L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

L’objectif global de cette expérience est de démontrer comment l’utilisation du conditionnement classique de trace eyeblink, une forme d’apprentissage associatif, peut aider à détecter le dysfonctionnement de l’hippocampe dans un modèle de rat de troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale. Les ratons nouveau-nés sont mis au défi avec une forte dose d’alcool, une concentration de 11,9 % d’alcool en volume à la manière d’une frénésie. Pendant l’équivalent d’un troisième trimestre chez l’homme en ce qui concerne la croissance du cerveau.

Ce type d’exposition à l’alcool et la dose sont des facteurs clés dans la production de déficits cérébraux au cours de la vie, imitant les cas humains de TSAF. L’hippocampe est une région importante du cerveau qui est compromise par une exposition précoce à l’alcool. Une fois que les rats ont grandi à l’âge adulte, ils sont examinés pour le dysfonctionnement de l’hippocampe à l’aide du conditionnement classique du clignement des yeux.

Il s’agit d’une forme d’apprentissage associatif de haut niveau qui repose sur l’intégrité de l’hippocampe. Du quatrième au neuvième jour postnatal, les ratons sont pesés chaque matin et leur poids est enregistré. Les volumes d’alimentation sont ensuite obtenus à partir d’un tableau pré-imprimé basé sur le poids corporel.

Une solution d’alcool à 11,9 % en volume est administrée aux petits rats en deux repas espacés de deux heures. La dose quotidienne totale d’alcool est de 5,25 grammes par kilogramme par jour. Ce paradigme d’exposition excessive fournit 0278 mils d’alcool par gramme de poids corporel par tétée dans une solution de lait.

Extrayez le lait contenant de l’alcool à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre. Ensuite, poussez l’excès de solution pour obtenir la quantité exacte nécessaire. Trempez l’extrémité du tube PE-10 dans de l’huile de maïs fraîche.

Cela facilite l’insertion. Mesurez la longueur du tube PE-10 de la bouche du chiot à son estomac. Si nécessaire, ajustez la butée PE-50 pour qu’elle serve de guide visuel pour le point d’arrêt.

Insérez soigneusement le tube PE-10 dans la bouche du chiot. Vous rencontrerez généralement une certaine résistance lorsque la pointe rencontre la gorge. Manœuvrez le tube jusqu’à ce que l’extrémité se plie à l’entrée de l’œsophage.

Essayez de ne pas laisser le tube glisser vers l’arrière, car il pourrait être glissant avec l’huile. Descendez dans son œsophage et au fur et à mesure que l’extrémité passe le sphincter gastro-œsophagien, il entrera alors dans son estomac. Arrêtez-vous à ce stade, stabilisez la pompe et délivrez la solution.

Cela devrait se faire à un rythme lent. Retirez soigneusement le tube PE-10 et examinez le chiot à la recherche d’un lavage à contre-courant de solution, de sang ou de blessure physique. Remplacez le chiot par ses compagnons de portée s’il va bien.

Reportez-vous au protocole écrit et à la liste des matériaux pour connaître les instruments spécifiques utilisés dans la procédure de chirurgie des paupières. Stérilisez le champ opératoire avec un désinfectant approuvé et autoclavez tous les instruments et fournitures chirurgicaux à l’avance. Après avoir induit une anesthésie appropriée chez le rat avec de l’isoflurane, rasez sa tête à l’aide d’une tondeuse à fourrure, en exposant une quantité suffisante de peau pour le site d’incision et la paupière gauche.

Sa peau est stérilisée en effectuant trois gommages alternés à base d’alcool isopropylique à 70 % et de povidone iodée. Suivez la procédure standard pour fixer le rat à l’appareil stéréotaxique avec les barres d’oreille. Procédez à l’opération lorsque le rat présente un plan anesthésique approprié.

Utilisez la lame du scalpel pour faire une incision antérieure postérieure sur la ligne médiane. Cette incision doit exposer suffisamment de zone en avant des yeux et légèrement en arrière de la ligne lambda suturale. Utilisez la lame du scalpel pour gratter le périoste sur le dessus du crâne, avec précaution, afin de ne pas provoquer de saignements excessifs.

Essuyez l’excès de tissu conjonctif et de sang avec un coton-tige et rincez la zone avec une solution saline stérile entre les éraflures. Percez un trou commençant directement derrière la suture coronale sur un os pariétal. Enlevez tout débris de sang et d’os à l’aide d’un coton-tige.

Utilisez une pince à échardes pour saisir une vis 0 80. Utilisez un tournevis de bijoutier pour fixer la vis au trou, serrez la vis juste assez sans endommager le tissu cérébral cortical, généralement trois à quatre tours complets. Suivez la même procédure pour fixer les vis restantes.

Il doit y avoir deux vis fixées bilatéralement derrière la suture coronale et une sur l’os pariétal droit, en avant de la suture lambda. Saisissez la peau supérieure au site d’incision de son œil gauche avec la pince à pansement de quatre pouces et dirigez la pince à pansement de trois pouces vers le coin de cet œil. Prenez une aiguille de calibre 26 3/8 de pouce et insérez-la dans le coin de la paupière.

Faites pivoter l’aiguille de manière à ce que le côté biseauté soit face vers le haut. Insérez la deuxième aiguille au milieu de la paupière. À l’aide d’une pince fine, saisissez un fil 3T et insérez-le dans l’une des aiguilles.

Vous n’avez pas besoin de l’insérer complètement. Suivez la même procédure pour le deuxième fil 3T. Saisissez les deux aiguilles d’une main tout en saisissant la tête de l’autre main.

En un mouvement continu, retirez les aiguilles de la paupière tout en guidant la tête dans la même direction. Tout en tenant l’étage de tête EMG d’une main, utilisez la pince de pansement de trois pouces de l’autre main pour enrouler le fil 10T autour d’une ou des deux vis sur le côté droit. Rangez ce fil de manière à ce qu’il ne dépasse pas des vis.

L’étage de tête EMG doit être centré avant de passer à l’étape suivante. Utilisez la pince à pansement de quatre pouces pour créer une petite poche en séparant la peau, c’est-à-dire le fascia superficiel du muscle temporal. Une fois la poche créée, utilisez les ciseaux de l’iris pour couper plus de tissu conjonctif, en travaillant vers le coin de l’œil gauche.

Veillez à ne pas aller trop profondément ou à ne pas couper les vaisseaux sanguins. Prenez une électrode bipolaire et façonnez le fil conducteur de manière à ce qu’il puisse être ajusté le long de la courbure du muscle temporal. Les deux broches seront situées à l’arrière de l’œil gauche et l’extrémité inférieure de l’électrode bipolaire sera située directement au-dessus du crâne.

Mélangez la poudre Ortho Jet dans les composants liquides pour obtenir une consistance liquide. Appliquez la pâte à l’aide d’une micro-spatule tout autour du site d’incision. Veillez à ne pas laisser tomber de pâte sur les yeux du rat et gardez-la contenue.

Laissez l’Ortho Jet atteindre un état semi-sec, puis utilisez la pince à échardes pour enlever l’excès d’acrylique sur l’étage de tête EMG. Et les fils de l’électrode bipolaire. Coupez l’excès de fil 3T, en laissant quelques centimètres pour travailler.

Retirez soigneusement le blindage en PTFE de chaque fil 3T à l’aide de la pince de micro-dissection. Cela leur permet d’entrer en contact avec le muscle orbicularis oculi. Utilisez la micro-pince à dissection pour créer des crochets à chaque extrémité des fils 3T.

Coupez l’excès de fil, en faisant attention de ne pas couper trop le fil restant pour qu’il se rétracte dans la paupière. Le câblage est réalisé en interne. La prise bipolaire blanche est connectée en premier, ce qui permet l’envoi du stimulus de choc américain.

La prise orange de l’étage de tête EMG est ensuite connectée. Il enregistre l’activité électromyographique pendant que le rat cligne des yeux. Les deux prises mènent à un commutateur rond au sommet du bras qui maintient la continuité du signal lorsque le rat se déplace librement.

L’isolateur de stimulus est mis en marche et les dernières vérifications matérielles sont effectuées. Cela inclut l’ajustement de la ligne de base EMG à un niveau visible sur l’écran de l’ordinateur. Lors de la première session, l’intensité du choc est d’abord réglée à 4 milliampères et sera augmentée en unités de 4 ampères tous les deux essais.

Cette procédure de mise en phase permet à un rat de s’acclimater au stimulus de choc. Au huitième essai, l’intensité du choc est maintenue à 1,6 milliampères tout au long de cette session et de toutes les sessions suivantes. Un ordinateur séparé fait fonctionner un oscilloscope numérique à quatre canaux qui nous permet d’effectuer des diagnostics de signal en temps réel.

Notez le clignement d’œil qui a été émis par le rat dans la première boîte. L’oscilloscope indique également que le signal EMG de base est relativement propre avec un faible bruit. Les webcams nous permettent également de surveiller chaque rat.

Il s’agit d’une capture d’écran de la version 4.0 du logiciel blink qui montre une période d’essai d’une durée de 1400 millisecondes. Au cours des 280 premières millisecondes, aucun stimulus n’est présenté pour obtenir une mesure de l’activité EMG de base. La ligne jaune indique la ligne seuil dans laquelle toute réponse EMG supérieure de 4 volts à la valeur de base moyenne pré-CS sera éligible en tant que réponse de clignement des yeux.

Le stimulus de condition de tonalité de 85 décibels est délivré au point de temps de 280 millisecondes. La tonalité reste activée pendant 380 millisecondes, ce qui correspond au point de temps de 660 millisecondes. Après s’être éteint, il y a un intervalle de 500 millisecondes où aucun stimuli n’est présenté C’est ce qu’on appelle la période de trace où le rat doit résoudre le décalage de la tonalité CS avec le début du choc US, qui doit encore être délivré à la marque des 1160 millisecondes.

L’amortisseur US dure 100 millisecondes. Naturellement, le choc provoqué par l’US provoque une réponse défensive connue sous le nom de réponse inconditionnée, ou UR, qui est mesurée dans une fenêtre de temps de 140 millisecondes. Une session de formation se compose de 100 essais.

Il y a 90 essais dans lesquels le CS et l’US sont appariés et tous les dix essais, seul le CS est livré. Il y a 10 essais de CS uniquement par session. Ces essais nous permettent de déterminer si l’on apprend ou non l’existence de l’association CS US.

Sous la forme de réponses de condition, ou CR est exprimé lorsque le choc US n’est pas présent. La moyenne de l’intervalle entre les essais est de 30 secondes, de sorte que le début de chaque essai n’est pas prévisible. Dans n’importe quel essai, un rat peut cligner des yeux à n’importe quel moment et son EMG sera enregistré par le logiciel.

Tout clignement discret qui dépasse la ligne de seuil sera considéré comme une réponse dans l’une des quatre catégories en fonction du moment où il se produit et de l’époque de l’essai. Si le rat cligne des yeux pendant les 80 premières millisecondes après le début de la tonalité CS, la réponse est considérée comme une réponse de sursaut ou SR. Il s’agit d’une réponse non associative qui est indicative de la performance sensorimotrice, mais pas de l’apprentissage de l’association CS US en soi. S’il clignote après la période de RS mais avant que le choc US ne soit délivré, alors il a émis une réponse conditionnée.

Comme mentionné précédemment, le RC est la principale mesure de l’apprentissage associatif. On ne s’attend pas à ce que la RC se développe au cours des premières phases de l’entraînement, mais au fur et à mesure que l’entraînement progresse sur de nombreux essais et sessions, ces types de réponses deviennent plus fréquents, plus amplitudes et peuvent être mieux synchronisés. Nous partitionnons les RC en deux types, les CR totales et les CR adaptatives.

Les RC totaux reflètent la capacité d’apprentissage générale tandis que les CR adaptatifs reflètent la capacité de l’animal à bien chronométrer son clignement des yeux. Immédiatement avant le début du choc, comme moyen de se préparer, la période CR adaptative est de 200 millisecondes avant le début du choc US. Chez les mammifères avec un hippocampe intact, l’expression des RC adaptatifs reflète une implication de haut niveau de l’hippocampe dans le bon timing du clignement par rapport à la délivrance des deux stimuli.

De par sa nature même, le conditionnement classique de trace eyeblink est beaucoup plus difficile à acquérir que le conditionnement classique de clignement d’œil différé où le ton CS et le choc US se chevauchent dans le temps. Bien que l’expression des RC puisse varier d’un sujet à l’autre et puisse être gravement affectée par des défis à des circuits cérébraux discrets, l’UR devrait être émis lors de chaque essai CS US apparié. En tant que telle, cette mesure reflète la performance sensorimotrice et, comme les réponses de sursaut, n’est pas indicative de l’apprentissage de l’association CS US en soi.

Dans la série de clips vidéo suivante, vous verrez le logiciel configuré et le début de l’entraînement au clignement des yeux. Le logiciel blink est activé et les deux fichiers pertinents sont recrutés. Un fichier rat contenant les données du sujet et le fichier de conditionnement de clignement des yeux.

Le programme est mis en place jusqu’au début de la formation. Au début de l’entraînement, remarquez qu’il y a un compte à rebours en bas à droite de l’écran qui compte à rebours jusqu’à la prochaine épreuve. Voici un enregistrement vidéo en direct de la première session, essai 15, où un UR est émis mais aucun CR ne s’est encore développé.

Voici un replay à un tiers de la vitesse. Dans la série de clips suivante, vous verrez des captures d’écran du même rat témoin non intubé alors qu’il progresse à travers six séances d’entraînement. Il finit par émettre à la fois des RC totaux et des RC adaptatifs.

Voici un clip vidéo en direct de la sixième session, essai 96, où deux clignements d’yeux sont émis, l’un un CR adaptatif et l’autre UR. Voici un replay à un tiers de la vitesse. Dans ce dernier clip, vous verrez une vidéo en direct d’un rat intubé d’alcool lors de son dernier essai de la sixième session, un essai CS uniquement, même après 600 essais d’entraînement, il n’émet pas de CR adaptatif de manière fiable. Une fois les données collectées, elles sont examinées pour détecter les mauvais essais, composés d’artefacts de bruit élevés et d’une activité EMG de base inhabituelle pré-CS à l’aide d’un algorithme d’erreur intégré pour détecter les valeurs aberrantes.

Les bons essais conservés sont analysés plus en détail pour les RS, les UR, les RC totaux et les RC adaptatifs en ce qui concerne le pourcentage de réponses, l’amplitude, la latence et d’autres mesures critiques. Les RC adaptatifs moyens sur six séances d’entraînement sont présentés dans cette première série de résultats. Les mesures en pourcentage et en amplitude étaient statistiquement significatives entre le groupe intubé d’alcool et les deux groupes témoins de la deuxième à la sixième séance.

Cela indique que la fréquence et la force des RC adaptatives étaient altérées chez les rats exposés à l’alcool au début du développement. Les réponses moyennes inconditionnées sont présentées dans cette deuxième série de résultats. Les mesures de fréquence et d’amplitude n’étaient pas statistiquement différentes entre les groupes.

Ces résultats indiquent que l’exposition précoce à l’alcool n’a pas altéré la capacité des rats à cligner des yeux au stimulus inconditionné, mais que l’altération qu’ils ont présentée était due à une incapacité à associer correctement le CS et l’US lors de l’acquisition. Dans cette expérience, nous avons examiné la relation entre le comportement cérébral et le comportement en déterminant si l’exposition à l’alcool dans le développement affecte l’hippocampe, comme en témoignent les déficits et le conditionnement classique du clignement des yeux. En effet, le conditionnement classique est un outil utile pour évaluer les conséquences neurocomportementales associées à l’exposition à l’alcool pendant le développement du cerveau.

Il est très polyvalent en ce sens qu’en modifiant les paramètres de stimulus ou les exigences d’apprentissage associatif, l’intégrité fonctionnelle de différents systèmes cérébraux en dehors de l’hippocampe peut également être évaluée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des subtilités de l’administration d’alcool aux ratons nouveau-nés, de l’implantation d’électrodes et de la procédure de test de clignement des yeux. Nous vous remercions d’avoir regardé cette vidéo.