Traitement des constructions de ligament avec un sérum conditionné par l'exercice: un modèle d'ingénierie des tissus de traduction

L’objectif global de ce modèle est de déterminer l’impact de l’exercice et de la nutrition sur la synthèse et la fonction du tissu conjonctif. Cette technique utilise du sérum humain qui est prélevé avant et après l’exercice afin de traiter les tissus 3D, afin que nous puissions comprendre comment l’exercice affecte la fonction des ligaments et des tendons. La sécurisation tissulaire 3D combine les avantages d’essais in vitro bien caractérisés avec la fonction, la morphologie et les caractéristiques biochimiques des tissus in vivo.

Après avoir préparé à l’avance des plaques de 35 millimètres recouvertes de silicone selon le protocole de texte, préparez les moules d’ancrage en plaçant une goupille de minutien au centre de chaque puits cylindrique dans les moules. Combinez une solution de phosphate bêta-tricalcique et d’acide citrique orthophosphorique à raison d’un à trois grammes par millilitre dans un bateau de pesée en plastique sur glace. Utilisez un grattoir à cellules en plastique pour mélanger vigoureusement le ciment.

Triturez le ciment pour continuer à mélanger, et pipetez le mélange dans les moules, puis centrifugez le moule rempli à 2, 250 fois g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, les ancrages de ciment Brushite restent à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, retirez les ancres du moule et épinglez deux ancres, espacées de 12 millimètres, dans chaque plaque recouverte de silicone.

Stérilisez les plaques épinglées en les vaporisant avec de l’éthanol à 70 %, en remplissant à la fois les plaques et les couvercles, puis placez les plaques dans une enceinte de sécurité biologique, ou BSC. Après au moins 30 minutes, aspirez les plaques et laissez-les essayer dans le BSC. Replacez les couvercles et rangez-les dans le BSC jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Respectez les réglementations locales en matière de risques biologiques pour une utilisation et une élimination appropriées des matières biologiques. Maintenir la stérilité et effectuer les étapes de formation des constructions dans une enceinte de sécurité biologique. Après avoir préparé des fibroblastes primaires, des réactifs et des plaques recouvertes de silicium avec des ancres de brushite épinglées, selon le protocole de texte, cultivez les cellules en plaques de 15 centimètres à 70 % de confluence.

Ensuite, préparez un mélange maître composé des éléments suivants, 681 microlitres par construction de suspension cellulaire, 29 microlitres par construction de thrombine, deux microlitres par construction d’aprotinine et deux microlitres par construction d’acide aminohexanoïque. Après avoir bien mélangé la solution, ajoutez 714 microlitres à chaque plaque épinglée en forme de huit autour des ancrages de ciment brushite, en vous assurant que le mélange principal entre directement en contact avec les côtés des ancrages. Tapotez doucement chaque assiette pour répartir uniformément le mélange.

L’étape la plus critique consiste à former le gel de fibrine fixé dans les cellules. Assurez-vous que le mélange principal des sièges de cellule entre directement en contact avec les ancrages et tapotez la plaque pour répartir uniformément le mélange. Une assiette à la fois, ajoutez 286 microlitres de fibrinogène de manière égale sur l’assiette.

Faites glisser immédiatement la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir le fibrinogène afin de former les gels de fibrine intégrés dans les cellules, puis passez à la plaque suivante. Placez les constructions dans un incubateur stérile maintenu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, et incubez-les pendant au moins 15 minutes pour permettre la polymérisation du fibrinogène. Préparez deux millilitres par construction de milieu d’alimentation en complétant le milieu de croissance avec 200 micromoles d’acide ascorbique, 50 micromoles de Prolène et cinq nanogrammes par millilitre de TGF bêta-1.

Utilisez deux millilitres de milieu d’alimentation pour couvrir chaque construction, et cultivez les constructions dans un incubateur stérile maintenu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant un total de 14 jours, ou jusqu’au point final souhaité, en rafraîchissant le milieu tous les deux jours avec deux millilitres de milieu d’alimentation. Pour prélever du sérum humain, prélevez un échantillon de sang au repos selon le protocole textuel, puis demandez aux participants d’effectuer un mode d’exercice qui correspond à votre objectif de recherche. Voici une séance de 30 minutes d’exercice de résistance de haute intensité.

Prélevez un échantillon de sang 15 minutes après la séance d’exercice, puis après avoir laissé le sang coaguler, faites tourner l’échantillon à 1 500 fois g pendant 10 minutes. Dans des conditions stériles, transférez le sérum dans des tubes stériles pour la préparation des milieux. Après la préparation des constructions ligamentaires, effectuer des essais de traction à l’aide d’un testeur de traction dans un bain PBS avec des mâchoires moulées inversées qui sont couplées au capteur de force.

Cela maintient les ancrages en ciment brushite en place pendant le test. À l’aide d’un pied à coulisse numérique, déterminez la longueur et le avec des constructions ligamentaires, et calculez la section transversale du tissu. Détachez la construction ligamentaire de la plaque et placez les ancrages dans les poignées moulées inversées, en vous assurant que la construction est immergée dans le PBS, puis ajustez la distance entre les prises, en réglant la longueur de la construction à sa longueur initiale.

Commencez l’essai et déformez la construction jusqu’à la défaillance à une vitesse de déformation de 0,4 millimètre par seconde, ou 3 % par seconde. Après le test, traitez le tissu et effectuez la quantification du collagène des ligaments modifiés selon le protocole de texte. Après un à deux jours de culture, les fibroblastes du LCA se sont attachés au gel de fibrine, ont prolongé les processus cellulaires et ont commencé à exercer des forces de traction.

Une tension est générée entre les deux points d’ancrage, et les cellules s’alignent parallèlement à cet axe, et commencent à déposer du collagène. Voici un graphique représentatif de contrainte et de déformation pour un ligament testé jusqu’à l’échec. Dans ces expériences, le sérum humain a été isolé à partir d’échantillons de sang avant et après l’exercice et utilisé à la place du FBS pour générer des milieux enrichis du milieu biochimique induit par l’exercice.

Comme le montre ce graphique, après une période de culture de 14 jours, les constructions ligamentaires ont démontré une augmentation significative de la charge de traction maximale et de la teneur en collagène en réponse au sérum post-exercice. Une fois maîtrisées, les constructions ligamentaires peuvent être réalisées en deux jours et seront prêtes pour les tests de traction, la quantification de la teneur en collagène et d’autres analyses biochimiques dans deux semaines. Ce modèle translationnel in vitro in vivo fait partie d’une mission plus large visant à comprendre comment l’exercice améliore la fonction des ligaments, des tendons et, en fait, de presque tous les tissus du corps.

Il s’agit donc d’une technique très robuste et forte où nous pouvons déterminer la teneur en collagène et la fonction du tissu conjonctif après des traitements avec de l’exercice, de la nutrition, de la charge, tous les types de facteurs de croissance, tous les types d’interventions différentes que nous pouvons faire chez les humains ou les animaux.