Name: Méthode Agitateur magnétique pour la détection des Trichinella Larves dans les échantillons de muscle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Découvrez la méthode d'agitateur magnétique pour détecter les larves de Trichinella dans les échantillons de muscle. Cette technique standard en parasitologie assure une inspection fiable de la viande.

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Nous remercions de bien vouloir Sabine Reckinger pour une excellente assistance technique et de soutien.

1. Préparatifs <ol><li> Collecte d&#39;échantillons Note: La méthode de l&#39;agitateur magnétique peut être utilisé pour des échantillons musculaires simples ou groupés. <ol><li> Prélever des échantillons à partir des sites de prédilection appropriés et en une quantité appropriée 9. Reportez-vous aux exigences du pays ou aux recommandations des TIC, de l&#39;OIE ou ISO. <ol><li> Pour l&#39;Union européenne, par exemple, prendre un échantillon de 1 g d&#39;un pilier de diaphragme à la transition vers la partie tendineuse des porcs domestiques. Veiller à ce que tous les échantillons de muscle sont exempts de toutes les graisses et le fascia. </li></ol></li><li> Si la languette est testée, enlever la couche superficielle avant l&#39;essai. </li><li> Prenez garde si les échantillons sont congelés, comme la plupart des larves de Trichinella ne sont pas geler résistants et déroulez après la mort, sont moins résistants à la digestion et ont tendance à coller aux parois du récipient, ce qui entraîne la sensibilité du test a diminué. Remarque: En cas de gel, le double de la taille de l&#39;échantillon à lest et augmenter le temps de sédimentation (voir ci-dessous). </li></ol></li><li> Préparation du liquide de digestion <ol><li> Ajouter HCl à 25% (16 ± 0,5 ml) à 2 litres d&#39;eau du robinet préchauffé à 46-48 ° C dans un bêcher de 3 L de verre. Trop faible d&#39;un résultat de température dans la digestion incomplète; trop élevé d&#39;une température désactive les propriétés enzymatiques de la pepsine. </li><li> Placez une tige d&#39;agitation dans le bécher, et agiter la solution sur une plaque préchauffée (46-48 ° C). </li><li> Ajouter 10 ± 0,2 g de pepsine (1: 10 000 NF, 1: 12.500 BP 2000 FIP) à la solution acide. Remarque: La qualité de la pepsine est de la plus haute importance et l&#39;activité enzymatique doivent être certifiés par le producteur. Pour des raisons de sécurité en laboratoire et pour maintenir l&#39;activité de la pepsine, la séquence d&#39;addition des composants du liquide de digestion doit être respectée. </li></ol></li><li> La préparation d&#39;échantillons de muscle <ol><li> Hacher jusqu&#39;à 100 g d&#39;échantillons de muscle dans un mélangeur ou un broyeur. Pour faciliter blending, ajouter 2 ml d&#39;eau préchauffée aux échantillons et mélanger à la vitesse max pour 2 - 3 s. </li><li> Avant le second mélange, ouvrir le mélangeur et transférer un échantillon de muscle en haut du bord marge bol de mélange vers le bas et répétez le mélange. Continuer le mélange avec des éclats de 2 - 3 s jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun fragments visibles de viande restent. Remarque: Trop peu de mélange peut entraîner une digestion incomplète, alors que trop de mélange peut endommager le Trichinella larves présentes dans les échantillons 6. </li></ol></li></ol> 2. procédure <ol><li> Muscle digestion de l&#39; échantillon <ol><li> Transfert 1 L du liquide de digestion dans un cylindre. Transférer la viande hachée dans le bécher et diffuser dans le liquide de digestion avec une cuillère ou une fourchette. Rincer soigneusement le bol couvercle du mélangeur, la lame et mélangeur avec 500 ml de liquide de digestion préchauffé dans le 3 L bêcher. Remarque: le rinçage incomplet peut entraîner la perte du sensibilité. </li><li> Couvrir le bécher avec une feuille d&#39;aluminium et de garder une température constante de 44-46 ° C et surveiller avec un thermomètre. </li><li> Agiter le liquide de digestion pendant 30 min pour créer un tourbillon profond sans éclaboussures jusqu&#39;à ce que les particules de viande disparaissent. Selon le type de viande testés (par exemple , la viande d&#39;animaux sauvages), augmenter le temps de la digestion jusqu&#39;à un maximum de 60 min. </li></ol></li><li> La filtration et la sédimentation du liquide de digestion <ol><li> Pour déterminer la quantité de tissu non digérés, ajuster la balance à zéro, peser le tamis avant utilisation, et noter son poids. Le tamis doit être propre et exempt de toutes les particules de tissu, ce qui pourrait entraver les larves de Trichinella atteindre l&#39;entonnoir de sédimentation. Vérifiez que l&#39;entonnoir de séparation est nivelé verticalement. </li><li> Après digestion, versez délicatement le liquide de digestion à travers un tamis de 180 um dans une ampoule de verre de séparation. La largeur de l&#39;entonnoir en verre de séparation ne doit pas be plus grand que 55% de la longueur pour permettre une bonne sédimentation des larves. Prenez soin d&#39;éviter tout débordement. </li><li> Pour éviter la perte de sensibilité, bien rincer le récipient en verre et le tamis avec environ 200 ml d&#39;eau du robinet d&#39;une bouteille de lavage de presser et transférer l&#39;eau de rinçage dans l&#39;entonnoir en verre de sédimentation. Prenez soin de rincer soigneusement les bords du 3 L bêcher. Soulevez le tamis et rincer la zone sous le tamis à fond. </li></ol></li><li> Détermination du montant des tissus non digérés Remarque: En raison d&#39;erreurs dans l&#39;exécution de la méthode, le tissu musculaire peut rester sur le tamis, comme fascia bien et du tissu conjonctif qui sont indigestes. La quantité de tissu non digéré est déterminé pendant la première étape de sédimentation de 10 min (voir 2.5). Cela permet à environ 30 min pour le tamis à sécher, car l&#39;eau résiduelle peut influencer le poids déterminé du tissu non digérés. <ol><li> Placez une serviette en papier sur une échelle, et peser le tamis avec les undigestissus ted. </li><li> Soustraire le poids de tamis avant la filtration à partir du poids de tamis avec des tissus non digérés. Le processus de digestion est considéré comme satisfaisant si pas plus de 5% du poids de l&#39; échantillon de départ reste sur le tamis ( par exemple 5 g / 100 g de matière de départ). </li><li> Si la quantité de tissu non digérés dépasse 5%, répéter le test en utilisant des échantillons de muscle frais. Si le tissu restant est principalement constitué de tissus musculaires non digérés et les échantillons frais ne sont pas disponibles, digérer les restes non digérés de nouveau et d&#39;examiner en plus des échantillons originaux. </li></ol></li><li> Décantation du liquide de digestion <ol><li> Garder le liquide de digestion filtré dans l&#39;ampoule à décanter pendant 30 min. Si elle reste intacte, les larves de Trichinella se déposent au fond de l&#39;entonnoir. </li><li> Si les échantillons congelés sont utilisés, augmenter le temps de sédimentation à un maximum de 60 min. </li><li> Une fois que la sédimentation est terminée, ouvrir complètement le robinetde l&#39;ampoule à décanter de laisser au moins 40 ml de liquide de digestion rapide de ruissellement dans un cylindre de mesure (80 mL si les échantillons musculaires avaient été préalablement congelés). </li><li> Tout d&#39;abord, laisser la moitié du fluide dans le cylindre, puis ouvrir complètement le robinet d&#39;arrêt dans le sens opposé pour permettre à 10 ml de liquide de digestion à passer. Enfin, ouvrir le robinet dans le sens opposé pour 10 ml. Cette procédure garantit que les larves de Trichinella ne sont pas pris au piège dans le robinet. Remarque: la vitesse suffisante est nécessaire pour éviter les larves restant dans l&#39;ampoule à décanter, diminution de la sensibilité. </li></ol></li><li> Sédimentation du liquide de digestion dans le cylindre <ol><li> Laisser le sédiment dans le cylindre pendant 10 minutes pour permettre aux larves de sédiments. Retirer 30 ml surnageant par aspiration avec une pipette sans perturber le sédiment 10 mL. </li><li> Pour réduire la quantité de fibres de tissus dans l&#39;échantillon, ajouter 30 ml d&#39;eau du robinet pour les sédiments et quitter pour un autre 10 mdans. Répétez jusqu&#39;à ce que le liquide est clair. </li><li> Retirer le surnageant et transférer lavé les 10 ml de sédiments dans une boîte de Petri grillagée ou d&#39;un bassin de comptage des larves. Rincer le cylindre avec 10 ml d&#39;eau du robinet, puis ajouter l&#39;eau à l&#39;échantillon. Remarque: Comme de grandes quantités de débris dans l&#39;échantillon peuvent empêcher l&#39;identification des larves de Trichinella (Figure 1), d&#39; autres étapes de lavage doivent être effectuées, si nécessaire. </li></ol></li><li> L&#39; examen microscopique <ol><li> Utiliser un trichinoscope ou un stéréo-microscope avec une source de lumière transmise sous-étage d&#39;intensité réglable à un 15 grossissement de 20X pour examiner les échantillons immédiatement après les étapes de lavage. </li><li> Après avoir versé l&#39;échantillon dans la boîte de Petri maillées, examiner le plat / bassin systématiquement grille en grille. Si aucune structure suspects sont trouvés, déplacez doucement le liquide dans la boîte de Pétri maillées ou d&#39;un bassin de comptage des larves de façon circulaire pour permettre à toute la Trichinellarvae, qui ont été potentiellement négligé, d&#39;accumuler dans le centre de la boîte de Pétri. Répétez l&#39;examen. </li><li> Si une structure suspect est trouvé, augmenter le grossissement de 40 - 100X. Retirer les larves de Trichinella du plat / bassin avec une pipette et de recueillir dans un tube avec 90% d&#39; éthanol. </li><li> Après le plat complet a été examiné, répétez la procédure, à partir de l&#39;agitation douce du plat / bassin. Répétez la procédure au moins trois fois ou jusqu&#39;à ce que plus les larves se trouvent. </li><li> Comptez le nombre de larves. Corréler la quantité de tissu musculaire testé et présente sous forme de larves par gramme (lpg). </li><li> Si un trop grand nombre de larves sont présentes dans le liquide de digestion pour déterminer le nombre de larves de manière fiable, retourner le fluide contenant les larves au cylindre de mesure, rincer à l&#39;eau du robinet d&#39;une bouteille de lavage de compression, et de laisser les larves à se déposer au fond. </li><li> Après un temps de sédimentation de 10 minutes, réduire le surnageant dans un volume défini (par exemple ,10 ml). Pour déterminer le volume exact, transférer le surnageant dans un nouveau cylindre avec une pipette. </li><li> Suspendre les larves de façon homogène dans le liquide par agitation vigoureuse. Pendant le mouvement secouant, ajouter 12 gouttes de 20 ul de suspension larvaire sur une boîte de Pétri. </li><li> Examinez chaque goutte au microscope. Déterminer le nombre de larves dans 240 pi et supprimer le nombre le plus élevé et le plus bas. Extrapoler le nombre de larves au volume total (par exemple 10 ml) de surnageant. Remarque: La qualité de la stéréo-microscope est d&#39; une importance primordiale pour l&#39;identification des larves de Trichinella. </li><li> Lorsque les larves sont collectées dans un tube par une pipette, vérifier soigneusement que les larves ne colle pas sur le mur de la pipette, mais sont transférés dans le tube. Remarque: les résultats positifs Trichinella à partir d&#39; échantillons mis en commun doivent faire remonter de la piscine à la carcasse d&#39;origine. Ici, la taille de la piscine doit être progressivement diminuée jusqu&#39;à ce que la carcasse positive est identifié. La taille de l&#39;échantillon peut également être augmenté au cours de ce processus pour augmenter la sensibilité. Lorsque l&#39;examen d&#39;un échantillon collectif produit un résultat positif ou incertain, un échantillon de 20 g est prélevé sur chaque porc. Les échantillons de 20 g de cinq porcs sont réunies et examinées à l&#39;aide du procédé décrit. De cette façon, des échantillons de 20 groupes de cinq porcs seront examinés. Lorsque Trichinella est détectée dans un échantillon groupé de cinq porcs, des échantillons de 20 g sont prélevés sur les porcs individuels dans le groupe et chacun est examiné séparément jusqu&#39;à la carcasse positive de l&#39; origine est détectée. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Bien que la méthode de l&#39;agitateur magnétique peut être facilement réalisée, ne respectant strictement les détails techniques conduit à une sensibilité insuffisante, mettant ainsi en danger la santé des consommateurs. Les points de contrôle critiques ont été mis en évidence dans le texte ci-dessus. En outre, l&#39;utilisation d&#39;un équipement approprié est crucial pour le succès de l&#39;essai. Tous les navires doivent être faits de bouts de verre et de pipettes revêtus de silicium pour réduire l&#39;adhérence des larves à la surface. La sensibilité de la méthode de digestion dépend de la densité des larves dans les muscles et la quantité d&#39;échantillon de muscle testé. Une densité des larves de 3 - 5 gpl des tissus musculaires, une sensibilité de 100% a été signalée, mais inférieure à 1 gpl la sensibilité a chuté à 40% 13. En fonction de l&#39;espèce animale hôte testé, la sensibilité du test peut être améliorée en augmentant la quantité d&#39;échantillon utilisée. ifardeau nfection chez les animaux sauvages est généralement faible, donc de plus grandes tailles d&#39; échantillons sont utilisés 14. Les sites de prédilection varient également chez les animaux hôtes. Ici, la plus faible digestibilité de certains tissus musculaires tels que la languette doit être prise en compte, ce qui peut également entraîner une plus grande taille des échantillons 15. En outre, il est important de comprendre que le procédé d&#39;agitation magnétique ne comprend pas les contrôles internes. Par conséquent, la gestion de l&#39;assurance qualité de l&#39;échantillonnage à la documentation est essentielle pour obtenir des résultats exacts et précis. La qualité de la performance du laboratoire pour détecter Trichinella larves dans les échantillons de muscle doit être contrôlée par une participation régulière de chaque analyste des tests de compétence. D&#39;autres limitations de la méthode est que la dernière étape d&#39;identification des larves musculaires par microscopie est très subjective et HEAvily dépend de la connaissance de la morphologie larvaire par l&#39;analyste d&#39;examen. Une méthode alternative intéressante pour contourner ce problème est la méthode d&#39;agitation magnétique / l&#39;isolement de filtration suivie d&#39;une détection des larves par un test d&#39;agglutination au latex. Toutefois, selon la législation de l&#39; UE cette méthode est seulement considéré comme équivalent pour l&#39;analyse de la viande de l&#39; espèce porcine domestique , mais pas pour les animaux qui sont à risque élevé d&#39;infection tels que le sanglier 4. L&#39;identification de l&#39;antigène larvaire avec des anticorps monoclonaux rend le test plus objectif, mais nie le laboratoire la possibilité de déterminer le nombre de larves par gramme de viande 16. D&#39;autres variantes de la méthode d&#39;agitation magnétique comprennent la mise en commun digestion de l&#39;échantillon technique / méthode de sédimentation assistée mécaniquement, la mise en commun dig échantillon assistée mécaniquementMéthode de estion / sur la technique d&#39;isolation du filtre, et le procédé de digestion automatique des échantillons groupés de la technique allant jusqu&#39;à 35 g. Ces techniques sont toutes basées sur la digestion artificielle de la viande et de la visualisation et le comptage des larves de Trichinella, mais diffèrent dans l&#39;équipement utilisé pour la filtration et de sédimentation étapes. Les larves isolé peut encore être identifié au niveau de l&#39; espèce par un test moléculaire (PCR , par exemple, multiplex) 17. Selon la législation européenne, tous les échantillons positifs doivent être transmis au laboratoire national de référence ou EURLP pour la détermination de l&#39; espèce Trichinella.

Les nématodes du genre Trichinella peuvent être détectés dans les muscles striés de carnivores et omnivores mammifères, les oiseaux et les reptiles dans le monde entier. Ces nématodes zoonotiques peuvent atteindre les êtres humains à l&#39;état cru ou viande semi-brut et de produits carnés provenant de porcs, chevaux et animaux de jeu sont ingérés. Cette zoonose peut être une maladie grave chez l&#39; homme , caractérisée par des signes et des symptômes pathognomoniques, par exemple la diarrhée, la fièvre, un oedème périorbitaire et des myalgies et des complications possibles telles que la myocardite, une maladie thromboembolique et l&#39; encéphalite 1. Trichinella spiralis est l&#39;agent étiologique le plus répandu de l&#39; infection à Trichinella chez les animaux sauvages et domestiques et provoque la plupart des infections humaines dans le monde entier. En Europe, du Nord et Afrique de l&#39; Ouest et l&#39; Asie occidentale, Trichinella britovi est une autre source d&#39;infections humaines. En outre, dix autres taxons sont moins fréquemment rapportés comme responsable<html> les agents de la maladie chez l&#39; homme et se retrouvent dans les différentes régions du monde, le plus souvent chez les animaux sauvages 2. En plus d&#39;animaux sauvages tels que le sanglier, les ours, les morses et les blaireaux, le porc représente la plus importante source d&#39;infection humaine dans le monde entier. La meilleure façon de prévenir la trichinellose est de ne pas manger les produits carnés crus et faire cuire de la viande, surtout la viande de gibier à des températures sécuritaires (&gt; 65 ° C pendant 1 min, pour changer la couleur de la viande du rose au brun dans le noyau de la produit de viande) 3. L&#39;Union européenne et l&#39; USDA ont précisé congélation et de cuisson des temps et températures pour les produits de porc qui peuvent être utilisés pour tuer les larves de T. spiralis dans la viande 4, 5. En outre, des recommandations pour l&#39;inactivation de Trichinella dans la viande et les produits carnés ont été publiés par la Commission internationale sur la trichinellose&quot;xref&quot;&gt; 6. En Europe, en plus de l&#39;introduction de conditions d&#39;hébergement contrôlées dans les troupeaux de porcs commerciaux où le risque d&#39;infection à Trichinella est négligeable, la prévention de la trichinellose humaine est basée sur l&#39;examen en laboratoire des échantillons musculaires provenant d&#39; animaux sensibles 4. Pour des raisons de sécurité alimentaire, des essais de digestion sont les seules procédures fiables pour la détection directe des larves de Trichinella dans la viande 3, 7. Même s&#39;il existe plusieurs variantes de l&#39;essai de la digestion, le procédé d&#39;agitation magnétique est la méthode admise au niveau international de référence 3, 4, 7. Ce dosage est basé sur la détection des larves de Trichinella dans les tissus musculaires striées. Après la digestion enzymatique des échantillons de muscle et de la filtration et la sédimentation des étapes ultérieures, TriLes larves chinella sont identifiées par microscopie. Selon les obligations commerciales et la législation nationale, il y a une multitude de petites variations dans le protocole général de la méthode de l&#39;agitateur magnétique. Ici, les détails techniques sont basées sur des exigences de l&#39; UE 4, les spécifications ISO 8, les lignes directrices des TIC 6, et l&#39;expérience du laboratoire de référence de l&#39; Union européenne pour les parasites (EURLP) et le Laboratoire allemand de référence pour Trichinella.

<table><tbody><tr><td>Couteau, ciseaux, pince à</td><td></td><td></td> épiler <td>Couper des échantillons et enlever les tissus non digestibles</td></tr><tr><td>Blender&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>Avec une lame tranchante</td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td> magnétique <td>Avec plaque chauffante à commande thermostatique</td></tr><tr><td>Tige</td><td></td><td></td><td>d’agitation Revêtement en téflon, d’environ 5 cm de long</td></tr><tr><td>Entonnoir</td><td></td><td></td> de séparation conique <td>en verre Capacité d’au moins 2 L, de préférence équipé de bouchons de sécurité en téflon. La largeur ne doit pas dépasser 55 % de la longueur pour permettre une bonne sédimentation de la larve.</td></tr><tr><td>Supports, anneaux et pinces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamis</td><td></td><td></td><td>Maille 180 microns, diamètre extérieur 11 cm, avec maille en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Entonnoir Diamètre</td><td></td><td></td><td>intérieur pas moins de 12&nbsp ; cm, pour supporter les tamis</td></tr><tr><td>Bécher</td><td></td><td></td> en verre <td>Capacité 3 L</td></tr><tr><td>Cylindre</td><td></td><td></td> doseur <td>en verre Capacité 50 à 100 mL, ou tube à centrifuger</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td></td><td></td><td>Avec une source lumineuse transmise sous-platine d’intensité réglable ou trichinoscope avec une table horizontale</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td></td><td></td><td>9 cm de diamètre, marqués sur leur face inférieure en 10 & ; Zones d’examen carrées de 10 mm à l’aide d’un instrument pointu ou d’un bassin de comptage des larves pour le tricinoscope</td></tr><tr>Feuille <td></td><td></td><td>d’aluminium</td><td>Alternativement un couvercle pour couvrir les béchers</td></tr><tr>Acide <td></td><td></td><td></td><td>chlorhydrique à 25 %</td></tr><tr>Intensité de<td>la pepsine</td><td></td><td></td><td>: 1:10 000 NF (US National Formulary) correspondant à 1:12 500 BP (British Pharmacopoeia) et à 2 000 FIP (F&eacute ; d&eacute ; ration internationale de pharmacie), ou pepsine liquide stabilisée avec minimum 660 unités de la Pharmacopée européenne/mL</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td>70-90 % alcool éthylique</td></tr><tr><td>Eau du robinet Chauffée</td><td></td><td></td><td>à 46-48 &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Balance</td><td></td><td></td><td>Précis à au moins 0,1 g</td></tr><tr><td>Plateau</td><td></td><td></td> métallique <td>Capacité 10 à 15 L, pour recueillir le jus digestif restant</td></tr><tr><td>Pipettes et porte-pipette</td><td></td><td></td><td>Différentes tailles (1, 10 et 25 mL)</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td></td><td></td><td>Précis à 0,5 &deg ; C, plage de température d’au moins 20 &deg ; C à 70&nbsp ; &deg ; Siphon</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> C <td>Pour l’eau du robinet</td></tr></tbody></table>

méthode agitateur magnétique pour la détection des<em&gt; trichinella</em&gt; larves dans les échantillons de muscle

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

La trichinellose est une maladie débilitante chez l&#39; homme et est causée par la consommation de viande crue ou insuffisamment cuite d&#39;animaux infectés par les larves de nématodes du genre Trichinella. Les sources les plus importantes d&#39;infections humaines dans le monde entier sont la viande de gibier et de porc ou des produits du porc. Dans de nombreux pays, la prévention de la trichinellose humaine est basée sur l&#39;identification des animaux infectés au moyen de la digestion artificielle d&#39;échantillons de muscles à partir de carcasses des animaux sensibles. Il existe plusieurs méthodes fondées sur la digestion de la viande, mais la méthode d&#39;agitation magnétique est considéré comme l&#39;étalon-or. Cette méthode permet la détection des larves de Trichinella par microscopie après la digestion enzymatique des échantillons de muscle et de la filtration et la sédimentation des étapes ultérieures. Bien que cette méthode ne nécessite pas d&#39;équipement spécial et coûteux, les contrôles internes ne peuvent pas être utilisés. Par conséquent, la gestion de la qualité rigoureuse devrait être ApplieD tout au long du test. Le but de ce travail est de fournir des instructions de manipulation détaillées et des points de contrôle critiques de la méthode pour les analystes, sur la base de l&#39;expérience du laboratoire de référence de l&#39; Union européenne pour les parasites et le Laboratoire national de référence de l&#39; Allemagne pour Trichinella.

<html> Après digestion, la forme de la larve musculaire infectieuse peut varier, ce qui rend l&#39;identification plus difficile. Les formes typiques comprennent les larves étroitement enroulé, larves légèrement enroulé ou en forme de c ou larves complètement déroulé (figures 2B - 2C). Le nombre de larves trouvées par gramme peut varier considérablement et peut varier d&#39;une larve à quelques centaines de larves. La morphologie de la larve musculaire infectieuse est représentée sur la figure 2A. Les larves de Trichinella est de 0,7 à 1,5 mm de long et d&#39; environ 0,3 mm de largeur. L&#39;oesophage est étroite et a une extrémité légèrement arrondie. La cuticule est lisse. Dans la moitié antérieure de la cavité du corps, l&#39;stichosome, une structure constituée d&#39;un long tube mince entouré d&#39;une rangée de 45 à 55 grandes cellules (stichocytes), on peut observer. Le rectum est également arrondi sans projections ou appendices 10, 11. t &quot;&gt; D&#39; autres structures, outre les larves de Trichinella, peuvent être trouvés après digestion musculaire Quelques exemples sont présentés dans les figures 3A -.. 3F Les animaux sauvages sont souvent infectés par d&#39; autres parasites ou les échantillons de muscles disponibles pour les tests sont contaminés pendant le processus d&#39;éviscération par animé ou des structures inanimées / organismes. la longueur des larves, l&#39;apparition des extrémités antérieure et postérieure et la survenue de l&#39;aide à stichosome pour discriminer entre les différents genres de nematodes 12. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig1.jpg" /> Figure 1: Examen microscopique de Trichinella Larves Après (A) insuffisant et (B) suffisantes étapes de rinçage. Les barres d&#39;échelle indiquent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande ve</a>rsion de ce chiffre. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig2.jpg" /> Figure 2: Morphologie de Infective Trichinella Larves Afficher le Rectum, stichosome et Oesophage de la Chenille (A). Formes possibles des larves musculaires après digestion montrant (B) étroitement enroulées et légèrement enroulées déplacer les larves et (C) déroulé larves. Les barres d&#39;échelle indiquent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55354/55354fig3.jpg" /> Figure 3: Exemples de découvertes fortuites après Digestion de Muscle Les échantillons avec la méthode Agitateur magnétique. (A) cheveux poils ressemblant à desver de terre trouvé dans le sanglier; (B) Alaria alata de sanglier; (C) de la fibre musculaire de sanglier; (D) Metastrongylus sp. de sanglier; Fibre (E) de la plante trouvée dans le sanglier (F): Toxocara sp. larve de sanglier. Les barres d&#39;échelle indiquent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55354/55354fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La prévention de la trichinellose humaine dans de nombreux pays à travers le monde est basée sur l&#39;examen en laboratoire des échantillons musculaires provenant d&#39;animaux sensibles par des méthodes de digestion, dont la méthode de l&#39;agitateur magnétique est considéré comme l&#39;étalon-or.

Méthode Agitateur magnétique pour la détection des<em&gt; Trichinella</em&gt; Larves dans les échantillons de muscle

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

L'objectif général de cette méthode de diagnostic est d'identifier la viande ou les produits carnés infestés par le parasite zoonotique transmis par les aliments Trichinella. Cette méthode constitue la référence pour la détection directe des larves de Trichinella dans la viande. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facile à réaliser et ne nécessite pas d'équipement spécialisé.En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car des témoins internes ne peuvent pas être utilisés et une gestion stricte de la qualité doit être appliquée tout au long du test. La procédure sera démontrée par Nora Thaben, une technicienne de mon laboratoire. Bonjour ! Pour préparer un échantillon musculaire en vue de sa digestion, placez 100 grammes de l'échantillon dans un mélangeur ou un hachoir.Ajoutez deux millilitres d'eau préchauffée pour faciliter le mélange. Mixez à vitesse maximale pendant deux à trois secondes. Avant le deuxième mixage, ouvrez le mixeur et transférez tout échantillon musculaire situé en haut de la marge du bord du bol vers le fond.Répétez le mélange et poursuivez en effectuant des impulsions de deux à trois secondes jusqu’à ce qu’il ne reste aucune pièce de viande visible. Avant de commencer cette procédure, préparez le liquide de digestion dans un bécher de trois litres, comme décrit dans le protocole écrit. Transférez un litre du liquide de digestion préchauffé dans un flacon.Transférez la viande hachée dans le bécher. Utilisez une cuillère ou une fourchette pour répartir la viande dans le liquide de digestion. Rincez soigneusement le bol du mélangeur, le couvercle, les lames et la fourchette avec le liquide de digestion restant.Placer le bécher sur un agitateur chauffant pour maintenir une température constante de 44 à 46 degrés Celsius, tout en surveillant à l’aide d’un thermomètre. Ensuite, couvrir le bécher avec du papier d’aluminium. Agiter le liquide de digestion pendant 30 minutes afin de créer un vortex profond sans éclaboussures, jusqu’à ce que les particules de viande disparaissent.Après la digestion de l'échantillon musculaire, le liquide de digestion doit être filtré et la quantité de tissu non digéré déterminée. Ajustez la balance à zéro, pesez une passoire propre de 180 micromètres et notez son poids. Vérifiez que l'ampoule à décanter est verticale et bien nivelée.Pour permettre une bonne sédimentation des larves, la largeur du cône de séparation en verre ne doit pas dépasser 55 % de sa longueur. Versez soigneusement le liquide de digestion à travers le tamis, dans le cône de séparation en verre, en évitant tout débordement. Pour éviter une perte de sensibilité, rincez soigneusement le bécher en verre et le tamis avec environ 200 millilitres d’eau du robinet.Et transférez l'eau de rinçage dans l'entonnoir de séparation en verre. Soulevez le tamis et rincez soigneusement la zone située sous le tamis à l'aide d'une bouteille à pression. L'eau de rinçage doit également être recueillie dans un entonnoir de séparation en verre.Laisser le tamis sur l'entonnoir de séparation pour le séchage pendant toute la durée de la procédure de décantation. Pour commencer la procédure de décantation, conserver le liquide de digestion filtré dans un entonnoir de séparation pendant 30 minutes afin que les larves de Trichinella se déposent au fond de l'entonnoir. Une fois la décantation terminée, ouvrir complètement le robinet de l'entonnoir de séparation pour laisser s'écouler rapidement au moins 20 millilitres du liquide de digestion dans un cylindre gradué.Ensuite, ouvrez complètement le robinet en sens inverse pour laisser passer 10 millilitres de liquide de digestion. Enfin, ouvrez le robinet en sens inverse pour laisser passer encore 10 millilitres dans le cylindre gradué. Laissez les 40 millilitres de liquide de digestion dans le cylindre pendant 10 minutes afin de permettre la sédimentation des larves.Passez à la détermination de la quantité de tissus non digérés. Soulevez le tamis du cône de décantation et séchez-le avec une serviette en papier. Soustrayez le poids du tamis avant filtration du poids du tamis contenant les tissus non digérés.Le processus de digestion est considéré comme satisfaisant si pas plus de 5 % du poids initial de l'échantillon ne reste sur le tamis. Si la quantité de tissu non digéré dépasse 5 %, répétez la digestion en utilisant des échantillons musculaires frais. Si des échantillons frais ne sont pas disponibles, digérez à nouveau le matériau restant.Après que le liquide de digestion a séjourné dans le cylindre pendant 10 minutes, prélevez 30 millilitres de surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette, sans perturber le sédiment de 10 millilitres. Pour réduire la quantité de fibres tissulaires dans l’échantillon, ajoutez 30 millilitres d’eau du robinet au sédiment et laissez reposer encore 10 minutes. Répétez ce lavage jusqu’à ce que le liquide devienne clair.Une fois le liquide clair, retirez le surnageant et transférez les 10 millilitres de sédiment lavé dans une boîte de Pétri quadrillée. Rincez le cylindre avec 10 millilitres d’eau du robinet et ajoutez l’eau au sédiment lavé. Immédiatement après les étapes de lavage, examinez les échantillons à l’aide d’un trichinoscope ou d’un microscope stéréo, en utilisant une source de lumière transmise sous-stagiale d’intensité réglable.À l’aide d’un grossissement de 15 à 20x, examiner systématiquement la boîte de Pétri, case par case. Si aucune structure suspecte n’est détectée, déplacer doucement le liquide dans la boîte selon un mouvement circulaire afin de permettre l’accumulation au centre de tout larve de Trichinella potentiellement passée inaperçue. Répéter l’examen.Si une structure suspecte est détectée, augmentez le grossissement de 40 à 100x. Retirez les larves de Trichinella du plat à l’aide d’une pipette et recueillez-les dans un récipient. Une fois l’ensemble du plat examiné, répétez la procédure d’examen microscopique, en commençant par l’agitation douce du plat.Répétez la procédure au moins trois fois ou jusqu’à ce qu’aucune larve ne soit retrouvée. Déterminez le nombre de larves par gramme de tissu musculaire.Si trop de larves sont présentes dans le liquide de digestion pour déterminer de manière fiable le nombre de larves, remettez le liquide contenant les larves dans le cylindre gradué. Rincez le plat avec de l'eau du robinet à l'aide d'une bouteille lavette, puis laissez les larves se déposer au fond. Après un temps de sédimentation de 10 minutes, réduisez le liquide de digestion à un volume défini en transférant les larves depuis le fond du cylindre gradué par incréments d'un millilitre dans un nouveau cylindre.Suspendre homogènement les larves dans les 10 millilitres par agitation vigoureuse. Pendant l'agitation, prélever au pipette 12 gouttes de 20 microlitres de suspension larvaire et les déposer sur une boîte de Pétri. Examiner chaque goutte de 20 microlitres au microscope et calculer le nombre total de larves comme décrit dans le protocole écrit.Avant l'examen microscopique des larves de Trichinella, il est important de laver suffisamment chaque échantillon afin d'éliminer les débris qui pourraient entraver l'identification des larves. Les larves de Trichinella mesurent de 0,7 à 1,5 millimètre de long et environ 0,3 millimètre de large. L'œsophage est étroit, avec une extrémité légèrement arrondie.Le stichosome est une structure située dans la moitié antérieure de la cavité corporelle, composée d'un long tube étroit entouré par une rangée de 45 à 55 cellules volumineuses. Le rectum est également arrondi, sans projections ni appendices. Après la digestion, la forme des larves musculaires infectieuses peut varier, ce qui rend l'identification plus difficile.Les formes typiques comprennent des larves mobiles fortement enroulées ou faiblement enroulées, en forme de C, ou complètement déroulées. D'autres structures que les larves de Trichinella peuvent être observées après la digestion musculaire. Parmi les découvertes fortuites chez le sanglier, on peut citer un poil rigide ressemblant à celui d'une lombric, le trématode Alaria alata, une fibre musculaire, un nématode du genre Metastrongylus, une fibre végétale et des larves du nématode Toxocara.Une fois maîtrisée, la technique peut être réalisée en environ deux heures, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment détecter les larves de Trichinella dans la viande par la méthode du barreau aimanté. En tenant compte des points critiques de contrôle les plus importants.

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