Modélisation Comportement cancer de l'ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

L’objectif global de cette procédure est de créer une plateforme de co-culture dynamique basée sur la microfluidique pour émuler l’environnement intrapéritonéal avec les composants cellulaires et mécaniques où se produisent les métastases du cancer de l’ovaire. En utilisant ce micro pour cette plateforme, il permet de répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que le microenvironnement de la dissémination péritonéale. Le principal avantage de cette technique est qu’une co-culture 3D sous flux libre contrôlé avec précision imite mieux la communication in vivo entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les cellules méthothédiennes qui se produit dans une cavité péritonéale.

Après avoir conçu et dessiné le motif du canal microfluidique et l’avoir produit conformément au protocole de texte, appliquez une couche de SU82075 Photoresist sur la plaquette de silicone à une vitesse de rotation de 1800 tr/min. Faites cuire la plaquette enrobée de photorésine directement sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Et puis à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes pour éliminer l’excès de solvant.

Appliquez une deuxième couche de SU82075 Photoresist sur la plaquette pour une épaisseur finale de 250 micromètres. Placez la plaquette revêtue de photorésine directement sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant sept minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de refroidir lentement la plaquette à température ambiante. Ensuite, alignez et placez le masque photo directement sur la plaquette.

Ensuite, exposez-le à la lumière UV pendant 20 secondes pour traverser la longueur du motif. Sur une plaque chauffante, faites cuire la gaufrette enrobée à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes et à 95 degrés Celsius pendant 12 minutes pour éliminer le solvant pour la pré-numérisation. Retirez la résine photosensible non transversale en immergeant la plaquette dans un révélateur SU8 pendant 25 minutes.

Ensuite, avec de l’isopropanal, rincez la plaquette et utilisez de l’air sous pression pour la sécher. Combinez la base de polydiméthylsiloxane ou de PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport massique de 10 pour un et utilisez le mélangeur centrifuge sous la fonction de mélange et de dégazage pour mélanger la solution. Versez lentement le mélange PDMS sur la plaquette jusqu’à une hauteur d’environ cinq millimètres.

Dégazez le PDMS dans un dessiccateur sous vide pendant 40 minutes. Ensuite, faites durcir le PDMS au four à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Décollez soigneusement la dalle PDMS du maître et coupez le PDMS le long des canaux jusqu’à ce qu’il ait la taille d’une lame de verre.

Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie d’un millimètre, poinçonnez le PDMS pour créer les entrées et les sorties de l’appareil. Utilisez de l’air sous pression pour nettoyer la surface du PDMS, puis avec du ruban adhésif, enlevez la poussière et les débris PDMS. Placez maintenant la dalle PDMS avec le côté du canal vers le haut dans un nettoyeur plasma.

Positionnez ensuite une lame de verre propre dans le nettoyeur plasma le long de la dalle PDMS. Traitez le PDMS et la lame de verre sous plasma d’air à un niveau de radiofréquence ou RF élevé pendant une minute. Ensuite, après avoir retiré les échantillons du nettoyeur plasma, liez le PDMS à la lame de verre pour créer une liaison covalente irréversible.

Placez la puce PDMS sur une plaque chauffante à 150 degrés Celsius pendant une heure pour améliorer la force de liaison et rétablir l’hydrophobicité du PDMS avant utilisation. Pour enrober les canaux microfluidiques de fibronectine, commencez par utiliser 30 microlitres d’éthanol à 75 % pour stériliser les canaux. Retirez l’éthanol et utilisez du PBS pour rincer les canaux deux fois.

Ensuite, aspirez soigneusement le PBS des chaînes. Préparez 10 microgrammes par millilitre de solution de fibronectine dans un milieu M199MCDB105 sans sérum avec 30 microlitres de solution, remplissez lentement les canaux et utilisez du ruban adhésif pour les sceller. Ensuite, incubez la puce à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Pour ensemencer des cellules mésothéliales péritonéales primaires ou HPMC dans les canaux microfluidiques, après avoir rincé les cellules cultivées conformément au protocole textuel, utilisez deux millilitres de milieu de culture 10 % FBS pour remettre les HPMC en suspension. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et ajustez la concentration cellulaire à 3,5 fois 10 à six cellules par millilitre. Réchauffez la puce microfluidique enrobée de fibronectine dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de l’utiliser.

Ensuite, aspirez complètement la solution de fibronectine et pipetez lentement 30 microlitres de suspension HPMC dans chaque canal. Utilisez du ruban adhésif pour sceller les canaux et placez l’appareil dans l’incubateur de CO2 pendant la nuit. Pour induire la formation de sphéroïdes du cancer de l’ovaire, dissoudre 0,5 % d’agarose dans de l’eau stérilisée.

Versez 50 microlitres de la solution d’agarose dans les puits de 96 plaques de puits. Après avoir compté les cellules cancéreuses épithéliales humaines préalablement cultivées, remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture FBS à 5 % à une densité de 5 000 cellules par millilitre. Transférez 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits enrobé d’agarose.

Et cultivez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 48 heures. Transférez les sphéroïdes cancéreux dans un tube à centrifuger de 50 millilitres pré-humidifié avec un millilitre de milieu sans sérum et faites tourner les sphéroïdes à 750 fois G pendant cinq minutes. Suite à la préparation de 2,5 microgrammes par millilitre de solution de CMFDA dans un milieu M199MCDB105 sans sérum.

Remettez les sphéroïdes cancéreux en suspension dans un millilitre de solution et incubez les sphéroïdes à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Comptez ensuite le nombre de sphéroïdes et utilisez un milieu sans sérum pour ajuster la concentration à 2 000 sphéroïdes par millilitre. Avant la mise en charge des sphéroïdes, injectez lentement 100 microlitres de milieu de M199MCDB105 sans sérum pour éliminer les cellules mésothéles non adhérentes à l’intérieur des canaux.

Chargez 30 microlitres de suspension sphéroïde marquée fluorescente dans chaque canal. Placez ensuite la puce microfluidique dans l’incubateur de CO2. Assemblez une plate-forme de profusion en fixant une seringue chargée de M199MCDB105 moyen frais sans sérum à un tube d’un mètre de long.

Placez la seringue sur le pousse-seringue et fixez le piston et le corps de la seringue. Installez ensuite le pousse-seringue en position horizontale à la même hauteur que la puce microfluidique à l’intérieur de l’incubateur. Infusez rapidement tout le tube avec du fluide en appuyant sur le bouton d’avance rapide et en le maintenant enfoncé jusqu’à ce que le fluide déborde dans le tube.

Exécutez ensuite l’injection au débit souhaité. Connectez le tube à l’entrée du canal selon le protocole texte. Ensuite, utilisez un tube à sortie courte pour connecter la sortie du canal à un tube conique de 50 millilitres pour recueillir le fluide de sortie.

Enfin, utilisez un microscope à champ clair ou à fluorescence pour observer les HPMC et les sphéroïdes cancéreux. À l’aide de la plateforme microfluidique décrite dans cette vidéo, des sphéroïdes du cancer de l’ovaire ont été modélisés avec des cellules mésothéliales dans des conditions hydrodynamiques. Comme le montre cette figure, les cellules mésothéliales qui ont été cultivées dans le microdispositif pendant 16 heures ont réussi à former une monocouche de HPMC.

Dans cette expérience, des sphéroïdes multicellulaires d’un diamètre d’environ 100 micromètres, de taille similaire à ceux trouvés dans les sociétés de patients, ont été marqués avec un colorant fluorescent vert CMFDA. Les sphéroïdes ont ensuite été transférés dans des canaux microfluidiques recouverts de HPMC et sont restés en suspension et les morphologies cellulaires ont été capturées. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en quelques heures sur trois jours si elle est bien exécutée.

Une personne sur 10 dans cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter d’introduire des bulles d’air dans les canaux microfluidiques. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que le traitement médicamenteux, les tests d’adhésion, les tests de clairance de la mésothélium, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, comme l’effet du microenvironnement intropéritonéal sur la progression du cancer. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer la méstase péritonéale chez l’homme.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer un microdispositif péritonéal avec un flux fluidique pour commencer le comportement du cancer de l’ovaire dans la cavité péritonéale. N’oubliez pas que travailler avec des soufres organiques tels que l’acétone, en tant que révélateur et cyline peut être extrêmement dangereux. Des précautions MP telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire doivent toujours être prises lorsque vous effectuez cette procédure pour la première fois.

Toutes les procédures concernant ce bureau doivent être effectuées sous une couverture extrême.