Name: Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Découvrez la capture et la résolution de complexes protéiques natifs à partir de lysats tissulaires par électrophorèse bidimensionnelle. Cette méthode stabilise les associations protéiques labiles pour leur analyse en conditions quasi-natives.

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Pris en charge par le NIH / NIDA DA034783. Nous tenons à remercier Bryan A. Killinger d&#39;assistance technique avec le multimère-PAGE.

1. Préparation du tissu <ol><li> Préparer 10 ml de 4x tampon d&#39;échantillon BN-PAGE (200 mM de bis (2-hydroxyéthyl) amino-tris (hydroxyméthyl) méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p / v de glycerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ). NOTE: Cette solution mère peut être faite à l&#39;avance et conservé à 4 ° C. </li><li> Diluer 250 ul de tampon d&#39;échantillon 4x dans 750 ul dH 2 O contenant un cocktail d&#39;inhibiteurs de proteases commerciales 1x. Vortex et laisser refroidir sur la glace. </li><li> Homogénéiser 20 mg de tissu cible dans le 1 mL 1x glacée tampon d&#39;échantillon BN-PAGE avec 30 coups d&#39;un homogénéisateur Dounce propre. NOTE: Pour cette expérience de démonstration, le tissu cible est l&#39;ensemble des tissus du cerveau de rat. Après homogénéisation, les échantillons peuvent être traités avec un détergent doux tel que 2% de digitonine pour solubiliser et permettre l&#39;électrophorèse des protéines de la membrane. </li><li> Transférer le broyat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, et centrifuger à 14 000 xg pendant 30 min pour sédimenter contenus cellulaires insolubles. AFTEcentrifugation r, décanter le surnageant dans un tube propre sur la glace. </li><li> Suivre les instructions du fabricant pour mesurer la concentration de protéine surnageant en utilisant l&#39;acide bicinchoninique (BCA) ou une analyse de protéine de quantification similaire. </li><li> Si l&#39;échantillon d&#39;homogénat (s) contient un détergent, ajouter une quantité de 5% de bleu de Coomassie G-250 en solution aqueuse suffisante pour amener la solution d&#39;homogénat à 0,25% de Coomassie. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> Diluer 25 ml 20x native bleu (BN) électrophorèse stock tampon (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) dans 475 ml de dH 2 O contenant 0,002% de bleu de Coomassie pour faire 500 ml de 1 x tampon de migration. <ol><li> Si les échantillons contiennent du détergent, à la place faire 250 ml de tampon de migration 1x contenant 0,02% de Coomassie et 250 mL contenant aucun. </li></ol></li><li> tampon Chill (s) à 4 ° C. </li><li> Nettoyer et assembler une cassette de coulée du gel de polyacrylamide selon les instructions du fabricant. </li><li&gt; Pour gel de polyacrylamide BN (3% T couche d&#39;empilement, 6% T couche de résolution) selon une recette de référence 7, et placer le peigne de puits. </li><li> Après que les gels ont polymérisé, rincer la cassette avec dH 2 O et d&#39; assembler l&#39;appareil d&#39;électrophorèse selon les instructions du fabricant. </li><li> Retirez le bien peigne et remplir les puits avec 1x tampon de fonctionnement BN-PAGE. Éviter de remplir la totalité de la chambre intérieure avec un tampon jusqu&#39;à ce que les échantillons sont chargés. <ol><li> Si les échantillons contiennent du détergent, remplir les puits avec le tampon contenant 0,02% de bleu de Coomassie. REMARQUE: Effectuez les étapes 2/7 à 2/9 à 4 ° C. </li></ol></li><li> En utilisant des pointes de chargement de gel, une pipette d&#39;un volume d&#39;homogénat contenant 20 ug de protéine dans les puits souhaités. Pipeter un volume équivalent de tampon d&#39;échantillon 1x BN-PAGE dans des puits non utilisés. REMARQUE: Utiliser la concentration en protéine déterminée à partir du dosage BCA pour calculer le volume approprié de l&#39;homogénat à ajouter àles puits. </li><li> Après échantillons sont chargés, remplir la chambre intérieure avec un tampon de course 1x BN-PAGE. Assurez - vous que le gel est entièrement immergé dans un tampon. Ensuite, remplir la chambre externe avec un tampon de course 1x au niveau indiqué par le constructeur. <ol><li> Si les échantillons contiennent du détergent, remplir la chambre intérieure avec le tampon 1x contenant 0,02% de bleu de Coomassie, et la chambre extérieure avec un tampon en cours d&#39;exécution 1x sans colorant. </li></ol></li><li> Connecter les électrodes à l&#39;alimentation électrique, et l&#39;électrophorèse des protéines dans le gel à 150 V jusqu&#39;à ce que la bande de colorant progresse ~ 2 cm dans la résolution de couche. Arrêtez et débranchez l&#39;alimentation. </li></ol> 3. La réticulation REMARQUE: Effectuez les étapes 03.01 à 03.06 à 4 ° C. <ol><li> Désassembler l&#39;appareil d&#39;électrophorèse, et à séparer les panneaux de verre de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d&#39;empilement. </li><li> Couper avec soin le gel juste en dessous du bord inférieur de la face de colorant. PrendreVeillez à ce que cette coupe soit aussi lisse et droite que possible, puis jettez le morceau de gel non utilisé. Cela laissera une bande horizontale de gel de polyacrylamide de ~ 2 cm de large, qui contiendra toutes les protéines dans l&#39;échantillon homogénat. </li><li> Découper toutes les portions inutilisées le long des bords de la bande de gel. </li><li> Placez soigneusement la bande dans 10 mL de solution salée tamponnée au phosphate (PBS) dans un petit récipient et mélangez délicatement par nutation pendant 30 minutes pour équilibrer. </li><li> Après équilibrage, jeter et remplacer le PBS par 10 mL supplémentaires. Pipetter 500 μL de DSP 25 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde dans le PBS et continuer à mélanger comme ci-dessus (étape 3.4) pendant 30 min. </li><li> Verser la solution DSP. Ajouter 10 ml de chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contenant 2% de dodécylsulfate de sodium (SDS) pour étancher le DSP n&#39;ayant pas réagi. Continuer la nutation pendant 15 min. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Alors que la bande de gel trempe, prépare SDS-PASolutions de gel GE selon des méthodes standard 9. Ne pas ajouter des réactifs de polymérisation. </li><li> Après la trempe, le retour de la bande de gel ΒΝ à la température ambiante, et la bande coulée dans une nouvelle cassette de gel. <ol><li> Pour ce faire, choisissez soigneusement le gel et le placer sur une plaque d&#39;espacement de cassette de gel propre. </li><li> Orient la bande de sorte que le fond du front de colorant est la plus proche de la partie supérieure de cassette ( à savoir le côté qui a voyagé le plus loin au cours de BN-PAGE devrait être plus proche de la partie supérieure de la nouvelle cassette, la bande de gel doit être retourné à partir de son avant orientation). Voir la figure 3. </li><li> Placer la bande de telle sorte que son bord supérieur se trouve même où le bord supérieur de la plaque de recouvrement sera ( à savoir, il sera dans le haut du nouveau gel). Assurez-vous que le front de colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre. </li><li> Appuyez sur une face de la bande excisée contre l&#39;une des parois d&#39;entretoise, laissant la place à til autre côté pour le gel à couler et à un niveau de protéine ou une échelle à charger. </li><li> Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones crénelés ou inégaux, les couper à une distance soigneusement. Le cas échéant, ils bulles piège lors de la coulée du gel. </li><li> Une fois que la bande de gel est positionnée correctement, fixer la plaque de recouvrement au-dessus de la plaque d&#39;espacement. Appliquer une légère pression pour pousser les bulles d&#39;air piégées. </li><li> Continuer d&#39;assembler l&#39;appareil de coulage de gel conformément aux instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Ajouter des réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution, et le verser dans la cassette de gel préparé, en utilisant une pipette sérologique. Remplir la cassette de gel de ~ 2 cm au-dessous de la bande de gel excisée BN-PAGE, afin de laisser la place à la couche d&#39;empilement. </li><li> Ajouter 100 pL de butanol sur le dessus du gel coulé, et laisser 30 min pour la polymérisation de la couche de résolution. Décanter le butanol. </li><li> Ajouter des réactifs de polymérisation à la solution de gel d&#39;empilement. L&#39; utilisation d&#39; un serologpipette ical, verser la couche d&#39;empilement pour remplir tout l&#39;espace vide restant dans la cassette de gel. <ol><li> Incliner la cassette de gel en tant que couche d&#39;empilement est versée afin de remplir l&#39;espace au-dessous de la bande de gel, et des bulles d&#39;air ne sont pas pris au piège. </li><li> Comme le tampon de gel d&#39;empilement remplit l&#39;espace vide en dessous de la bande de gel, retourner progressivement la cassette de gel au pied de niveau. </li><li> Continuer de remplir l&#39;espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel d&#39;empilement, jusqu&#39;à ce qu&#39;il déborde à peu près. </li></ol></li><li> Laisser la couche d&#39;empilement pour polymériser pendant 30 minutes. REMARQUE: Faire un tampon en cours d&#39;exécution 10x SDS-PAGE (250 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (tris), de la glycine 1,9 M, SDS 1%), tandis que le gel est la polymérisation. Cela peut aussi être fait à l&#39;avance et conservé à température ambiante. </li><li> Diluez 50 mL 10X stock tampon de fonctionnement SDS-PAGE dans 450 ml dH 2 O pour faire tampon de travail 1x. </li><li> Après que la couche d&#39;empilement est polymérisé, retirer la cassette de gel de la couléeAppareil, rincer avec dH 2 O, et assembler l&#39;appareil d&#39;électrophorèse selon les instructions du fabricant. </li><li> Remplir complètement la chambre intérieure avec un tampon de course 1x SDS-PAGE, puis remplir la chambre extérieure au niveau indiqué par le constructeur. </li><li> Charger l&#39;espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou de la norme de protéine appropriée. </li><li> Attacher les électrodes à l&#39;alimentation électrique, et l&#39;électrophorèse des échantillons à 120 V. Lorsque le colorant Coomassie coule le gel, arrêter et couper l&#39;alimentation électrique. </li><li> Analyse du gel en utilisant des procédés standard de détection et électrotransfert des protéines par liaison de l&#39; anticorps 10. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l&#39;objet d&#39;un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l&#39;analyse d&#39;une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l&#39; étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine 11. Cependant, il est extensible à de nombreux complexes ...

<html> La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine 1, 2. En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l&#39;assemblage et le comportement de différents complexes protéiques 3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d&#39;interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chromatographie 4. Ces méthodes sont de temps, doivent être modifiés pour chaque protéine cible, et donnent souvent lieu à des rendements faibles. Méthodes de purification modernes impliquent la fusion des balises de peptides à des protéines cibles, suivie par une immunoprécipitation ou par extraction sur des colonnes chargées avec des billes liées à une molécule de capture 5,« &gt; 6. Bien que ce soit extensible à de nombreuses protéines, il nécessite une modification de la séquence de la cible, ce qui pourrait entraîner des constructions qui diffèrent par affinité pour leurs partenaires de liaison habituels. La nature délicate de certaines interactions protéine-protéine signifie que cette méthode ne peut pas être applicable de nombreux scénarios. de plus, les tests déroulants utilisés pour cartographier les interactions protéine-protéine ne peut pas capturer une image précise cellulaire, en raison de degrés de liberté restreints et les niveaux non natifs de la protéine appât. Idéalement, les complexes de protéines pourraient être détectés dans leur état d&#39;origine, sans nécessiter de purification ou de tirer vers le bas. Natif bleu électrophorèse sur gel de polyacrylamide (BN-PAGE) a été développé comme une alternative moins dénaturant à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), et permet la séparation de certaines protéines et des complexes à partir d&#39; échantillons biologiques 7. Cependant, les protéines dans la base BN-PAGE séparent sur un large nombre de variables, y compris la taille, la charge, la structure en trois dimensions, et l&#39;association avec d&#39;autres molécules. Les interactions de ces facteurs se traduisent souvent par co-séparation des protéines, la formation d&#39;agrégats, et une mauvaise résolution de la bande de protéine. Électrophorèse bidimensionnelle sur gel natif de polyacrylamide résout certains, mais pas tous, de ces problèmes 8. Pour éviter les complications associées à la séparation native, certains auteurs utilisent des réactifs de reticulation réactifs avec les amines, telles que dithiobis (propionate de succinimidyle) (DSP), pour capturer des complexes protéiques dans les lysats de tissu 4. Ces lysats traités peuvent ensuite être dénaturés et séparés par SDS-PAGE, tout en conservant la taille native et le maquillage des complexes de protéines. Cependant, étant donné que les réactifs de réticulation réagissent en fonction de la proximité d&#39;une molécule à l&#39;autre, et les protéines dans les lysats de tissus ont beaucoup de degrés de liberté et peut interagir stochastiquement, croix de fond non spécifique-linking peut être élevé, en particulier dans les échantillons concentrés. Cela peut conduire à des résultats difficiles à interpréter. Ici, nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un procédé hybride BN-PAGE / SDS-PAGE, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide-multimère (multimère-PAGE), pour séparer et détecter des assemblages de protéines dans des mélanges complexes. Dans un premier temps, le lysat cellulaire est mis en suspension dans un gel de polyacrylamide via BN-PAGE. Le gel contenant de l&#39;lysat est ensuite mis à réagir avec le réactif de réticulation DSP. Pseudo-immobilisé et légèrement séparés sur le gel, les protéines sont beaucoup moins susceptibles de réagir de façon non spécifique, ce qui signifie fond réactivité de réticulation est réduite. Après la reticulation, les bandes de gel sont excisées et séparées par SDS-PAGE. Le gel obtenu peut être ensuite analysé par tout moyen généralement associés à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode permet la séparation et la détection des complexes de protéines natives dans un lysat de tissu non modifié, sans la nécessité d&#39;une purification supplémentaire ou pull-down.

<table><tbody><tr><td>Acide <fort>chimique</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&epsilon ;-Acide aminocaproïque</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxique.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (solution mère à 40 % T)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxique.</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti lapin IgG-HRP de chèvre</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage de l’acide bicchoninique</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de substrat de chimiluminescence</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Fisher</td><td>Scientific D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé sec</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Cocktail</td> <td>d’inhibiteur de protéaseThermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Pour titrage. Caustique.</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>Pour l’activation de la membrane PVDF. Toxique.</td></tr><tr><td>IgG monoclonale anti alpha ;-synucléine de lapin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-méthylènebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxique.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Membranes de transfert de fluorure de polyvinylidène</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>Solution SDS (10 % p/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampon 0,5 M, pH 6,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampon 1,5 M, pH 8,8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td><>Entreprise</td><td> Numéro de catalogue </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>ImageJ NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogénéisateur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur de tissus à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimère-page: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n&#39;est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu&#39;à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l&#39;aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu&#39;il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu&#39;il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n&#39;a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d&#39;intérêt.

Dans cette expérience de démonstration, multimère-PAGE a été réalisée sur l&#39;ensemble lysat de cerveau de rat. Les protéines séparées résultantes ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF), et ensuite sondées avec des anticorps dirigés contre des protéines qui sont connues pour former des complexes. La figure 1 montre une validation du protocole par deux moyens. Tout d&#39; abord, nous avons démontré que les protéines réticulées sont ...

Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.

Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

L'objectif général de ce protocole est de permettre aux chercheurs de capturer, séparer et analyser des complexes protéiques natifs extraits de lysats tissulaires à l'aide de l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode peut aider les chercheurs qui étudient les protéines, car elle est capable de stabiliser des associations protéiques autrement labiles dans des conditions proches des conditions natives, permettant ainsi leur identification et une analyse ultérieure. Le principal avantage de cette technique est qu'elle utilise des méthodes biologiques courantes, ce qui la rend largement applicable et adaptable aux objectifs de chaque chercheur.Pour commencer cette procédure, préparez la électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions natives avec colorant bleu comme décrit dans le protocole écrit. Connectez les électrodes à l'alimentation électrique et faites migrer les protéines dans le gel à 150 volts jusqu'à ce que la bande colorante progresse d'environ deux centimètres dans la couche de séparation. À ce stade, arrêtez et débranchez l'alimentation électrique.Après avoir démonté l'appareil d'électrophorèse, séparez les plaques de verre de la cassette de gel. Re

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La cellule perméables réticulant DSP [dithiobis (succinimidyl propionate)] stabilise les interactions transitoires et...

Isolement du labiles complexes multi-protéiques par des In vivo Contrôlée Cellulaire réticulation et chromatographie d&#39;affinité immuno-magnétiques

Dans cette vidéo, nous décrivons la caractérisation de complexes multiprotéiques (PPM) en bleu électrophorèse en gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE). Dans une première dimension, dialysées lysats cellulaires sont séparés par BN-PAGE pour identifier les PPM individuelle. Dans une deuxième dimension SDS-PAGE, PPM d'intérêt sont subdivisées afin d'analyser leurs électeurs par immunoblot.

Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

Cette vidéo décrit la PAGE multimérique pour séparer les complexes protéiques natifs des homogénats tissulaires. La technique est un hybride des techniques blue native-PAGE et SDS-PAGE. Les complexes séparés peuvent être caractérisés et étudiés pour leur rôle dans le fonctionnement cellulaire.

Multimer-PAGE pour la séparation de complexes de protéines natives : une technique de séparation hybride composée de Blue Native-PAGE et de SDS-PAGE pour séparer les protéines multimères intactes du lysat tissulaire

complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son...

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

L’architecture des complexes protéiques est essentiel pour leur fonction. Combinant différentes techniques de spectrométrie de masse s’est avérée puissante pour étudier leur assemblage. Nous fournissons des protocoles pour la réticulation chimique et spectrométrie de masse native et montrer comment ces techniques complémentaires contribuer à élucider l’architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques.

Combinant la réticulation chimique et spectrométrie de masse des Complexes de protéine intacte pour étudier l’Architecture des assemblées de plusieurs sous-unités protéiques

Cet article décrit le protocole pour la Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP). Cette nouvelle méthode facilite l’isolement spécifique et la caractérisation de la protéomique en aval de toute deux protéines qui interagissent, tandis que hors ONU complexée protéines individuelles ainsi que des complexes formés avec des partenaires de liaison concurrentes.

Dissection multi-signalisation Complexes protéiques par Purification d’affinité de complémentation bimoléculaire (BiCAP)

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Un protocole de cryoslicing polyvalent BN-MS utilisant un microtome est présenté pour le profilage complexome à haute résolution.

Profilage du complexome haute résolution par cryoslicing BN-MS Analysis

Découvrez la capture et la résolution de complexes protéiques natifs à partir de lysats tissulaires par électrophorèse bidimensionnelle. Cette méthode stabilise les associations protéiques labiles pour leur analyse en conditions quasi-natives.

Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

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