Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

L’objectif global de ce protocole est de permettre aux chercheurs de capturer, de séparer et d’analyser des complexes de protéines natives extraits de lysats tissulaires à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette méthode peut aider les chercheurs qui étudient les protéines, car elle est capable de stabiliser des associations de protéines autrement labiles dans des conditions proches du natif, ce qui permet leur identification et leur analyse ultérieure. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des méthodes biologiques courantes, de sorte qu’elle est largement applicable et peut être adaptée aux objectifs de chaque chercheur.

Pour commencer cette procédure, préparez-vous à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu comme décrit dans le protocole de texte. Connectez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorisez les protéines dans le gel à 150 volts jusqu’à ce que la bande de colorant progresse d’environ deux centimètres dans la couche de résolution. À ce stade, arrêtez et débranchez l’alimentation électrique.

Après avoir démonté l’appareil d’électrophorèse, séparez les vitres de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d’empilement. Coupez soigneusement le gel juste en dessous du bord inférieur de la façade du colorant, en prenant soin de rendre cette coupe aussi lisse et droite que possible.

Ensuite, jetez le morceau de gel non utilisé. Coupez toutes les parties inutilisées le long des bords de la bande de gel. Placez délicatement la bandelette dans 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosophate dans un petit récipient et mélangez doucement par notation pendant 30 minutes pour équilibrer.

Après l’équilibrage, jetez et remplacez le PBS par 10 millilitres supplémentaires. Pipette 500 microlitres de DSP de 25 millimolaires dissous dans du sulfoxyde de diméthyle dans le PBS et continuer à mélanger comme précédemment pendant 30 minutes. Après 30 minutes, versez la solution DSP.

À 10 millilitres de HSCL 0,375 molaire, pH 8,8, contenant 2 % de dodécylsulfate de sodium pour éteindre le DSP n’ayant pas réagi. Continuez la notation pendant 15 minutes. Pendant que la bande de gel est en train de tremper, préparer les solutions de gel SDS-PAGE selon les méthodes standard.

N’ajoutez pas les réactifs de polymérisation. Après la trempe, remettez la bande de gel natif bleu à température ambiante et coulez-la dans une nouvelle cassette de gel. Pour ce faire, prélevez soigneusement le gel et placez-le sur une plaque d’espacement propre de la cassette de gel.

Orientez la bande de manière à ce qu’elle soit retournée par rapport à son orientation précédente et que le bas de la face avant du colorant soit le plus proche du haut de la nouvelle cassette. Placez la bande de manière à ce que son bord supérieur se trouve au même niveau que le bord supérieur de la plaque de recouvrement. Assurez-vous que la face avant du colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre.

Poussez un côté de la bande excisée contre l’une des parois de l’espaceur, en laissant de la place de l’autre côté pour que le gel soit versé et qu’un étalon ou une échelle de protéines soit chargé. Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones déchiquetées ou inégales, coupez-les soigneusement. Une fois la bande de gel correctement positionnée, posez la plaque de recouvrement sur la plaque d’espacement.

Appliquez une légère pression pour expulser les bulles d’air emprisonnées. Continuez à assembler l’appareil de coulée de gel selon les instructions du fabricant. La bande de gel se déplace parfois lorsque la plaque supérieure est placée.

Il est utile de laisser la bande pendre un peu sur le bord de la plaque supérieure afin qu’elle puisse être ajustée avec une spatule pour corriger les décalages. Ajouter les réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution et le verser dans la cassette de gel préparée à l’aide d’une pipette sérologique. Remplissez la cassette de gel à environ deux centimètres sous la bande de gel PAGE native bleue excisée pour laisser de la place pour la couche d’empilement.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de butanol sur le dessus du gel versé et attendez 30 minutes pour la polymérisation de la couche de résolution avant de verser le butanol. Ensuite, ajoutez les réactifs de polymérisation à la solution de gel d’empilement. À l’aide d’une pipette sérologique, versez la couche d’empilement pour remplir tout l’espace vide restant dans la cassette de gel.

Inclinez la cassette de gel pendant que la couche d’empilage est versée afin qu’elle remplisse l’espace sous la bande de gel et que les bulles d’air ne soient pas piégées. Au fur et à mesure que le tampon de gel empilable remplit l’espace vide sous la bande de gel, remettez progressivement la cassette de gel au niveau. Continuez à remplir l’espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel empilable jusqu’à ce qu’il déborde presque.

Ensuite, laissez la couche d’empilement polymériser pendant 30 minutes. Une fois la couche d’empilage polymérisée, retirez la cassette de gel de l’appareil de coulée, rincez-la à l’eau distillée et assemblez l’appareil d’électrophorèse selon les instructions du fabricant. Remplissez complètement la chambre intérieure avec 1x tampon de fonctionnement SDS-PAGE.

Ensuite, remplissez la chambre extérieure au niveau indiqué par le fabricant. Chargez l’espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou l’étalon protéique approprié. Fixez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorisez les échantillons à 120 volts.

Lorsque le colorant Coomassie s’écoule du gel, arrêtez le cycle et débranchez l’alimentation électrique. Analysez le gel à l’aide de méthodes standard d’électrobuvardage et de détection des protéines à base d’anticorps. La validation de multimer-PAGE est illustrée ici par immunoblot.

Le complexe kinésine capturé est clivé par le diphyo-3-itol, ce qui montre que les agrégats de haut poids moléculaire sont formés par réticulation de substituants plus petits. Représentés ici, les lysats cérébraux traités avec des concentrations croissantes de SDS ou de Triton ont augmenté la détection de l’alpha-synucléine monomère tout en diminuant la détection de l’oligomère soluble tétromère. Ici, les résultats représentatifs du multimère-PAGE utilisé pour capturer les complexes solubles dans le lysat de cerveau de rat sont présentés.

Des protéines ont été détectées par immunoblot. Le poids monomère attendu de chaque protéine est indiqué sous les voies. De même, la capture de complexes liés à la membrane est illustrée ici.

Il arrive que Multimer-PAGE ne parvienne pas à capturer un complexe, comme le montre le complexe respiratoire SDHA à deux blot. Une discussion des explications possibles à cela peut être trouvée dans le protocole textuel. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures environ si elle est exécutée correctement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une réticulation dans un gel de complexes protéiques natifs, suivie d’une refonte sur gel et d’une séparation par SDS-PAGE secondaire. N’oubliez pas que travailler avec de l’acrylamide peut être extrêmement dangereux et qu’un équipement de protection individuelle doit être porté lors de la coulée du gel. À la suite de cette procédure, les complexes stabilisés séparés peuvent être élués ou coupés du gel et peuvent être analysés par de nombreux moyens, y compris l’immunodétection ou la spectrométrie de masse selon les besoins du chercheur.