A microfluidique débit Chambre Modèle pour Platelet Transfusion et Hémostase mesures Platelet Déposition et la formation de fibrine en temps réel

L’objectif global de cette expérience microfluidique est de mesurer simultanément le dépôt de plaquettes dans la formation de fibrine sur une surface réactive dans des conditions d’écoulement à l’aide de la vidéomicroscopie en temps réel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine transfusionnelle sur les effets de la préparation de concentré de plaquettes sur la nature procoagulante du sang transfusé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle facilite l’analyse simultanée de la fonction plaquettaire et de la coagulation dans le flux, ce qui permet d’examiner l’interaction entre les deux processus.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la procoagulation plaquettaire induite par la voie de contact, elle peut également être appliquée à l’étude de la voie extrinsèque en l’enrobant de facteur tissulaire lipidé. La démonstration de la procédure sera assurée par Rosalie Devloo, une technicienne du laboratoire. Commencez la configuration de la chambre d’écoulement microfluidique en pipetant 0,8 microlitre de collagène fraîchement reconstitué dans les cinq sixièmes de la longueur de chaque canal à une extrémité d’une nouvelle biopuce microfluidique jetable avec huit canaux parallèles droits et en étiquetant cette extrémité de la micropuce comme sortie.

Incuber la biopuce à quatre degrés Celsius pendant au moins quatre heures dans un récipient humidifié et scellé. À la fin de l’incubation, remplissez les canaux codés d’un nombre égal de canaux en forme de Y dans une biopuce de mélange avec tampon de blocage. Remettez la micropuce dans le récipient pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, placez une goupille à l’une des extrémités de deux morceaux de tube de huit centimètres de long et d’un morceau de tube de deux centimètres de long et aux deux extrémités d’un morceau de tube de 46 centimètres de long pour chaque canal utilisé. Ensuite, utilisez le logiciel Nanopump pour rincer tous les fluides de la pompe dans le tube connecté avec de l’eau distillée et une seringue dans la goupille du connecteur de seringue pour remplir tous les autres tubes avec un tampon de blocage. Ensuite, fixez la biopuce codée sur la platine du microscope automatisé à l’aide d’un cric à ciseaux de laboratoire pour fixer la biopuce de mélange à la même hauteur que la platine du microscope.

Utilisez les broches des tubes de huit centimètres pour fixer ces morceaux de tube à l’entrée de la biopuce de mélange et placez l’extrémité libre de chaque tube dans un flacon de solution saline tamponnée HEPES. Maintenant, connectez la biopuce codée à la biopuce de mélange avec le morceau de tube de 46 centimètres en une ligne flexible mais droite. Fixez une goupille de connecteur de seringue au tube compatible Luer de la pompe de rinçage.

Ensuite, connectez la goupille à l’extrémité libre du morceau de tube de deux centimètres et fixez l’autre extrémité du tube à la sortie de la biopuce codée. Ensuite, rincez tous les tubes et les canaux avec un millilitre de HBS. Pour préparer les pompes de perfusion, ouvrez le logiciel Microfluidic Perfusion Pump Driver et double-cliquez sur l’icône des seringues pour initialiser les pompes.

Sélectionnez le type de seringue qui sera utilisé et débranchez la pompe de rinçage et le tube de deux centimètres qui y est connecté. Connectez le tube déconnecté de deux centimètres avec sa goupille de connecteur de seringue au luer lock d’un morceau de tube de vidange à paroi épaisse et utilisez une seringue pour remplir le tube à paroi épaisse avec une solution de pepsine standard. Ensuite, fixez l’extrémité ouverte du tube à paroi épaisse à l’aide d’une pince Kocher.

Épinglez le tube à la sortie de la biopuce codée. Débranchez les deux tubes de la chambre d’écoulement de mélange ensemble et jetez les récipients de HBS. Après avoir obtenu l’échantillon de sang dans des récipients de citrate de sodium sous vide, centrifugez les tubes et transférez le plasma riche en plaquettes dans un nouveau tube de centrifugation.

Faites tourner à nouveau les récipients avec du plasma riche en plaquettes. Ensuite, transférez le plasma pauvre en plaquettes surnageantes dans un autre tube à centrifuger. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 21 pour perforer le fond des récipients de citrate de sodium afin de permettre aux globules rouges emballés de s’égoutter dans un nouveau tube conique.

Lorsque tous les globules rouges emballés ont été prélevés, reconstituez doucement le sang en combinant des globules rouges emballés séparés avec du plasma pauvre en plaquettes et ajoutez des plaquettes de banque de sang préparées pour la transfusion pour obtenir des échantillons avec un hématocrite de 40 % et une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième plaquette par microlitre pour un volume final de 2,5 millilitres et obtenez une formule sanguine complète. Ensuite, ajoutez 13 microlitres de fibrinogène marqué au fluorophore dans un tube conique en polystyrène. Suivi d’un millilitre de sang reconstitué.

Mélangez un autre millilitre de sang avec deux microlitres de colorant plaquettaire fluorescent et ajoutez les échantillons de sang étiquetés ensemble. Ensuite, inversez doucement les échantillons de sang mélangé et incubez les cellules pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Avant de commencer le test de perfusion, concentrez l’optique du microscope sur les fibres de collagène adhérant au bas du premier canal.

À l’aide du logiciel d’acquisition, définissez une zone d’intérêt dans le canal sélectionné. Chargez un millilitre de tampon de coagulation préchauffé dans une seringue d’un millilitre et montez la seringue sur la pompe de perfusion. Après une deuxième inversion douce, chargez le sang dans une seringue de deux millilitres et montez la seringue sur la pompe de perfusion.

Ensuite, utilisez une goupille de connecteur de seringue pour fixer les deux seringues à un morceau de tube de huit centimètres et amorcez les connecteurs et les tubes à 400 microlitres par minute. Lorsque tout le tube est rempli d’un tampon de coagulation ou de sang, épinglez l’autre extrémité des deux tubes aux jambes fendues du canal en forme de Y dans la biopuce de mélange. Ensuite, retirez la pince Kocher à la sortie du tube de vidange et lancez la perfusion à 4,4 microlitres par minute pour le tampon de coagulation et 44 microlitres par minute pour le sang reconstitué.

Enregistrez des images toutes les 10 secondes pendant 30 minutes en temps réel, en arrêtant les pompes et l’acquisition d’images après 30 minutes ou lorsque le signal devient saturé. Ensuite, jetez tous les tubes et les seringues comme déchets biologiques dangereux. Cette vidéo fournit un excellent exemple de l’accumulation de thrombus plaquettaires et du dépôt de fibrine.

Au début de la perfusion, les plaquettes ont adhéré à la surface réactive, ce qui a entraîné une augmentation constante de la fluorescence verte enregistrée. Au cours de cette phase d’adhésion, il y a peu de fluorescence violette indiquant que la fibrine n’est que marginalement formée. Lors de l’initiation de la coagulation, la fibrine fluorescente violente se dépose rapidement et la fluorescence verte plaquettaire s’accumule à peu près au même rythme.

Un moment d’apparition de la coagulation peut donc être extrapolé comme un déterminant du potentiel de procoagulation plaquettaire. L’ajout d’un inhibiteur de trypsine de maïs au sang reconstitué n’affecte pas l’adhésion plaquettaire mais la coagulation ne commence pas pendant toute la durée de l’expérience de perfusion. En augmentant le nombre de plaquettes dans un échantillon reconstitué, le taux d’adhésion, d’accumulation et de coagulation augmente linéairement.

Le moment de l’apparition est considérablement raccourci par l’augmentation de la concentration plaquettaire, ce qui suggère qu’un nombre seuil de plaquettes déposées activées est nécessaire pour déclencher la coagulation. De plus, dans une analyse appariée de canaux recouverts de collagène uniquement, ou en combinaison avec le facteur de tissu lipidique recombinant, le début de la coagulation est significativement plus rapide, bien que ni le taux global de coagulation, ni l’accumulation de plaquettes, ne soient différents entre les conditions. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une expérience de chambre d’écoulement microfluidique avec du sang reconstitué doublement marqué pour l’analyse simultanée de la fonction plaquettaire et de la coagulation.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la médecine transfusionnelle pour explorer les interactions entre les plaquettes et la coagulation sous flux. Dans cette vidéo, nous nous sommes concentrés sur la démonstration d’une expérience standardisée. Mais des modifications du revêtement de surface, des contraintes de bouclier ou de la concentration de calcium peuvent être introduites pour répondre à des questions de recherche spécifiques d’intérêt.