Mesure et modélisation contractile séchage dans Human stratum corneum

L'objectif général de cette méthode est de quantifier la rigidité mécanique dynamique et l'accumulation des contraintes de dessiccation dans des échantillons ex vivo de stratum corné humain, après différents traitements chimiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biomécanique et de la science des cosmétiques, telles que la manière dont la composition du stratum corné ou le traitement du tissu cutané avec des produits d'hygiène personnelle peut influencer ses propriétés mécaniques et son comportement dynamique de séchage. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle offre une alternative plus rapide par rapport à d'autres méthodes d'évaluation mécanique, nécessite nettement moins de tissu cutané et permet un dessiccation plus physiologiquement pertinent en empêchant l'évaporation par la face inférieure de l'échantillon.

Pour préparer les lamelles recouvertes d'élastomère, préparez tout d'abord le réactif durcisseur Sylgard 184 en mélangeant les composants solides de base et le durcisseur dans un rapport de 55 pour un, jusqu'à obtention d'un mélange homogène. Une masse totale de six grammes est nécessaire. Ensuite, débarrassez la solution des bulles d'air par dégazage.

Ensuite, utilisez la solution pour recouvrir les lamelles à l’aide d’un dispositif de dépôt par rotation. À l’aide d’une pipette à large orifice, déposez un millilitre du mélange au centre d’une lamelle. Faites ensuite tourner la lamelle à 2 000 tr/min pendant 60 secondes.

Préparer cinq ou six lamelles recouvertes de cette manière. Pour polymériser les lamelles, les maintenir dans un four à 60 degrés Celsius pendant 12 heures. Le lendemain, mesurer l'épaisseur des films d'élastomère.

Utilisez une lame de rasoir pour soulever un bord du film d'élastomère du coverslip. Ensuite, utilisez un marqueur indélébile pour marquer la face supérieure du film d'élastomère et le coverslip traité en dessous. Maintenant, à l’aide d’un microscope inversé, mesurez la hauteur Z entre les plans focaux des marques afin de déterminer l’épaisseur des films.

Suivez les procédures standard pour préparer le tissu SC. Pour confectionner les échantillons, prenez des prélèvements de six millimètres de diamètre dans le SC. Sur chaque échantillon, placez une marque au centre de la face la plus externe à l’aide d’un feutre indélébile. Ensuite, déposez des billes marquées fluorescentes sur la surface du SC en faisant flotter les échantillons dans 15 millilitres d’eau contenant environ 90 microlitres de concentré de billes.

Agiter doucement pendant 30 minutes et ajuster la concentration des billes si nécessaire. Après le traitement, plonger chaque échantillon dans l'eau pour le monter sur l'élastomère. Placer une lame couvre-objet revêtue selon un angle faible, de 15 à 30 degrés, sous la SC avec l'élastomère tourné vers le côté inférieur de la SC. Ensuite, soulever la lame couvre-objet de l'eau avec la SC fixée au-dessus, ce qui permet de stratifier en douceur l'échantillon de SC sans plis ni bulles d'air piégées.

Ensuite, faites sécher les échantillons montés dans des conditions ambiantes pendant environ une heure. Une fois séchés, transférez les échantillons dans une chambre hermétiquement scellée contenant un récipient d'eau. Laissez les échantillons s'équilibrer avec l'humidité pendant 24 heures.

Le lendemain, monter un échantillon sur une chambre de perfusion pour une séance d'imagerie prolongée. Placer la chambre de perfusion au-dessus du substrat et sceller les bords de la chambre à l'élastomère à l'aide de graisse à vide. Ensuite, enregistrer des images en fluorescence et en lumière transmise avec un champ de vision suffisamment large pour capturer l'intégralité de l'échantillon de SC.

Au cours des 16 prochaines heures, prendre une image toutes les 10 minutes. Dans une hotte chimique, charger une petite capsule en plastique avec un millilitre de silane. Placer la capsule dans un récipient hermétique contenant une lame de verre recouverte d'un élastomère, sans contact direct.

Laisser incuber à température ambiante pendant cinq heures. Pendant l'attente, préparer 20 millilitres de solution de billes selon le protocole indiqué dans le texte, puis verser la solution dans une boîte de 10 centimètres de diamètre. Après cinq heures, placer lentement les substrats silanisés, côté élastomère vers le bas, dans la solution de billes.

Chargez deux substrats dans chaque boîte et laissez les substrats réagir avec les billes pendant 45 minutes. Ensuite, à l’aide de pinces, retirez les substrats et rincez-les à l’eau distillée pour éliminer les billes non liées. Puis séchez-les sous un flux doux d’air comprimé et stockez-les dans une boîte hermétique et opaque.

En utilisant la technique précédemment décrite, transférez les échantillons de CS sur un substrat traité dans un bain d'eau. Immédiatement après le montage du CS, appliquez une goutte de cinq microlitres de solution de billes marquées fluorescentes non diluée sur celui-ci. Laissez ensuite le CS sécher pendant 60 minutes.

Maintenant, mesurez l'épaisseur de la SC à l'aide du microscope équipé d'un objectif 40x dans une chambre de perfusion. Mesurez l'épaisseur de la SC au cours du temps, en utilisant un accessoire de mise au point à distance pour enregistrer la différence de hauteur en Z entre les deux couches de billes. Une couche se situe à l'interface substrat-SC et l'autre est située au-dessus de la SC. À l'aide des techniques décrites, un échantillon de SC a été préparé et recouvert de billes fluorescentes.

Après 16 heures de séchage à 25 % d'humidité relative, les déplacements ont été mesurés. En raison de la symétrie circulaire des échantillons, ces déplacements ont été moyennés de manière azimutale. Tout au long du séchage, les déplacements azimutaux restent faibles.

Les profils de déplacement radial, cependant, augmentaient de manière monotone du centre vers le bord et croissaient en amplitude jusqu'à l'atteinte d'un équilibre. Les profils enregistrés à des intervalles de 30 minutes montrent l'évolution temporelle des déplacements dans le plan. L'épaisseur moyenne de la couche cornée diminuait durant le séchage, principalement au cours des deux premières heures.

La dynamique du séchage a ensuite été analysée en ajustant les profils de déplacement à un modèle de contractilité linéaire et élastique, en utilisant une méthode des moindres carrés minimaux. À partir du modèle, on a extrait la contrainte de séchage contractile ainsi que le module d'élasticité. Les deux paramètres ont augmenté rapidement durant les deux premières heures de séchage.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien se rappeler d'adhérer complètement les échantillons sur le substrat. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la coloration des lipides peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple comment certains traitements cosmétiques modifient la composition lipidique des tissus.