Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

L’objectif global de cette technique microchirurgicale est d’injecter des cellules tumorales colorectales dans la paroi cæcale pour induire des tumeurs colorectales reproductibles et métastatiques chez la souris. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules tumorales circulantes, ses principaux avantages sont les tumeurs hautement reproductibles et uniformes, permettant une prédiction fiable du stade et la prédiction des cellules tumorales circulantes. Commencez par utiliser des pinces atraumatiques pour extérioriser soigneusement le caecum d’une souris immunodéprimée âgée de six à huit semaines.

Placer l’extrémité aveugle du caïcum sur l’abdomen de manière à ce que la poche pointe vers le crâne. Pour l’injection intra-cæcale, montez une seringue standard d’un millilitre équipée d’un canella de calibre 30 et chargez-la avec les cellules tumorales sur une pompe de micro-injection montée sur un micro-manipulateur. Ensuite, utilisez la pince atraumatique pour saisir soigneusement l’extrémité du caecum et utilisez une deuxième pince, humidifiée avec une solution saline chaude pour lisser doucement le caecum avec des mouvements vers le bas.

Déplacez maintenant l’animal sous un microscope chirurgical binoculaire et, avec le canella directement parallèle et au-dessus du caïcum, utilisez deux pinces atraumatiques pour étirer soigneusement le tissu aux deux extrémités de l’extrémité extériorisée du caïcum. Tirez lentement le caecum sur la canella, en prenant soin de ne pas perforer toute la bande de paroi ou la séreuse au-delà du point de pénétration initial et placez la canella au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la fine membrane translucide à l’intérieur de la ceinture de paroi. Lorsque la canella est en place, utilisez une pédale pour injecter 20 microlitres de cellules sur une période de 20 secondes.

Entre la fine muqueuse séreuse translucide, au-dessus des vaisseaux sanguins intramuraux et la musculaire. Lorsque toutes les cellules ont été injectées, retirez soigneusement le canella et placez un substitut sec sous le cæcum. Pour prévenir la dissémination péritonéale artificielle, lysez toutes les cellules qui fuient avec un rinçage abondamment à l’eau distillée et renvoyez doucement le cæcum dans la cavité abdominale.

Fermez la paroi abdominale avec des sutures de course rapidement résorbables, dans la peau avec des clips chirurgicaux. Placez ensuite la souris sur un tapis chauffant réglé à 38 degrés Celsius avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée. Pour isoler les cellules tumorales circulantes, au point final expérimental approprié, remplissez des tubes coniques de 15 millilitres avec cinq millilitres de milieu à gradient de densité par tube et transférez soigneusement des échantillons de sang total prélevés sur des animaux porteurs de tumeurs sur les couches de gradient de densité.

Séparez les cellules par centrifugation, et récupérez soigneusement l’interface contenant les cellules mononucléaires. Pipeter les cellules mononucléées dans un nouveau tube de 15 millilitres pour une deuxième centrifugation. Suivi par des lavages de tubes en PBS.

Après le deuxième lavage, remettre les granulés en suspension dans 200 microlitres de PBS, complété par de l’EDTA et ajouter quatre microlitres d’anticorps anti-amp camp à chaque échantillon, pour une incubation de 20 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Ensuite, utilisez un stylo-barrière hydrophobe pour dessiner un cercle d’environ un centimètre dans une boîte de Pétri stérile de six centimètres par échantillon et ajoutez 700 microlitres de tampon de prélèvement à chaque cercle, suivis de 50 microlitres de suspension cellulaire. Utilisez un microscope pour vérifier la densité des cellules et laissez les échantillons se déposer pendant environ cinq minutes.

Ensuite, examinez la chute des cellules pour détecter la positivité du camp d’amplification et utilisez le micromanipulateur pour transférer les cellules d’intérêt dans 15 microlitres du tampon approprié pour l’analyse ultérieure en aval prévue. L’utilisation de cellules colorectales dans ce modèle permet d’obtenir de manière fiable plus de souris abondantes dans les 35 jours suivant l’injection de cellules tumorales, les tumeurs primaires mesurant environ 10 millimètres, et avec des métastases hépatiques, pulmonaires et circulantes, presque invariablement présentes. De plus, les cellules tumorales circulantes peuvent être facilement isolées pour une analyse en aval.

Une fois maîtrisée et si elle est correctement exécutée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes, facilitant la formation de tumeurs uniformes et métastatiques qui peuvent être utilisées à la fois pour des études thérapeutiques et moléculaires. Les limites du modèle comprennent sa dépendance à la lyse cellulaire, qui ont leurs propres limites, ainsi que l’immunodéficience des souris, qui peuvent toutes deux être surmontées par l’utilisation de cellules cancéreuses colorectales mutantes. En raison de sa simplicité, ce modèle peut constituer un complément précieux aux modèles actuellement disponibles de cancer colorectal.