Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

L'objectif général de ce protocole est de permettre aux chercheurs de capturer, séparer et analyser des complexes protéiques natifs extraits de lysats tissulaires à l'aide de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode peut aider les chercheurs qui étudient les protéines, car elle est capable de stabiliser des associations protéiques autrement labiles dans des conditions proches des conditions natives, permettant ainsi leur identification et une analyse ultérieure. Le principal avantage de cette technique est qu'elle utilise des méthodes biologiques courantes, ce qui la rend largement applicable et adaptable aux objectifs de chaque chercheur.

Pour commencer cette procédure, préparez la électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions natives avec colorant bleu comme décrit dans le protocole écrit. Connectez les électrodes à l'alimentation électrique et faites migrer les protéines dans le gel à 150 volts jusqu'à ce que la bande colorante progresse d'environ deux centimètres dans la couche de séparation. À ce stade, arrêtez et débranchez l'alimentation électrique.

Après avoir démonté l'appareil d'électrophorèse, séparez les plaques de verre de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche de superposition. Découpez soigneusement le gel juste en dessous du bord inférieur du front de colorant, en veillant à ce que cette coupe soit aussi lisse et droite que possible.

Ensuite, jetez le morceau inutilisé du gel. Retirez soigneusement les parties inutilisées situées sur les bords de la bande de gel. Placez délicatement la bande dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans un petit récipient et mélangez doucement par agitation pendant 30 minutes afin de l'équilibrer.

Après l'équilibrage, jeter le PBS et le remplacer par 10 millilitres supplémentaires. Ajouter 500 microlitres de DSP à 25 millimolaire dissous dans le diméthylsulfoxyde dans le PBS et poursuivre le mélange comme précédemment pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, verser délicatement la solution de DSP.

Ajouter 10 millilitres de HCl 0,375 molaire, pH 8,8, contenant 2 % de dodécylsulfate de sodium pour bloquer le DSP non réagi. Poursuivre l'incubation pendant 15 minutes. Pendant que la bande de gel est en cours de blocage, préparer les solutions de gel SDS-PAGE selon les méthodes standard.

Ne pas ajouter les réactifs de polymérisation. Après le blocage, ramener la bande de gel natif bleu à température ambiante et insérer la bande dans une nouvelle cassette de gel. Pour ce faire, soulever délicatement le gel et le placer sur une plaque d'espacement propre pour cassette de gel.

Positionnez la bande de manière à ce qu'elle soit retournée par rapport à son orientation précédente et que le bord inférieur du front de colorant soit le plus proche du haut de la nouvelle cassette. Placez la bande de sorte que son bord supérieur soit aligné avec l'endroit où se trouvera le bord supérieur de la plaque de couverture. Assurez-vous que le front de colorant soit parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre.

Appuyez un côté de la bande excisée contre l'une des parois d'espacement, en laissant de la place de l'autre côté pour verser le gel et charger une référence protéique ou une échelle de poids moléculaire. Si le bord inférieur de la bande de gel présente des zones irrégulières ou découpées, retirez-les soigneusement. Une fois la bande de gel correctement positionnée, placez la plaque de couverture par-dessus la plaque d'espacement.

Appliquez une pression douce pour expulser les bulles d'air éventuellement piégées. Continuez à monter l'appareil de coulée des gels conformément aux instructions du fabricant. La bande de gel peut parfois se déplacer lors de la mise en place de la plaque supérieure.

Il est utile de laisser la bande dépasser légèrement du bord de la plaque supérieure afin de pouvoir l'ajuster à l’aide d'une spatule pour corriger tout déplacement. Ajouter les réactifs de polymérisation au tampon du gel de résolution et verser dans la cassette de gel préparée à l’aide d’une pipette serologique. Remplir la cassette de gel jusqu’à environ deux centimètres sous la bande de gel de PAGE natif bleu excisée, afin de laisser de la place pour la couche de concentration.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de butanol par-dessus le gel versé et laissez 30 minutes pour la polymérisation de la couche de séparation avant de retirer le butanol. Puis, ajoutez les réactifs de polymérisation à la solution du gel de concentration. À l’aide d’une pipette serologique, versez la couche de concentration pour remplir tout l’espace vide restant dans la cassette du gel.

Inclinez la cassette à gel pendant que la couche de concentration est versée afin qu'elle remplisse l'espace sous la bande de gel et que les bulles d'air ne soient pas piégées. Au fur et à mesure que le tampon du gel de concentration remplit l'espace vide sous la bande de gel, redressez progressivement la cassette à gel jusqu'à ce qu'elle soit à nouveau à l'horizontale. Continuez à remplir l'espace adjacent à la bande de gel excisée avec le tampon du gel de concentration jusqu'à ce qu'il soit presque plein.

Ensuite, laisser polymériser la couche de concentration pendant 30 minutes. Une fois la polymérisation de la couche de concentration terminée, retirer la cassette de gel de l'appareil de coulée, la rincer avec de l'eau distillée et monter l'appareil d'électrophorèse conformément aux instructions du fabricant. Remplir complètement la chambre intérieure avec du tampon de migration SDS-PAGE 1x.

Ensuite, remplir la chambre externe jusqu'au niveau indiqué par le fabricant. Charger l'espace adjacent à la bande de gel excisée avec un marqueur de poids moléculaire ou l'étalon protéique approprié. Fixer les électrodes à l'alimentation électrique et faire migrer les échantillons par électrophorèse à 120 volts.

Lorsque le colorant Coomassie sort du gel, arrêtez l'électrophorèse et débranchez l'alimentation électrique. Analysez le gel en utilisant des méthodes standard de transfert électrophorétique et de détection protéique par anticorps. La validation de l'électrophorèse multimérique (multimer-PAGE) est illustrée ici par immunotransfert.

Le complexe kinésine capturé est clivé par le diphyo-3-itol, ce qui montre que les agrégats de haut poids moléculaire sont formés par réticulation de sous-unités plus petites. Ici, on observe que des lysats cérébraux traités à des concentrations croissantes de SDS ou de Triton présentent une détection accrue de l'alpha-synucléine monomérique, tandis que la détection du tétramère oligomérique soluble diminue. Des résultats représentatifs de l'électrophorèse multimer-PAGE utilisée pour capturer les complexes solubles dans un lysat cérébral de rat sont présentés ici.

Les protéines ont été détectées par immunotransfert. Le poids monomérique attendu de chaque protéine est indiqué sous les pistes. De même, l'capture des complexes liés à la membrane est montrée ici.

La PAGE en multimerés ne parvient parfois pas à détecter un complexe, comme le montre le double transfert du complexe respiratoire SDHA. Une discussion sur les explications possibles de ce phénomène est abordée dans le protocole textuel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ huit heures si elle est effectuée correctement.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière réaliser une réticulation en gel de complexes protéiques natifs, suivie d’un re-moulage du gel et d’une séparation par SDS-PAGE secondaire. N’oubliez pas que le travail avec l’acrylamide peut être extrêmement dangereux et que des équipements de protection individuelle doivent être portés lors du coulage du gel. Après cette procédure, les complexes stabilisés séparés peuvent être élusés ou découpés dans le gel et analysés par diverses méthodes, notamment la détection immunologique ou la spectrométrie de masse, selon les besoins du chercheur.