Name: Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Apprenez à isoler les cellules mésenchymateuses du pancréas chez la souris par cytométrie de flux pour analyser l'expression des gènes et des marqueurs de surface. Cette méthode simple permet d'étudier le développement pancréatique et la tumorigenèse.

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Les auteurs remercient Adi Sasson pour l’assistance technique et Helen Guez pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la subvention de départ n° 336204 du Conseil européen de la recherche.

Des expériences ont été menées selon des protocoles approuvés par le Comité de la recherche animale à l&#39;Université de Tel Aviv. 1. Isolement du tissu pancréatique de souris <ol><li> Pour les souris adultes: <ol><li> Préparer le tampon de digestion: 0,4 mg / ml de collagénase P et 0,1 ng / ml de DNase I dissous dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Fraîchement préparer 5 ml de tampon par souris dans 15 mL tubes coniques et les garder sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Euthanasier les souris conformément à la directive institutionnelle. </li><li> Disséquer chaque souris pour enlever le pancréas (pour l&#39;instruction, s&#39;il vous plaît voir référence 18); placez-le dans une boîte de culture contenant HBSS. Il est possible d&#39;effectuer cette étape sous un stéréomicroscope, et d&#39;augmenter l&#39;efficacité de la digestion, couper le tissu en 2 - 4 pièces. </li><li> Placer le tissu pancréatique dans un tube contenant un tampon digestif (préparé à l&#39;étape 1.1.1). Gardez les tubes sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les souris sont disséqués et les tissus pancréatiquesrecueillies. </li><li> Répétez les étapes 1.1.2 - 1.1.4 avec les souris restantes. </li></ol></li><li> Pour les embryons et les souris néonatales: <ol><li> Préparer le tampon de digestion: 0,4 mg / ml de collagénase P et 0,1 ng / ml de DNase I dissous dans du HBSS. Pour les embryons et les ratons au jour post-natal 7 (P7) ou moins, fraîchement préparer 1,5 - 2 ml de tampon par souris dans un tube conique de 15 ml. Pour p7 ou de bébés âgés, préparer les 3 - 4 ml de tampon par souris dans un tube conique de 15 ml. Gardez sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Euthanasier les souris conformément à la directive institutionnelle. Pour les embryons, supprimer tous les embryons de l&#39;utérus de leur mère et les placer dans une boîte de culture de 10 mm contenant du PBS. Disséquer un embryon à la fois. </li><li> Poser la souris sur le dos, avec sa tête pointant loin de l&#39;enquêteur. En utilisant une pince fine, tirer vers le haut la peau abdominale et ouvert à la ligne médiane pour exposer la cavité abdominale jusqu&#39;à la membrane de la souris 18. </li><li> En utilisant une pince fine, détacher le fr du foieom la paroi abdominale en arrière. Avec un mouvement continu vers la queue de la souris, évider les organes internes (y compris le foie, l&#39;estomac, la rate, les intestins, les reins et le pancréas) et les placer dans une boîte de culture contenant HBSS. </li><li> En vertu d&#39; un stéréomicroscope, enlever le foie et les reins pour exposer le pancréas (figure 1). En utilisant une pince fine, détacher le pancréas de l&#39;estomac, du duodénum, ​​et enfin, de la rate. </li><li> Placer le tissu pancréatique dans un tube contenant un tampon digestif (préparé à l&#39;étape 1.2.1). Pour p14 ou plus petits, couper le tissu en 2 morceaux pour augmenter l&#39;efficacité de la digestion. Gardez les tubes sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les souris sont disséqués et les tissus pancréatiques collectés. </li><li> Répétez les étapes 1.2.2 - 1.2.6 avec les souris restantes. </li></ol></li></ol> 2. Pancréas Digestion <ol><li> Incuber les tubes contenant le tissu pancréatique (dans un tampon de digestion) dans un bloc chauffant à 37 ° C pendant 30 min avec agitation à 700 rpm. Après 15 minutes, agiter manuellement les tubes en les inversant 3 - 4 fois et placez-les dans le bloc de chauffage. NOTE: Si vous utilisez un bloc de chauffage sans capacités d&#39;agitation, inverser les tubes tous les 5 - 10 min. Assurez-vous que le tissu est correctement digéré. Sinon, couper le tissu en petits morceaux avant incubation ou augmenter l&#39;agitation. </li><li> Pour arrêter la digestion des tissus, placer les tubes sur la glace et ajouter 10 ml de HBSS froid dans chaque tube. Centrifuger les tubes à 4 ° C et 300 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Re-suspension: <ol><li> Pour les souris adultes et p14 ou chiots âgés, re-suspendre le culot avec 6 mL de PBS et la souche à travers un tamis cellulaire de 70 um placé sur le dessus d&#39;une nouvelle collection conique tube en polypropylène de 15 ml. Pour assurer une récupération maximale des cellules, laver le tube original avec un 6 ml supplémentaire de PBS et de le filtrer à travers le tamis de la cellule sur le tube de collecte. </li><li> Pour les embryons et les chiots plus jeunes than p14, remettre en suspension le culot avec 2 ml de PBS et la souche à travers un tamis cellulaire de 35 um placé sur le dessus d&#39;un tube de collecte de polystyrène à fond rond de 5 ml (FACS tube). Pour assurer une récupération maximale des cellules, laver le tube d&#39;origine avec une 2 ml supplémentaires de PBS et le filtrer à travers le tamis de la cellule sur le tube de collecte. </li></ol></li><li> Centrifuger les tubes à 4 ° C et 300 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant. Éliminer le liquide avec précaution, car les cellules sont plus ou moins liés au tube de polystyrène. </li></ol> 3. Préparation de cellules marquées simples <ol><li> Préparations tampons: Pour l&#39;isolement des cellules par FACS, tri préparer en mélangeant un tampon PBS (sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium), 5% de sérum bovin fœtal (FBS) et de l&#39;EDTA 5 mM. Pour cytométrie en flux, la préparation du tampon d&#39;analyse en complétant le tampon de tri avec l&#39;azoture de sodium à 0,05%. Les deux tampons peuvent être stockés à 4-8 ° C pendant jusqu&#39;à 2 mois. </li><li> cellules dans le tri ou ana Re-suspendretampon de lyse. Re-suspendre chaque pancréas isolé à partir d&#39;embryons et les chiots de moins de p7 dans 1 ml, de chiots entre p8 et d&#39;un mois dans 1,5 ml, et de souris plus d&#39;un mois dans 3 ml. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire de 35 pm placée au-dessus d&#39;un tube en polystyrène à fond rond (FACS tube). </li><li> Pour les contrôles de coloration, prendre 50- 100-ul aliquotes des échantillons réalisés à l&#39;étape précédente (pas plus de 5% du volume total de l&#39;échantillon) et placez-les dans de nouveaux tubes FACS; inclure un tube pour chaque fluorophore utilisé, y compris le DAPI et les protéines fluorescentes, ainsi que d&#39;un témoin non coloré. NOTE: En utilisant des souris transgéniques avec des cellules exprimant une protéine fluorescente, ou lorsque le nombre de cellules est limitée, y compris un tissu non transgénique en tant que témoin de coloration. Si des cellules exprimant une protéine fluorescente sont utilisées sans autre coloration, passez à l&#39;étape 3.8. </li><li> Spin-bas les cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. </li><li> Pour blocroi, re-suspendre les cellules avec une solution de blocage (100 pi de tri ou tampon d&#39;analyse complétée avec 1 pl de IgG de chèvre) et incuber pendant 30 minutes sur la glace. </li><li> Pour colorer les marqueurs de surface cellulaire, préparer un mélange qui comprend tous les anticorps fluorophores conjugués désirés dans un volume de 100 ul par échantillon. Préparer des dilutions d&#39; anticorps 2x dans le tri ou le tampon d&#39;analyse ( par exemple, diluer l&#39;anticorps pour obtenir le double de la concentration requise, si une dilution finale de 1: 200 est souhaitée, diluer l&#39;anticorps 1: 100). Sans lavage de la solution de blocage, ajouter 100 ul du mélange de cellules de l&#39;échantillon pour obtenir un volume de coloration final de 200 ul. Incuber pendant 30-60 min sur la glace et dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour définir l&#39;analyse ou paramètres de tri (voir les étapes 4.3 et 5.2), préparer des tubes supplémentaires qui ne contiennent qu&#39;un seul des anticorps utilisés (contrôle de coloration). Préparer des dilutions d&#39;anticorps 2x dans le tri ou le tampon d&#39;analyse (comme décrit à l&#39;étape 3.6). Assurez-vous d&#39;inclure un single dilution de commande de coloration pour chaque fluorophore utilisé, ainsi qu&#39;un témoin non coloré. Sans lavage de la solution de blocage, ajouter 100 pl de mélanges d&#39;anticorps aux cellules (préparé à l&#39;étape 3.3) pour obtenir un volume de coloration final de 200 ul. Incuber pendant 30 - 60 min sur la glace et dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver en remplissant chaque tube à l&#39;analyse ou le tri tampon pour un volume maximal de 4 ml. Eventuellement, re-souche des cellules à travers un tamis cellulaire de 35 pm (tel que décrit à l&#39;étape 3.2). </li><li> Centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec précaution. </li><li> Re-suspendre les échantillons dans l&#39;analyse ou le tampon de tri. Re-suspendre les cellules isolées à partir d&#39;embryons dans 500 pi, de chiots de moins d&#39;un mois 1 ml, de 1 - 3 mois à 2 ml, et des souris âgées de 3 mois à 3 ml. Coloration des contrôles peuvent être remises en suspension dans 300 pi de tampon. </li><li> Ajouter 200 ng / ml de DAPI à des cellules remis en suspension afin d&#39;identifier les cellules mortes. Assurez-vous d&#39;inclure un co tubentaining cellules non colorées sans DAPI pour les paramètres de cytomètre. Procéder au tri cellulaire (étape 4) ou de l&#39;analyse (étape 5). </li></ol> 4. Tri cellulaire <ol><li> Les préparatifs: <ol><li> Pour le tri avant l&#39;extraction de l&#39;ARN, revêtir un tube collecteur de 1,5 mL avec RNase cellulaire inhibiteur immédiatement avant le tri. A cet effet, ajouter 1 ml de tampon de tri, contenant un inhibiteur de 0,01 U / ml de RNase, à un tube stérile de collecte de 1,5 mL. Après 5 min, le tube vortex et enlever le liquide. </li><li> Pour le tri préalable à la culture cellulaire cellulaire, ajouter 3 ml de milieu de culture stérile (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 20% de FBS, 1% de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine) dans un tube stérile de collecte de 15 ml . </li></ol></li><li> Avant de charger un tube dans un trieur FACS, vortex brièvement pour remettre en suspension les cellules. Gardez les tubes restants sur la glace. </li><li> Commencer par analyser les commandes de coloration pour déterminer les paramètres de tri (par exemple, </em&gt; Tension et de compensation) et de tri des portes (par exemple, la population totale des cellules, des cellules DAPI négatif en direct, des populations et de cellules à trier). </li><li> Une fois les paramètres de tri et portails sont mis en place, charger les échantillons et lancer le tri cellulaire dans les tubes de collecte. NOTE: Tri conditions sont très dépendants de l&#39;instrument. Nous utilisons une largeur de buse de 100 pm, sous une pression de 23,1 livres par pouce carré, et une vitesse maximale de 5 tri. </li><li> Procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN ou de la mise en culture des cellules triées. NOTE: Pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, centrifuger les cellules à 2000 xg pendant 5 minutes et retirer l&#39;excès de liquide avant de poursuivre avec un protocole d&#39;extraction standard. Pour la culture de cellules, si les cellules ont été triées dans des conditions non stériles, les laver deux fois en remplissant le tube avec le milieu de culture et centrifuger à 300 g pendant 7 min avant la mise en culture afin de minimiser leur contamination. </li></ol> 5. Cellule d&#39;analyse par cytométrie de flux <ol><li> Avant loading chaque tube dans le cytomètre, vortex brièvement pour remettre en suspension les cellules. Gardez les tubes restants sur la glace. </li><li> Commencez par analyser les échantillons non colorés et simples teinté afin de déterminer les paramètres d&#39;analyse (par exemple, la tension et de compensation). </li><li> Une fois les paramètres d&#39;analyse sont mis en place, charger chaque échantillon, y compris le contrôle de la coloration, et d&#39;enregistrer les résultats. Analyser les résultats obtenus à l&#39;aide de cytométrie de flux logiciel d&#39;analyse. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous décrivons un procédé pour isoler et analyser des cellules du micro-environnement du pancréas. Cette méthode peut être utilisée pour isoler des cellules mésenchymateuses à partir du tissu pancréatique embryonnaire et adulte. En outre, nous avons utilisé avec succès ce protocole pour isoler les cellules endothéliales de l&#39;adulte et du pancréas néonatal 5, 17. Cependant, il peut ne pas convenir pour l&#39;obtention d&#39;une suspension à cellule unique et reproductible des cellules épithéliales pancréatiques (protocoles alternatifs sont décrits dans les références 18, 23 et 24). En utilisant cette méthode, les cellules marquées par fluorescence, soit l&#39;expression de protéines fluorescentes ou immunocolorées pour des marqueurs de surface, peuvent être purifiés par FACS ou analysées par cytométrie en flux. L&#39;ARN peut être extrait de cellules purifiées pour profiler leur motif d&#39;expression génique. Alternativement, les cellules purifiées peuvent être cultivées pour établir une lignée cellulaire pour l&#39;analyse protéomique ultérieure. Cette méthode permettra à la caractérisation des facteurs expressed par le microenvironnement du pancréas, qui régissent son organogenèse, la physiologie et la physiopathologie. Le mésenchyme pancréatique soutient organogenèse tissulaire en favorisant la prolifération des précurseurs et des cellules différenciées 5, 9. Ces cellules ont été présentés pour soutenir l&#39;expansion des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) -derived progéniteurs pancréatiques 17, 25, 26. Par conséquent, la délimitation de l&#39;identité des facteurs mésenchymateuses embryonnaires faciliterait les efforts actuels pour générer des cellules bêta productrices d&#39;insuline à partir de cellules hES et les cellules pluripotentes induites souches (CISP) en tant que traitement potentiel du diabète. Des études génétiques de souris ont permis d&#39;identifier des facteurs de croissance, tels que Fgf10, qui sont produites par le mesenchyme pour favoriser l&#39;expansion de l&#39;épithélium pancréatique pendant les premiers stades du développement du pancréas3, 9. Dans le but d&#39;identifier les facteurs supplémentaires exprimés dans le mésenchyme embryonnaire, nous avons isolé ces cellules en utilisant microdissection laser capturé, extrait de leur ARN, et effectué une analyse d&#39;expression génique 26. Cependant, en plus d&#39;être travail intense, cette méthode repose sur l&#39; identification de cellules en fonction de leurs caractéristiques morphologiques, ce qui limite son utilisation à des stades de développement avant la ramification de l&#39;épithélium dans le mesenchyme environnant (c. -à- E12.5). Pour caractériser les cellules mésenchymateuses à des stades de développement plus tard, nous avons utilisé la méthode décrite ici 5, 17. Nous avons utilisé cette méthode pour analyser l&#39; expression des marqueurs de surface par mésenchyme pancréatique néonatale 5. En outre, les cellules mésenchymateuses sont isolées à partir du tissu pancréatique embryonnaire et néonatale de Nkx3.2 -Cre, les souris R26 EYFP, sur la baseleur marquage fluorescent dans cette lignée de souris, et ont été cultivées pour établir des lignées cellulaires 17. L&#39;analyse protéomique de ces cellules ont permis l&#39;identification des facteurs sécrétés par le mésenchyme pancréatique avec la capacité de promouvoir progéniteurs pancréatiques CSEh dérivées 17. En outre , nous avons utilisé cette méthode d&#39;isolement des cellules pour purifier les cellules mésenchymateuses à partir de tissus pancréatiques adultes pour l&#39; extraction d&#39;ARN et l&#39; expression génique analyse 17. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour identifier des gènes et des protéines exprimées par le mesenchyme du pancréas, de la capacité à soutenir le développement des cellules du pancréas. cellules mésenchymateuses pancréatiques ont ensuite été présentés à jouer un rôle dans le pancréas tumorigenèse. PDAC est caractérisée par la formation d&#39;un stroma riche desmoplastique fibroblaste comprenant des fibroblastes, des cellules immunitaires et 27 l&#39; ECM. Alors que le stroma a été pensé pour favoriser le développement d&#39;un grand nombreles types de cancer, il a été montré pour empêcher la progression PDAC 15, 16, 28. Ceci suggère que les composants du stroma du pancréas sécrètent des facteurs qui inhibent la tumorigenèse. En outre, les changements dans la composition du stroma cellulaire ainsi que dans le phénotype cellulaire peuvent sous - tendre leurs effets sur les cellules epitheliales 15, 16, 28. La méthode décrite ici peut donc aider à caractériser les différents types de cellules qui composent un stroma PDAC par rapport au tissu du pancréas sain. Il serait en outre permettre la purification des différents types de cellules stromales pour caractériser les changements potentiels dans leurs profils d&#39;expression génique durant la progression de la PDAC. Toutefois, en raison de changements dans la composition de l&#39; ECM du pancréas pendant 27 tumorigenèse, les réglages des paramètres de digestion du tissu, telles que l&#39;inclusion de suppional Types de collagénase ou de l&#39;augmentation du temps d&#39;incubation peuvent être nécessaires.

homéostasie énergétique et la digestion des aliments chez les mammifères dépendent de la fonction pancréatique appropriée. Le pancréas adulte se compose de deux grands compartiments cellulaires: le exocrines et le système endocrinien. Les cellules exocrines, y compris les cellules acineuses qui produisent et sécrètent des enzymes digestives et les cellules des canaux qui transportent ces enzymes de l&#39;intestin, englobant plus de 80% de la masse totale du pancréas 1. Les cellules endocrines, qui comprennent des cellules bêta productrices d&#39; insuline et de glucagon par les cellules alpha productrices sont organisées dans les îlots de Langerhans qui sont incorporés dans le tissu exocrine et sécrètent des hormones pour réguler les niveaux de glucose dans le sang 2. Les cellules pancréatiques acquièrent leur sort différencié à travers un très réglementé, un processus en plusieurs étapes 3. Les preuves suggèrent que les signaux fournis par extrinsèques neuronale, endothelial et des cellules mésenchymateuses guident la différenciation des cellules du pancréas et de la prolifération en til embryon 3, 4, 5. Un exemple est l&#39;exigence de l&#39;aorte pour la spécification des précurseurs précoces du pancréas 6. Plus tard au cours du développement, les cellules endothéliales se sont révélés jouer un rôle central dans le développement des deux cellules endocrines et exocrines du pancréas et de favoriser la différenciation des cellules bêta 4, 6, 7. Les cellules mésenchymateuses se sont révélés favoriser la survie et le développement des progéniteurs du pancréas commun, principalement par la sécrétion de la Fgf10 du facteur de croissance 8, 9. Nous avons en outre montré que ces cellules soutiennent la prolifération des précurseurs endocrines et exocrines, ainsi que des cellules différenciées (y compris les cellules acineuses et bêta) dans le pancréas embryonnaire 5. Récemment, les cellules mésenchymateuses étaient encoremontré pour réguler la différenciation des cellules endocrines 10. Chez l&#39;adulte, la fonction des cellules bêta et de masse se sont révélées dépendre des cellules dans leur microenvironnement, y compris des neurones, immunitaire et des cellules endothéliales, péricytes, ainsi que 11, 12, 13. Pendant les blessures, les cellules endothéliales ont été montrés à recruter des cellules immunitaires au pancréas pour promouvoir la réplication des cellules bêta 13. Les cellules endothéliales ont encore été montrées pour produire la matrice extracellulaire (ECM) des composants pour soutenir l&#39; expression de l&#39; insuline et des cellules bêta fonction 14. Nous avons récemment démontré l&#39;exigence de péricytes des îlots pour la fonction des cellules bêta 11. Enfin, les cellules du stroma du pancréas ont été montrées pour réguler la progression du pancréas adénocarcinome canalaire (ACPE) 15, 16. Cependant, l&#39;identité de signaux extrinsèques qui guident le développement du pancréas, de la fonction, et la tumorigenèse sont en grande partie inconnus. L&#39;identification des signaux fournis par les cellules du micro-environnement du pancréas nécessite la caractérisation des gènes et des protéines exprimées par ces cellules. Cela dépend de l&#39;isolement de ces cellules du pancréas afin d&#39;effectuer l&#39;expression des gènes et des analyses protéomiques et / ou à établir des lignées cellulaires. Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules mésenchymateuses du microenvironnement du pancréas en utilisant le tissu digestion enzymatique et activé par fluorescence tri cellulaire (FACS) soit des cellules ou des cellules immunofluorescence marquées exprimant des protéines fluorescentes. Ce protocole a été réalisé avec succès pour isoler et analyser la protéine fluorescente jaune (YFP) exprimant des cellules mésenchymateuses du pancréas embryonnaire, néonatale et adulte 5, 17.

<table><tbody><tr><td>Collagénase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Les unités efficaces doivent être d’au moins 2 000 unités/ml de protéine</td></tr><tr><td>Hanks' Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sérum IgG de chèvre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Inhibiteur de l’ARNase D9542</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 5 mL en polystyrène à fond rond Tube de 5 mL</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>Tube FACS. Assurez-vous que le tube est compatible avec le cytomètre de débit à utiliser, car il existe de légères différences dans les tubes requis entre les marques</td></tr><tr><td>Tube de 5 mL avec 35 &mu ; crépine à cellules m Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>tube FACS</td></tr><tr><td>70 &mu ; crépine à cellules M&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant avec agitation&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Stéromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td></td><td>cytomètre en flux Beckman Coulter</td><td>Gallios&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

isoler et analyse des cellules du pancréas mesenchyme par cytométrie de flux

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Le pancréas est composé de cellules épithéliales nécessaires à la digestion des aliments et à la régulation de la glycémie. Il a été démontré que les cellules du microenvironnement pancréatique, y compris les cellules endothéliales, neuronales et mésenchymateuses régulent la différenciation et la prolifération cellulaires dans le pancréas embryonnaire. Chez l’adulte, il a été démontré que la fonction et la masse des cellules productrices d’insuline dépendent des cellules de leur microenvironnement, y compris les cellules péricytaires, immunitaires, endothéliales et neuronales. Enfin, il a été démontré que les modifications du microenvironnement pancréatique régulent la tumorigenèse du pancréas. Cependant, les indices sous-jacents à ces processus ne sont pas entièrement définis. Par conséquent, la caractérisation des différents types de cellules qui composent le microenvironnement du pancréas et le profilage de leur expression génique sont cruciaux pour délimiter le développement et la fonction des tissus dans des états normaux et malades. Ici, nous décrivons une méthode qui permet d’isoler les cellules mésenchymateuses du pancréas de souris embryonnaires, néonatales et adultes. Cette méthode utilise la digestion enzymatique du tissu pancréatique de souris et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou l’analyse cytométrique en flux des cellules marquées. Les cellules peuvent être marquées soit par immunomarquage pour les marqueurs de surface, soit par l’expression de protéines fluorescentes. L’isolement cellulaire peut faciliter la caractérisation des gènes et des protéines exprimés dans les cellules du mésenchyme pancréatique. Ce protocole a permis d’isoler et de cultiver des populations de cellules mésenchymateuses hautement enrichies à partir du pancréas embryonnaire, néonatal et adulte de souris.

Le mésenchyme pancréatique est nécessaire au cours du développement et de l&#39;âge adulte. Le procédé décrit ici permet d&#39;isoler des cellules mésenchymateuses à partir de la, néonatale et le pancréas adulte embryonnaire. Les cellules mésenchymateuses, mais pas d&#39; autres types de cellules expriment la protéine fluorescente jaune (YFP) dans le pancréas de Nkx3.2 -Cre; R26R YFP souris 5, 11, 17, 19. Au cours du développement, Nkx3.2 (également connu sous le nom BapX1) est exprimée par pancréas embryonnaire, de l&#39; estomac et de l&#39; intestin mésenchyme, ainsi que dans un sous - ensemble du squelette somites 19, 20, 21. Ce gène a été exprimé dans le mesenchyme du pancréas de E9.5 jusqu&#39;à E11.5, ce qui permet l&#39; expression du gène sous le contrôle de Nkx3.2 -Cre de 5 E9.5, </sup&gt; 19, 20. Sur la base de cet étiquetage, les cellules peuvent être purifiés à partir du tissu pancréatique en vrac en utilisant la cytométrie de flux. La figure 2 montre une analyse par cytométrie de flux de cellules individuelles à partir de tissus pancréatiques embryonnaires, néonatales et adultes, isolées comme décrit ici. Considérant que les tissus pancréatiques non transgéniques ne contiennent pas de cellules fluorescentes, Nkx3.2 -Cre; R26R YFP tissu pancréatique de tous âges analysés contient une population distincte de cellules marquées YFP (figure 2, marqué par des portes). En suivant le procédé décrit ici, les cellules exprimant des protéines fluorescentes peuvent être soit purifié, soit analysée par cytométrie en flux, avec ou sans coloration immunologique supplémentaire. Par exemple, après un tri basé sur un marquage fluorescent, les cellules mésenchymateuses peuvent être cultivées pour établir une lignée cellulaire (pendant au moins cinq passages), comme représenté sur la figure 3A. Remarque t<html> il fibrocytic morphologie des cellules cultivées, typiques des cellules mésenchymateuses. En outre, ce système a été utilisé pour analyser l&#39;expression génique par les cellules triées. A cette fin, l&#39;ARN a été extrait des cellules mésenchymateuses triées pour synthétiser l&#39;ADNc, et les niveaux d&#39;expression génique sont analysés par PCR quantitative. Cette analyse a révélé que les cellules triées expriment le marqueur vimentine pan-mésenchymateuses (figure 3B). Enfin, l&#39;expression des marqueurs de surface par les cellules pancréatiques peut être analysé par cytométrie de flux. Par exemple, nous avons isolé des cellules du tissu pancréatique de Nkx3.2 -Cre; R26R YFP des souris adultes en utilisant la méthode décrite ici , et les tachée avec la surface de la cellule glycoprotéine CD9, qui a été rapporté pour être exprimé par les fibroblastes 22. Comme cela est représenté sur la figure 3C, toutes les cellules dans le Nkx3.2 -Cre marqué par fluorescence; Pancréas R26R YFP expriment CD9. tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: tissu pancréatique embryonnaire et néonatale. Tout le tractus gastro - intestinal isolé, y compris l&#39;estomac, la rate, l&#39; intestin et le pancréas, d&#39;un embryon E15.5 (A) et un chiot p4 (B). Le tissu pancréatique est délimité par une ligne bleue. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> Figure 2: Les cellules mésenchymateuses sont marquées par fluorescence dans Nkx3.2 -Cre; R26R YFP tissu pancréatique. L&#39; analyse par cytométrie de flux de cellules pancréatiques isolés de non-transgénique (panneaux de gauche) et Nkx3.2 -Cre; R26R YFP transgénique (panneaux de droite) des souris à différents âges: embryonnaire (A), néonatale (B), et adult (C). Les cellules ont été analysées pour la dispersion latérale (axe y) et une fluorescence jaune (axe des x). Portes (marquée par &quot;D&quot;) a indiqué la présence d&#39;une population de cellules YFP + chez les souris transgéniques , mais non chez les témoins non transgéniques. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> Figure 3: Analyses des cellules pancréatiques isolées. (A) Les cellules triées à partir du tissu pancréatique de Nkx3.2 -Cre; R26R YFP de souris néonatales (tel que décrit dans la figure 2B) ont été cultivées pour établir une lignée cellulaire. Les cellules cultivées ont été imagées pour la fluorescence (vert, droite et panneaux de gauche) et le contraste de phase (gris, panneau de droite). (B) Bar diagramme montrant Vimentin1 (VIM1)les niveaux d&#39;expression par YFP + -sorted cellules du tissu pancréatique de Nkx3.2 -Cre; Souris adultes R26R YFP (tel que décrit à la figure 1C, vert) par rapport au tissu pancréatique non triés (noir). L&#39;ARN a été extrait et l&#39;expression des gènes a été analysée par PCR quantitative; expression a été normalisé à la cyclophiline. N = 4. *** P &lt;0,001. Les données représentent la moyenne ± écart-type. (C) Analyse par cytométrie de flux de cellules pancréatiques dispersés de Nkx3.2 -Cre; R26R YFP souris adultes immuno-colorées avec l&#39; allophycocyanine (APC) , conjugué à un anticorps anti-CD9 et analysé pour APC (y de l&#39; axe) et une fluorescence jaune (axe des x). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Ici, nous décrivons un procédé pour l&#39;isolement de cellules dans le microenvironnement du pancréas embryonnaire à partir du tissu, du nouveau-né et de l&#39;adulte souris, en se concentrant sur l&#39;isolement des cellules mésenchymateuses. Cette méthode permet le profilage de l&#39;expression génique des cellules et la sécrétion de protéines afin d&#39;élucider les signaux extrinsèques qui régulent le développement du pancréas, de la fonction, et la tumorigenèse.

Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules mésenchymateuses pancréatiques afin d'analyser l'expression de leurs gènes et de leurs marqueurs de surface. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement pancréatique, telles que les signaux exprimés par les cellules mésenchymateuses et leur influence sur le développement épithélial. Les principaux avantages de cette technique sont sa simplicité relative, sa rapidité et sa capacité à fournir un bon rendement de cellules triées.Commencez par déposer les organes internes dans une boîte de culture contenant du HBSS et placez la boîte sous un microscope stéréo. Détachez le foie et les reins afin d'exposer le pancréas, en utilisant une pince fine pour retirer le pancréas de l'estomac, du duodénum et de la rate. Au fur et à mesure que chaque pancréas est collecté, transférez le tissu dans un tube conique contenant un tampon digestif fraîchement préparé et placez le tube sur de la glace.Lorsque tous les pancréas ont été prélevés, transférez les tissus dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec agitation à 700 tr/min, en inversant manuellement les tubes trois à quatre fois après 15 minutes. S'il reste encore de gros morceaux de pancréas après la première moitié de la digestion, inversez le tube toutes les cinq minutes pendant les 15 dernières minutes et incubez le tissu pendant cinq à dix minutes supplémentaires si nécessaire. À la fin de la digestion, placez les tubes sur de la glace et ajoutez 10 millilitres de HBSS froid à chaque échantillon.Récupérez les cellules par centrifugation et resuspendez les culots dans deux millilitres de PBS frais. Ensuite, filtrez les cellules à travers des tamis de 35 microns dans des tubes de collecte ronds en polystyrène de cinq millilitres et lavez les tubes de digestion avec deux millilitres de PBS frais, en passant les lavages dans les tubes de collecte correspondants. Puis centrifugez à nouveau les cellules et aspirez soigneusement les surnageants sans perturber les culots.Resuspendre les cellules dans du tampon de tri selon l'âge des animaux et les filtrer à l'aide de nouveaux filtres à cellules de 35 micromètres vers de nouveaux tubes de collecte de cinq millilitres. Répartir des volumes de 50 à 100 microlitres de cellules dans de nouveaux tubes FACS pour les contrôles de marquage, y compris un tube pour chaque fluorophore, le colorant de viabilité, les protéines fluorescentes et un témoin non marqué. Laver chaque tube avec jusqu'à quatre millilitres de tampon de tri, puis centrifuger.Ensuite, resuspendre les culots dans un tampon de tri frais selon l'âge des animaux. Puis colorer les cellules avec le colorant de viabilité. Pour le tri cellulaire avant l'extraction d'ARN, immédiatement avant le début du tri, recouvrir un tube de collecte stérile de 1,5 millilitre avec un millilitre de tampon de tri contenant un inhibiteur d'ARNase.Après cinq minutes, vortexer le tube de collecte et éliminer le liquide. Vortexer le premier témoin de marquage et charger le tube dans le cytomètre en flux pour commencer à déterminer les paramètres de tri. Une fois tous les paramètres de tri définis, charger les échantillons et trier les cellules dans des tubes de collecte de 1,5 millilitre.Ensuite, récupérez les cellules triées par centrifugation. Aspirez le surnageant jusqu’au culot et extrayez l’ARN selon les protocoles standards d’extraction de l’ARN. Ici, on montre le tractus gastro-intestinal entier isolé, comprenant l’estomac, la rate, l’intestin et le pancréas, d’un embryon de jour 15,5 et d’un jeune de jour postnatale quatre.L'analyse par cytométrie en flux de cellules uniques provenant de tissus pancréatiques embryonnaires, néonatals et adultes, isolés comme vient de l'être démontré, révèle que les tissus pancréatiques transgéniques de tous les âges analysés contiennent des populations cellulaires distinctes marquées par la YFP. Après tri, ces cellules mésenchymateuses peuvent être mises en culture pour établir une lignée cellulaire pendant au moins cinq passages. Remarquez la morphologie fibreuse des cellules cultivées, typique des cellules mésenchymateuses.Les cellules triées expriment le marqueur panmésenchymateux vimentine, comme analysé par qPCR après extraction de l'ARN et synthèse d'ADNc. De plus, l'expression des marqueurs de surface des cellules pancréatiques isolées indique que toutes les cellules marquées par fluorescence dans le pancréas transgénique YFP expriment CD9, une glycoprotéine de surface cellulaire exprimée selon les rapports par les fibroblastes. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage de l'ARN peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l'expression génique des cellules mésenchymateuses.

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JoVE Journal

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