Name: Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Découvrez l'imagerie en cellules vivantes de la migration nucléaire intercinétique dans les explants rétiniens de zebrafish par microscopie multiphotonique. Cette méthode permet d'étudier la régénération rétinienne en temps réel.

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Nous apprécions le soutien fourni par William Archer et le Fonds Notre Dame imagerie intégrée. Des remerciements spéciaux sont dirigés vers les techniciens Freimann sciences de la vie pour leur aide continue et leur prise en charge et de l&#39;élevage du poisson zèbre. Cette étude a été soutenue par des subventions du National Eye Institute des NIH pour DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) et le Centre de recherche Zebrafish, Université de Notre Dame, Notre Dame, IN.

<ol><li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+Muller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Kassen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+analysis+of+gene+expression+during+light-induced+photoreceptor+cell+death+and+regeneration+in+albino+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish.</a> Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-stage+neuronal+progenitors+in+the+retina+are+radial+Muller+glia+that+function+as+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells.</a> J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).</li>
<li>Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+is+produced+by+dying+retinal+neurons+and+is+required+for+Muller+glia+proliferation+during+zebrafish+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration.</a> J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).</li>
<li>Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Cytoskeleton-+and+Rock-Mediated+INM+Are+Required+for+Photoreceptor+Regeneration+in+the+Adult+Zebrafish+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina.</a> J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).</li>
<li>Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+division+of+zebrafish+Muller+glial+cells+generates+neuronal+progenitors+that+require+N-cadherin+to+regenerate+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons.</a> Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).</li>
<li>Sauer, M. E., Walker, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioautographic+study+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Soc.Exp.Biol.Med%22%5BJournal%5D)">Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube.</a> Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).</li>
<li>Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+modulate+interkinetic+nuclear+movement+in+retinal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells.</a> J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).</li>
<li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).</li>
<li>Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neurogenesis+by+interkinetic+nuclear+migration+through+an+apical-basal+notch+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient.</a> Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).</li>
<li>Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+is+the+main+driver+of+interkinetic+nuclear+migration+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina.</a> Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).</li>
<li>Becker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+chick+retinal+development+in+relation+to+gap+junctional+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication.</a> J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).</li>
<li>Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+maintains+the+quiescent+progenitor+cell+state+of+postnatal+retinal+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia.</a> Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).</li>
<li>Nickerson, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+analysis+of+postnatal+mouse+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development.</a> BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).</li>
<li>Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+photoreceptor+types+in+zebrafish+are+generated+by+symmetric+terminal+divisions+of+dedicated+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li>
<li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Vis%22%5BJournal%5D)">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).</li>
<li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comp.Neurol%22%5BJournal%5D)">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li>
<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
<li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li>
<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les études portant sur les mécanismes régissant la régénération de l&#39;adulte endommagée de la rétine zebrafish méthodes principalement utilisées immunocytochimiques 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mise en place des conditions de culture des explants rétiniens et d&#39;effectuer l&#39;imagerie...

Contrairement aux humains, le poisson zèbre (Danio rerio) présentent une réponse de régénération robuste sur la mort cellulaire des neurones rétiniens 1, 2, 3, 4. Le facteur α de nécrose tumorale, une molécule de signalisation qui est libérée de mourir neurones de la rétine induit Müller glie résidant dans l&#39;basales couche intérieure nucléaire (INL) de la rétine, à proliférer 5 et de produire des cellules souches neuronales qui continuent à proliférer avant de se différencier en cellule neuronale les types qui sont morts 2, 3, 4. Au cours de la phase proliférative de la réaction de régénération, les noyaux des cellules gliales Müller et de leurs cellules progénitrices neuronales dérivées subissent un motif répétitif de migration en phase avec le cycle cellulaire (Interkinetic migration nucléaire, INM) 6 </sup<html> &gt; 7. Nuclei positionné dans le INL basale répliquer leur ADN avant de migrer vers la couche externe nucléaire (ONL) où ils se divisent avant les noyaux résultant retournent basally à l&#39;INL. Ce processus a été décrit pour la première au cours du développement neuroépithélial utilisant des méthodes histologiques, alors que les approches d&#39;imagerie en direct des cellules plus tard confirmé l&#39;interprétation par Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Les deux approches d&#39;imagerie histochimiques et des cellules vivantes ont été utilisées pour déterminer les mécanismes sous - jacents INM et sa fonction dans le développement neuroepithelia y compris la rétine 9, 11, 12, 13. Cependant, les mécanismes régissant INM chez l&#39;adulte régénérant rétine n&#39;a pas été étudiée en profondeurxref &quot;&gt; 6, 7. imagerie des cellules vivantes sera une approche précieuse pour faire progresser notre connaissance des voies de signalisation qui contrôlent l&#39; INM chez l&#39;adulte rétine régénération. Jusqu&#39;à récemment, l&#39; imagerie des cellules vivantes de l&#39; INM dans la rétine est limitée soit à des embryons de poisson zèbre vivants ou embryon de poulet ou de la souris postnatale explants rétiniens 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Alors que explants rétiniens provenant d&#39; animaux adultes d&#39;une variété d&#39;espèces , y compris la souris, le rat et le poisson zèbre ont été utilisés pour la cellule différente des approches biologiques 17, 18, 19, 20, des expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes en utilisant des explants rétiniens have été limité à de brèves périodes de temps et n&#39;ont pas été exécutées en continu pendant plusieurs heures 21, 22. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la culture adulte rétines poisson zèbre lumière endommagée pour effectuer des expériences d&#39;imagerie des cellules vivantes INM de surveillance utilisant la microscopie multi-photon 6. Approches d&#39;imagerie en direct des cellules sont avantageuses par rapport aux méthodes immunohistochimiques lors d&#39; enquêtes sur les mécanismes de contrôle de l&#39; INM, que la dynamique de l&#39; INM, par exemple, les vitesses peuvent être affectées plutôt que l&#39;emplacement de la mitose, ce qui pourrait potentiellement pas être détectée en utilisant immunocytochimie. À l&#39;avenir, cette méthode a aussi le potentiel d&#39;être modifié pour étudier d&#39;autres processus dynamiques au cours de la régénération de la rétine, comme la phagocytose de mourir photorécepteurs par Müller glie ou le comportement de la microglie.

<table><tbody><tr><td>Pince Dumont #5</td><td>World precision instruments</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5, 45 ́angle</td><td>World precision instruments</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas ciseaux</td><td>World precision instruments</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluordishes</td><td>World precision instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ-1B</td><td>type similaire de dissection le stéréomicroscope fonctionnera</td></tr><tr><td>Armoire de sécurité biologique de classe A2</td><td>Le type équivalent</td><td>Labconco</td><td></td> fonctionnera</tr><tr><td>incubateur de culture tissulaire</td><td>Thermoscientifique</td><td>HEPA de classe 100</td> le <td>type équivalent fonctionnera</td></tr><tr><td>Lampes fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & micro ; Filtre pour seringue Acrodisc</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Seringue Luer-lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>60 mL Seringue Luer-lok</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sans Ca2+/Mg2+, sans rouge de phénol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM sans rouge de phénol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval, inactivé thermiquement</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapure à bas point de fusion</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>éthanol, absolu</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-phénoxyéthanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak adhésif pour cellules et tissus</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>indice de réfraction liquide&nbsp ;</td>Le microscope multiphotonique <td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 équipé d’un laser infrarouge MaiTai</td> système équivalent à <td>Nikon</td><td></td><td>fonctionnera</td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’eau longue distance Apo 40X (N.A. 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chambre environnementale équipée d’un insert pour paraboles de 35 mm</td> Le système équivalent <td>à Okolab</td><td></td><td>fonctionnera</td></tr><tr><td>logiciel d’analyse</td> <td>NISNikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

culture des adultes zebrafish retinal explants transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique microscopie

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Un programme de régénération endogène est initiée par Müller glie dans le poisson zèbre adulte (Danio rerio) rétine après une lésion neuronale et la mort. Les gliales Müller ré-entrer dans le cycle cellulaire et produisent des cellules progénitrices neuronales qui subissent les rondes subséquentes de divisions cellulaires et se différencient en types de cellules neuronales perdues. Les deux Müller gliales et cellules progénitrices neuronales noyaux répliquent leur ADN et subissent une mitose dans des endroits distincts de la rétine, soit ils migrent entre la basale couche intérieure nucléaire (INL) et la couche extérieure nucléaire (ONL), respectivement, dans un processus décrit comme Interkinetic migration nucléaire (INM). INM a surtout été étudié dans la rétine en développement. Pour examiner la dynamique de l&#39;INM chez l&#39;adulte régénérant rétine zebrafish en détail, imagerie des cellules vivantes des cellules progénitrices marquées par fluorescence Müller glie / neuronales est nécessaire. Ici, nous fournissons les conditions pour isoler et rétines culture dorsalesde Tg [GFAP: NGFP] zebrafish de mi2004 qui ont été exposés à une lumière intense constante pendant 35 h. Nous montrons également que ces cultures rétiniennes sont viables pour réaliser des expériences d&#39;imagerie en direct des cellules, l&#39; acquisition en continu des images z-stack dans toute l&#39;épaisseur de l&#39;expiant rétinienne jusqu&#39;à 8 h par microscopie multiphoton pour surveiller le comportement migratoire des GFAP: cellules -positifs NGFP . En outre, nous décrivons les détails pour effectuer une analyse post-imagerie pour déterminer la vitesse de l&#39;INM apicale et basale. Pour résumer, nous avons établi des conditions pour étudier la dynamique de l&#39;INM dans un modèle adulte de la régénération neuronale. Cela fera progresser notre compréhension de ce processus cellulaire crucial et nous permettre de déterminer les mécanismes qui contrôlent l&#39;INM.

L&#39;isolement de la rétine selon la procédure décrite dans le schéma de la figure 1 permet la mise en culture d&#39;une rétine dorsale aplatie d&#39;adulte lumière endommagée Tg [GFAP: NGFP] mi2004 zebrafish sur une période d&#39;au moins 24 h dans un 5% de CO 2 / environnement d&#39;air. Ces explants rétiniens montés à plat peuvent être utilisés pour l&#39;image des plans focaux au niveau des tissus profonds. Un exemple est Müller glie /...

la régénération rétinienne Zebrafish a surtout été étudiée en utilisant des rétines fixes. Cependant, les processus dynamiques tels que la migration nucléaire interkinetic se produisent au cours de la réponse régénérative et nécessitent imagerie des cellules vivantes pour étudier les mécanismes sous-jacents. Ici, nous décrivons la culture et d&#39;imagerie conditions pour surveiller Interkinetic Migration nucléaire (INM) en temps réel en utilisant la microscopie multiphoton.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

L'objectif général de cette procédure d'isolement est de permettre l'imagerie de cellules vivantes des cellules prolifératives qui subissent une migration nucléaire interkinétique dans des cultures d'explant de rétine provenant de zebrafish endommagés. Cette méthode peut répondre à des questions clés en matière de régénération rétinienne, telles que les mécanismes responsables de la migration nucléaire interkinétique ou si les cellules gliales de Müller, en tant que cellules progénitrices rétiniennes, voient leur migration nucléaire interkinétique régulée de manière similaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de surveiller le comportement dynamique des cellules prolifératives subissant une migration nucléaire interkinétique durant la régénération, ce qui rend possible l'étude de mécanismes spécifiques à chaque stade du cycle cellulaire.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la migration nucléaire interkinétique, elle peut également être appliquée à d'autres domaines de recherche rétinienne, tels que l'étude du comportement des microglies ou la phagocytose des neurones en cours de mort par les cellules gliales de Müller. Commencez cette

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l'imagerie cellulaire comportements direct durant l'embryogenèse.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Dans cette vidéo, des techniques pour multicolor confocale imagerie time-lapse et l'ablation des cellules ciblées sont fournis. Time-lapse d'imagerie est utilisée pour surveiller le comportement de plusieurs types cellulaires...

Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.

Imagerie cellulaire en direct d&#39;extrusion de l&#39;épiderme du poisson zèbre développement

La vidéo montre une méthode de culture de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre. Les embryons à un stade précoce subissent une dissection pour isoler les yeux, qui sont ensuite dissociés mécaniquement en une suspension de cellules ganglionnaires rétiniennes. Cette suspension cellulaire est cultivée sur des lamelles recouvertes de protéines adhésives pour faciliter le développement des axones.

Génération de cultures de cellules ganglionnaires rétiniennes primaires à partir d’embryons de poisson-zèbre

Source : Lahne, M., et.al. Culture d’explants rétiniens de poisson-zèbre transgénique adulte pour l’imagerie de cellules vivantes par microscopie multiphotonique. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller dans des explants rétiniens de poisson-zèbre inclus dans de l’agarose suite à des lésions des photorécepteurs induites par la lumière. Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) libéré par les photorécepteurs endommagés...

Imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller pendant la régénération rétinienne du poisson-zèbre

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.

Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Nous présentons un protocole efficace et facile à utiliser pour la préparation de cultures de cellules primaires d’embryons de poisson-zèbre pour la transfection et l’imagerie de cellules vivantes, mais aussi un protocole pour préparer les cellules primaires du cerveau adulte poisson-zèbre.

Culture et la Transfection des cellules primaires de poisson-zèbre

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Ce protocole décrit l’utilisation d’un peroxyde d’hydrogène génétiquement codé (H2O2)-biocapteur dans les neurones et les larves de poisson zèbre cultivés pour évaluer les rôles physiologiques de signalisation deH2O2pendant le développement du système nerveux. Il peut être appliqué à différents types de cellules et modifié avec des traitements expérimentaux pour étudier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le développement général.

ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal

Découvrez l'imagerie en cellules vivantes de la migration nucléaire intercinétique dans les explants rétiniens de zebrafish par microscopie multiphotonique. Cette méthode permet d'étudier la régénération rétinienne en temps réel.

Culture des adultes Zebrafish Retinal explants Transgenic pour des cellules vivantes par imagerie multiphotonique Microscopie

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