L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

L'objectif général de cette expérience est de montrer comment l'utilisation du conditionnement classique oculaire par trace, une forme d'apprentissage associatif, peut aider à détecter un dysfonctionnement hippocampique dans un modèle rat de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale. Des rats nouveau-nés sont exposés à une forte dose d'alcool, à une concentration de 11,9 % volume/volume, administrée de manière similaire à un épisode d'ivresse. Cette exposition a lieu pendant la période équivalant au troisième trimestre humain en ce qui concerne la croissance cérébrale.

Ce schéma d'exposition à l'alcool et la dose sont des facteurs clés dans la production de déficits cérébraux au cours de la vie, imitant les cas humains de TSAF. Une région cérébrale importante compromise par une exposition précoce à l'alcool est l'hippocampe. Une fois les rats adultes, on examine leur dysfonction hippocampique à l'aide d'un conditionnement classique oculaire en trace.

Il s'agit d'une forme d'apprentissage associatif de haut niveau qui dépend de l'intégrité de l'hippocampe. Du quatrième au neuvième jour suivant la naissance, les ratons sont pesés chaque matin et leurs masses sont enregistrées. Les volumes d'alimentation sont ensuite déterminés à partir d'un tableau pré-imprimé en fonction du poids corporel.

Une solution d'alcool à 11,9 % en volume est administrée à des ratons en deux prises séparées par deux heures. La dose quotidienne totale d'alcool est de 5,25 grammes par kilogramme par jour. Ce paradigme d'exposition ponctuelle délivre 0,278 millilitres d'alcool par gramme de poids corporel par prise, en solution dans le lait.

Extraire le lait contenant de l'alcool à l'aide d'une seringue stérile d'un millilitre. Ensuite, expulser l'excès de solution pour obtenir la quantité exacte nécessaire. Plonger l'extrémité du tube PE-10 dans de l'huile de maïs fraîche.

Cela facilite l'insertion. Mesurer la longueur du tube en PE-10 depuis la bouche du petit jusqu'à son estomac. Si nécessaire, ajuster le bouchon en PE-50 pour qu'il serve de repère visuel indiquant le point d'arrêt.

Insérez soigneusement le tube PE-10 dans la bouche du petit. Vous rencontrerez généralement une certaine résistance lorsque l'extrémité atteint la gorge. Manœuvrez le tube jusqu'à ce que son extrémité s'incurve vers l'entrée de l'œsophage.

Veillez à ne pas laisser le tube glisser vers l'arrière, car il peut être glissant à cause de l'huile. Poursuivez dans l'œsophage et, lorsque l'extrémité franchit le sphincter gastro-œsophagien, elle pénétrera alors dans l'estomac. Arrêtez-vous à ce stade, stabilisez la pompe et administrez la solution.

Cela doit être fait lentement. Retirez soigneusement le tube PE-10 et examinez le petit pour détecter un reflux de solution, du sang ou une lésion physique. Remplacez le petit par ses camarades de portée s’il est en bon état.

Se référer au protocole écrit et à la liste de matériel pour connaître les instruments spécifiques utilisés dans la procédure de chirurgie des paupières. Stériliser le champ opératoire avec un désinfectant approuvé et stériliser tous les instruments et fournitures chirurgicaux au moyen d'un autoclave bien à l'avance. Après avoir induit une anesthésie appropriée chez le rat à l'aide d'isoflurane, raser sa tête à l'aide d'un tondeur, en exposant une surface cutanée suffisante pour le site d'incision et la paupière gauche.

La peau est stérilisée en effectuant trois frictions alternées avec de l'alcool isopropylique à 70 % et de la povidone iodée. Suivre la procédure standard pour fixer le rat sur l'appareil stéréotaxique à l'aide des barres auriculaires. Procéder à la chirurgie lorsque le rat présente un plan anesthésique adéquat.

Utilisez la lame de scalpel pour pratiquer une incision antéropostérieure au niveau de la ligne médiane. Cette incision doit exposer une zone suffisante située en avant des yeux et légèrement en arrière de la ligne lambdoïde. Utilisez la lame de scalpel pour gratter délicatement le périoste situé au-dessus du crâne, en prenant soin de ne pas provoquer de saignement excessif.

Retirez l'excès de tissu conjonctif et de sang à l’aide d’un coton-tige et rincez la zone avec du sérum physiologique stérile entre chaque raclage. Percez un trou en partant juste derrière la suture coronale sur un os pariétal. Éliminez tout sang et débris osseux à l’aide d’un coton-tige.

Utilisez une pince fine pour saisir une vis 0 80. Utilisez un tournevis de bijoutier pour fixer la vis dans le trou, serrez-la suffisamment sans endommager le tissu cérébral cortical, généralement de trois à quatre tours complets. Suivez la même procédure pour fixer les vis restantes.

Deux vis doivent être fixées de manière bilatérale derrière la suture coronale et une sur l'os pariétal droit, en avant de la suture lambda. Saisir la peau supérieure au niveau du site d'incision de l'œil gauche à l’aide de la pince chirurgicale de quatre pouces et orienter la pince chirurgicale de trois pouces vers le coin de cet œil. Prendre une aiguille de calibre 26 et de 3/8 de pouce, puis l’insérer dans le coin de la paupière.

Positionnez l’aiguille de manière à ce que le bord biseauté soit orienté vers le haut. Insérez la deuxième aiguille au milieu de la paupière. Utilisez une pince fine pour saisir un fil 3T et insérez-le dans l’une des aiguilles.

Il n'est pas nécessaire de l'insérer complètement. Suivez la même procédure pour le deuxième fil 3T. Saisissez les deux aiguilles d'une main tout en tenant l'étage de tête de l'autre main.

D'un seul mouvement continu, éloignez les aiguilles de la paupière tout en guidant le support de la tête dans la même direction. Tout en tenant le support de la tête pour l'EMG d'une main, utilisez la pince hémostatique de trois pouces de l'autre main pour enrouler le fil 10T autour d'une ou des deux vis situées du côté droit. Rabattez ce fil afin qu'il ne dépasse pas des vis.

La platine d'acquisition EMG doit être centrée avant de passer à l'étape suivante. Utilisez la pince hémostatique de quatre pouces pour créer une petite poche en séparant la peau, c'est-à-dire le fascia superficiel, du muscle temporal. Une fois la poche créée, utilisez les ciseaux à iris pour retirer davantage de tissu conjonctif, en travaillant vers l'angle de l'œil gauche.

Faites attention de ne pas aller trop profondément ni de sectionner de vaisseaux sanguins. Prenez une électrode bipolaire et façonnez le fil conducteur de manière à ce qu’il suive la courbure du muscle temporal. Les deux branches seront positionnées postérieurement à l’œil gauche, et l’extrémité inférieure de l’électrode bipolaire sera placée directement au sommet du crâne.

Mélanger la poudre Ortho Jet avec les composants liquides afin d'obtenir une consistance liquide. Appliquer la pâte à l’aide d’une micro-spatule tout autour du site d’incision. Faire attention à ne pas laisser tomber de pâte sur les yeux du rat et la maintenir confinée.

Laisser l'Ortho Jet atteindre un état semi-sec, puis utiliser la pince à échardes pour retirer l'acrylique excédentaire sur le support de tête EMG, ainsi que sur les filets de l'électrode bipolaire. Couper le fil 3T excédentaire, en laissant quelques centimètres pour travailler.

Retirer soigneusement le blindage en PTFE de chaque fil 3T à l’aide de la pince microchirurgicale. Cela permet d’établir le contact avec le muscle orbiculaire des paupières. Utiliser la pince microchirurgicale pour former des crochets à chaque extrémité des fils 3T.

Retirez le fil excédentaire en prenant soin de ne pas en couper trop, afin que le fil restant ne se rétracte pas dans la paupière. Le câblage est fabriqué en interne. La fiche bipolaire blanche est branchée en premier, ce qui permet la délivrance du stimulus US de choc.

La fiche orange du préamplificateur EMG est connectée ensuite. Elle enregistre l'activité électromyographique lorsque le rat cligne des yeux. Les deux fiches aboutissent à un commutateur circulaire situé en haut du bras, qui maintient la continuité du signal tandis que le rat se déplace librement.

L'isolateur de stimulus est activé et les derniers contrôles matériels sont effectués. Cela inclut le réglage de la ligne de base de l'EMG à un niveau visible sur l'écran de l'ordinateur. Lors de la première séance, l'intensité du choc est d'abord fixée à 4 milliampères et sera augmentée par paliers de 4 milliampères toutes les deux séances.

Cette procédure d'habituation progressive permet à un rat de s'acclimater au stimulus de choc. Dès le huitième essai, l'intensité du choc est maintenue à 1,6 milliampères pendant toute cette séance et toutes les séances ultérieures. Un ordinateur distinct exécute un oscilloscope numérique à quatre canaux, ce qui nous permet d'effectuer des diagnostics de signaux en temps réel.

Remarquez le clignement de l'œil émis par le rat dans la boîte numéro un. L'oscilloscope indique également que le signal EMG de base est relativement propre, avec un bruit faible. Les webcams nous permettent également de surveiller chaque rat.

Il s'agit d'une capture d'écran du logiciel blink version 4.0 qui montre une période d'essai d'une durée de 1400 millisecondes. Pendant les 280 premières millisecondes, aucun stimulus n'est présenté afin d'obtenir une mesure de l'activité électromyographique (EMG) de base. La ligne jaune indique le seuil à partir duquel toute réponse EMG dépassant de 4 volts la valeur moyenne de la période de référence pré-CS sera considérée comme une réponse de clignement oculaire.

Le stimulus conditionnel sonore de 85 décibels est délivré au moment de 280 millisecondes. Le son reste activé pendant 380 millisecondes, ce qui correspond au moment de 660 millisecondes. Après son extinction, un intervalle de 500 millisecondes s'écoule sans présentation de stimulus. Cette période est appelée période de trace, durant laquelle le rat doit associer la fin du stimulus conditionnel sonore (CS) avec le début du stimulus non conditionnel (US) représenté par le choc, qui sera encore délivré au moment de 1160 millisecondes.

Le CS de choc dure 100 millisecondes. Naturellement, le CS de choc provoque une réponse de clignement défensive appelée réponse inconditionnée, ou RI, qui est mesurée dans une fenêtre temporelle de 140 millisecondes. Une séance d'entraînement comprend 100 essais.

Il y a 90 essais au cours desquels le CS et le US sont appariés, et tous les dix essais, seul le CS est présenté. Il y a 10 essais avec le CS uniquement par session. Ces essais nous permettent d’évaluer si l’apprentissage de l’association CS-US s’est produit ou non.

La réponse conditionnée, ou RC, s'exprime en l'absence du stimulus non conditionné (US) de choc. L'intervalle inter-essai est en moyenne de 30 secondes, de sorte que le début de chaque essai ne soit pas prévisible. Lors d'un essai donné, un rat peut cligner des yeux à tout moment et son activité EMG est enregistrée par le logiciel.

Tout clignement d’œil discret qui dépasse la ligne seuil sera considéré comme une réponse appartenant à l’une des quatre catégories, selon le moment où il se produit et l’epoch de l’essai. Si le rat cligne des yeux durant les 80 premiers millisecondes suivant le début du ton (CS), la réponse est considérée comme une réponse de sursaut ou SR. Il s’agit d’une réponse non associative, indicatrice de la performance sensorimotrice, mais ne reflétant pas en soi l’apprentissage de l’association CS-US. S’il cligne des yeux après la période de SR mais avant la délivrance du choc (US), alors il a émis une réponse conditionnée.

Comme mentionné précédemment, la RC est la mesure principale de l'apprentissage associatif. On ne s'attend pas à ce que la RC se développe durant les premières phases de l'entraînement, mais à mesure que l'entraînement progresse au fil de nombreux essais et séances, ces types de réponses deviennent plus fréquents, d'amplitude plus élevée, et peuvent être mieux synchronisés. Nous divisons les RC en deux types : les RC totales et les RC adaptatives.

Les RC totales reflètent la capacité générale d'apprentissage, tandis que les RC adaptatives reflètent la capacité de l'animal à bien synchroniser son clignement. Immédiatement avant le début du choc, l'animal se prépare en produisant une RC adaptative durant une période de 200 millisecondes précédant l'apparition du stimul US du choc. Chez les mammifères possédant un hippocampe intact, l'expression des RC adaptatives reflète une implication importante de l'hippocampe dans la synchronisation adéquate du clignement par rapport à la présentation des deux stimuli.

Par sa nature même, la conditionnement classique du clignement de paupière en trace est beaucoup plus difficile à acquérir que le conditionnement classique du clignement de paupière en délai, dans lequel le CS tonal et l'US choc se chevauchent dans le temps. Bien que l'expression des RC puisse varier d'un sujet à l'autre et puisse être fortement affectée par des perturbations de circuits cérébraux spécifiques, on s'attend à ce que le RI soit émis lors de chaque essai apparié CS-US. En tant que tel, cette mesure reflète la performance sensorimotrice et, comme les réponses de sursaut, n'indique pas en soi l'apprentissage de l'association CS-US.

Dans la série suivante de courtes vidéos, vous verrez la configuration du logiciel et le début de l'entraînement au clignement des yeux. Le logiciel de clignement est activé et les deux fichiers pertinents sont chargés. Un fichier de rat contenant les données du sujet, et le fichier de conditionnement au clignement des yeux en trace.

Le programme est configuré avant le début de l'entraînement. Dès le début de l'entraînement, observez qu'un minuteur situé en bas à droite de l'écran décompte le temps restant jusqu'au prochain essai. Voici un enregistrement vidéo en direct de la session 1, essai 15, au cours duquel une UR est émise mais aucune CR n'est encore apparue.

Voici une répétition à un tiers de la vitesse. Dans la série de courtes séquences suivante, vous verrez des captures d'écran du même rat témoin non intubé au fur et à mesure de son avancement à travers six séances d'entraînement. Il finit par émettre à la fois des RC totales et des RC adaptatives.

Voici un extrait vidéo en direct de la session six, essai 96, où deux clignements oculaires sont émis, l'un étant un RC adaptatif et l'autre un RU. Voici une répétition à un tiers de la vitesse. Dans ce dernier extrait, vous verrez une vidéo en direct d'un rat intubé à l'alcool lors de son dernier essai de la session six, un essai CS uniquement ; même après 600 essais d'entraînement, il n'émet pas de façon fiable un RC adaptatif. Une fois les données recueillies, elles sont examinées pour détecter les mauvais essais, qui comprennent des artefacts de bruit élevé et une activité EMG inhabituelle de la ligne de base pré-CS, à l'aide d'un algorithme d'erreur intégré permettant de repérer les valeurs aberrantes.

Les essais corrects conservés sont ensuite analysés pour les réponses conditionnées (RC), les réponses non conditionnées (RNC), le nombre total de réponses conditionnées et les réponses conditionnées adaptatives, en fonction du pourcentage de réponses, de l'amplitude, de la latence et d'autres mesures critiques. La moyenne des réponses conditionnées adaptatives au cours de six séances d'entraînement est présentée dans ce premier ensemble de résultats. Les différences concernant le pourcentage et l'amplitude des réponses étaient statistiquement significatives entre le groupe ayant reçu de l'alcool par intubation et les deux groupes témoins, de la deuxième à la sixième séance.

Cela indique que la fréquence et l'intensité des réponses conditionnées adaptatives étaient altérées chez les rats exposés à l'alcool pendant le développement précoce. Les réponses non conditionnées moyennes sont présentées dans ce second ensemble de résultats. Les mesures de fréquence et d'amplitude n'étaient pas statistiquement différentes entre les groupes.

Ces résultats indiquent que l'exposition précoce à l'alcool n'a pas altéré la capacité des rats à cligner des yeux en réponse au stimulus non conditionné, mais que l'altération observée était due à un échec d'association adéquate entre le CS et le US pendant la phase d'acquisition. Dans cette expérience, nous avons examiné la relation entre le cerveau et le comportement en déterminant si une exposition développementale à l'alcool administrée selon un mode comparable à des prises excessives affecte l'hippocampe, comme en témoignent des déficits dans le conditionnement classique du clignement palpébral avec intervalle interstimulus. En effet, le conditionnement classique du clignement palpébral constitue un outil utile pour évaluer les conséquences neurocomportementales associées à l'exposition à l'alcool durant le développement cérébral.

Il est très polyvalent, car en modifiant les paramètres du stimulus ou les exigences de l'apprentissage associatif, on peut également évaluer l'intégrité fonctionnelle de différents systèmes cérébraux situés en dehors de l'hippocampe. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des subtilités liées à l'administration d'alcool à des ratons néonatals, à l'implantation d'électrodes et à la réalisation de la procédure de test du clignement oculaire. Nous vous remercions d'avoir regardé cette vidéo.