basés sur l'imagerie qui reflètent la fonction de la barrière hémato-encéphalique et la santé neurovasculaire.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les mécanismes vasculaires et inflammatoires en permettant une visualisation cérébrale complète de l'évolution de la pathologie dans le temps et l'espace.
- Depistage : Assure la préparation aux tests grâce à des protocoles IRM standardisés permettant de quantifier l'œdème et la charge en microhémorragies pour un criblage fiable de composés.
- Analytique : Produit des sorties quantitatives de relaxométrie T2, de diffusion pondérée et de susceptibilité pondérée, facilitant la comparaison entre groupes et la modélisation dose-réponse.
- Recherche translationnelle : S'associe à la validation préclinique en surveillant les modifications pathologiques pertinentes pour la maladie, qui reflètent les manifestations humaines du paludisme cérébral.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une capacité réutilisable dans divers programmes portant sur les maladies infectieuses du SNC, les affections neuroinflammatoires et la pénétration de la barrière hémato-encéphalique.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique liée aux contributions neurovasculaires et inflammatoires à la pathologie.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité grâce à des protocoles normalisés d'acquisition IRM et de post-traitement pour la quantification de l'œdème et des microhémorragies.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en fournissant des biomarqueurs d'imagerie transposables, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée du développement de médicaments pour le système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en reliant les paramètres d'œdème et de microhémorragie issus de l'IRM à la gravité de la maladie et à la réponse au traitement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en IRM chez les petits animaux, en manipulation des agents de contraste et en interprétation neuropathologique de l’œdème et des modifications microvasculaires.
- Dépend d’un équipement d’IRM à haut champ (9,4 T), de résonateurs volumétriques, de bobines en réseau à commande de phase et de systèmes d’injection de contraste pour l’administration de Gd-DTPA.
- Implique une standardisation interéquipes entre les équipes de parasitologie, d’imagerie et de pathologie afin d’assurer des modèles d’infection cohérents et une analyse d’image uniforme.
- Suppose des adaptations lors de l’application du modèle à d'autres souches, espèces ou pathologies du système nerveux central autres que le paludisme cérébral expérimental.
- Est limité par la complexité technique des protocoles d’IRM multiparamétriques et par la nécessité d’une surveillance physiologique précise durant l’acquisition.
