Isoler et analyse des cellules du pancréas Mesenchyme par cytométrie de flux

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules mésenchymateuses pancréatiques pour l’analyse de leur gène et de l’expression des marqueurs de surface. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement du pancréas, telles que les signaux exprimés par les cellules mésenchymateuses et comment ils influencent le développement épithélial. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est relativement simple et rapide, et qu’elle permet un bon rendement des cellules triées.

Commencez par déposer les organes internes dans une boîte de culture contenant du HBSS et placez la boîte sous un stéréomicroscope. Détachez le foie et les reins pour exposer le pancréas à l’aide de pinces fines pour retirer le pancréas de l’estomac, du duodénum et de la rate. Au fur et à mesure que chaque pancréas est prélevé, transférez le tissu dans un tube conique contenant un tampon digestif fraîchement préparé et placez le tube sur de la glace.

Lorsque tout le pancréas a été prélevé, transférez les tissus dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec une agitation à 700 tr/min, en inversant manuellement les tubes trois à quatre fois après 15 minutes. Si de gros morceaux de pancréas sont toujours présents après la première moitié de la digestion, retournez le tube toutes les cinq minutes pendant les 15 dernières minutes et incubez le tissu pendant cinq à 10 minutes supplémentaires si nécessaire. À la fin de la digestion, placez les tubes sur de la glace et ajoutez 10 millilitres de HBSS froid à chaque échantillon.

Récupérez les cellules par centrifugation et remettez les granulés en suspension dans deux millilitres de PBS frais. Ensuite, filtrez les cellules à travers des passoires de 35 microns dans des tubes de collecte en polystyrène à fond rond de cinq millilitres et lavez les tubes de digestion avec deux millilitres de PBS frais en filtrant les lavages dans leurs tubes de collecte correspondants. Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules et aspirez soigneusement les surnageants sans déranger les granulés.

Remettre les cellules en suspension dans le tampon de tri en fonction de l’âge des animaux et les filtrer à travers de nouvelles crépines cellulaires de 35 microns dans de nouveaux tubes de collecte de cinq millilitres. Aliquote de 50 à 100 microlitres de cellules dans de nouveaux tubes FACS pour les contrôles de coloration, y compris un tube pour chaque fluorophore, le colorant de viabilité, les protéines fluorescentes et un contrôle non coloré. Lavez chaque tube avec jusqu’à quatre millilitres de tampon de tri, puis centrifugez-le.

Ensuite, remettez les granulés en suspension dans un tampon de tri frais en fonction de l’âge des animaux. Colorez ensuite les cellules avec le colorant de viabilité. Pour le tri cellulaire avant l’extraction de l’ARN, immédiatement avant le début du tri, enrobez un tube de prélèvement stérile de 1,5 millilitre avec un millilitre de tampon de tri contenant un inhibiteur de l’ARNase.

Après cinq minutes, faites tourbillonner le tube de collecte et retirez le liquide. Vortex le premier contrôle de coloration et charge le tube dans le cytomètre en flux pour commencer à déterminer les paramètres de tri. Lorsque tous les paramètres de tri ont été définis, chargez les échantillons et triez les cellules dans des tubes de collecte de 1,5 millilitre.

Récupérez ensuite les cellules triées par centrifugation. Aspirez le surnageant jusqu’à la pastille et extrayez l’ARN selon les protocoles d’extraction d’ARN standard. Ici, l’ensemble isolé du tractus gastro-intestinal, y compris l’estomac, la rate, l’intestin et le pancréas d’un embryon embryon au 15e jour et d’un chiot au quatrième jour postnatal est montré.

L’analyse par cytométrie en flux de cellules uniques de tissus pancréatiques embryonnaires, néonatals et adultes isolés comme nous venons de le démontrer révèle que les tissus pancréatiques transgéniques de tous les âges analysés contiennent des populations de cellules marquées YFP distinctes. Après tri, ces cellules mésenchymateuses peuvent être cultivées pour établir une lignée cellulaire pour au moins cinq passages. Notez la morphologie fibrotique des cellules cultivées typique des cellules mésenchymateuses.

Les cellules triées expriment le marqueur panmésenchymateux vementine, tel qu’analysé par qPCR après extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc. De plus, l’expression isolée d’un marqueur de surface cellulaire pancréatique indique que toutes les cellules marquées par fluorescence dans le pancréas transgénique YFP expriment CD9, une glycoprotéine de surface cellulaire qui serait exprimée par les fibroblastes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage de l’ARN peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’expression des gènes des cellules mésenchymateuses.