Name: Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Découvrez une technique microchirurgicale pour injecter des cellules tumorales colorectales dans le cæcum de souris immunodéprimées. Cette méthode permet d'isoler les cellules tumorales circulantes et d'étudier la métastase du cancer colorectal.

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Ce travail a été soutenu par la fondation allemande de recherche (WE 3548 / 4-1) et Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Les expériences sur les animaux présentées ici ont été revues et autorisées indépendamment par un comité institutionnel et gouvernemental de soins et d&#39;utilisation des animaux et ont été menées selon les directives de la Fédération des associations de scientifiques de laboratoire (FELASA). Toutes les mesures possibles ont été prises pour minimiser les souffrances, y compris l&#39;anesthésie et l&#39;analgésie ou, si nécessaire, une euthanasie prématurée. 1. Préparation des cellules et des organoïdes REMARQUE: Utilisez un volume de 20 μL avec 100 000 cellules pour chaque injection. Utilisez la matrice de membrane basique (BMM) afin d&#39;éviter les fuites et d&#39;assurer une injection standardisée. Afin d&#39;assurer des résultats reproductibles, effectuer des analyses d&#39;authentification de ligne cellulaire ( par exemple , via un profilage STR) à intervalles réguliers. <ol><li> Préparation des suspensions de cellules primaires à partir de tissus frais REMARQUE: Toujours travailler dans des conditions stériles. Transfert immédiat de la fraîcheurLes tissus réséqués de la salle d&#39;opération au laboratoire sur glace sont requis pour assurer une viabilité élevée des cellules. Le bien-être et le traitement optimal du patient doivent toujours être la première priorité. Par conséquent, les échantillons de tissus pour la recherche doivent être obtenus d&#39;une manière qui n&#39;interfère pas avec le traitement pathologique et la mise en scène de la tumeur réséquée. Dans la plupart des cas, il est donc raisonnable d&#39;avoir les échantillons pour la recherche obtenus par un pathologiste formé afin d&#39;assurer la non-interférence avec le diagnostic pathologique. <ol><li> Immédiatement après l&#39;élimination stérile de l&#39;échantillon réséqué (idéalement ~ 1 cm 3 ), placez l&#39;échantillon de tissu dans un tube de 50 ml prérempli avec 20 à 30 ml de solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Rangez le tube sur glace et transférez immédiatement au laboratoire. </li><li> Mettez le tissu dans une boîte de Petri et lavez-le deux fois avec de l&#39;ABS pour éliminer le sang restant. </li><li> Couper le tissu en petits morceaux (~ 2-4 mm) avec une scaLpel ( par exemple , avec une lame # 20 ou # 36). </li><li> Utiliser le dissociateur selon les instructions du fabricant afin de dissocier davantage le tissu tumoral à une suspension à une seule cellule. Alternativement, utiliser d&#39;autres protocoles de digestion enzymatique des tumeurs. </li><li> Comptez les cellules de la suspension à une seule cellule résultante ( par exemple , dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre). </li><li> Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS. </li><li> Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace. </li></ol></li><li> Préparation des lignées cellulaires pour injection <ol><li> Cultiver toutes les lignées cellulaires du cancer colorectal dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) et les préparer au jour de la chirurgie. </li><li> Récoltez les cellules selon les protocoles de culture cellulaire standard, comptez les cellules ( p . Ex. , Dans un compteur de coultre ou un hémocytomètre) et calculez la requêteQuantité utilisée pour toutes les injections selon le nombre d&#39;animaux à injecter. </li><li> Préparez 3-5x du volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d&#39;injection. </li><li> Centrifugeuse (5 min à 1500 g) et lave la suspension cellulaire deux fois avec du PBS. </li><li> Ressusciter les cellules dans le BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace. </li></ol></li><li> Préparation organoïde NOTE: Toutes les cultures organoïdes 3D sont cultivées dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ). Des protocoles détaillés pour la culture organoïde ont déjà été publiés. 18 , 19 , 20 Comme pour les lignées cellulaires conventionnelles, nous recommandons un volume de 20 μL de BMM avec 100 000 cellules par injection. Les organoïdes sont préparés au jour de l&#39;opération comme suit: <ol><li> Préparez le support suivant (mentionné ci-aprèsDMEM / F12 +++): Advanced Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamine (200 mM) + 1% de pénicilline / Streptomycine. </li><li> Pré-remplir les tubes de 15 mL avec 1 mL de DMEM / F12 +++. </li><li> Aspirer soigneusement les organoïdes de la surface de la plaque de culture et transférer le contenu de 3 à 5 puits dans un tube de 15 mL. </li><li> Calez soigneusement les organoïdes en petits morceaux en les pipetant vers le haut et vers le bas avec une pipette en verre étendue. </li><li> Ajouter 5 mL de DMEM / F12 +++ au tube, puis centrifuger à 1000 xg pendant 5 min. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant, remettre à nouveau le culot dans 600 μL de tampon de dissociation enzymatique et transférer la suspension dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 1 à 5 minutes, puis faire pipeter soigneusement la suspension vers le haut et vers le bas pour dissoudre les organoïdes. REMARQUE: vérifier la digestion par microscope; Il est complet lorsque tous les clusters cellulaires ont été dissociésD aux cellules simples. </li><li> Après une digestion réussie, ajouter 1,4 mL de DMEM / F12 +++ pour arrêter la digestion. Ensuite, transférer tous les puits d&#39;organoïdes digérés dans un tube de 50 ml. </li><li> Comptez les cellules et calculez la quantité requise pour toutes les injections. </li><li> Préparez 3 à 5 fois le volume réellement nécessaire pour tenir compte des pertes de pipetage et du volume mort de la seringue d&#39;injection </li><li> Centrifugeuse (5 min à 1.500 xg) et lavez la suspension cellulaire deux fois avec du PBS. </li><li> Remis en suspension les cellules dans BMM à une concentration de 5 x 10 6 cellules / mL et les garder sur de la glace. </li></ol></li></ol> 2. Modèle de souris orthotopique <ol><li> Préparation des animaux receveurs pour la chirurgie REMARQUE: Utilisez des souris NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) de 6-8 semaines, en tant que destinataires. 21 NSG sont parmi les souris les plus immunodéprimées, dépourvues de cellules B, T et NK matures, ainsi que de multiples autres immunoglobulinesLes effets. 21 Ils développent de manière fiable des tumeurs même si des nombres de cellules faibles sont injectés et sont très susceptibles d&#39;être exposés à des métastases à distance. Les souris NSG sont d&#39;excellents éleveurs et peuvent être conservées dans des unités spécifiques de pathogènes spécifiques (SPF). <ol><li> Avant la première incision, injecter 0,05 mg / kg de buprénorphine par voie sous-cutanée. </li><li> Utilisez le sévoflurane à 3-3,5 vol% pour l&#39;anesthésie générale. Une perte du réflexe de pincement indique une anesthésie suffisante. </li><li> Couvrir les yeux des souris anesthésiées avec une pommade ophtalmique pour éviter la dessiccation de la cornée. </li><li> Rallongez les souris en position couchée sur une petite table. </li><li> Raser l&#39;abdomen avec un rasoir électrique (la crème dépilatoire peut être utilisée alternativement) et désinfecter avec au moins 3 fois de chlorhexidine / iode et 70% d&#39;alcool en alternance. </li><li> Couvrir le champ chirurgical avec des rideaux stériles. NOTE: L&#39;utilisation d&#39;antibiotiques périopératoires est facultative et est assujettie aux lignes directrices institutionnelles. </li></ol></li><li> Laparotomie à la ligne médiane et l&#39;exposition du cécum <ol><li> Utilisez des ciseaux (les scalpels peuvent être utilisés alternativement) pour faire une petite incision de la ligne médiane (3 à 5 mm) de la peau sur le bas ventre. Ramassez la musculature de la paroi abdominale avec une pince et soigneusement l&#39;inciser avec des ciseaux, ouvrant ainsi la cavité abdominale. </li><li> Identifier et soigneusement extérioriser le cecum avec des pinces atraumatic. Placez la poche terminale aveugle du cecum sur l&#39;abdomen qui pointe de manière crânienne. </li><li> Une fois extériorisé, garder le cécum humide en utilisant des écouvillons salins chauds en tout temps. </li></ol></li><li> Injection orthotopique, fermeture de l&#39;abdomen et récupération postopératoire <ol><li> Pour l&#39;injection intracecale, utiliser une seringue standard de 1 ml avec une canule 30 G. Montez cette seringue sur une pompe à micro-injection, qui est à son tour montée sur un micromanipulateur. </li><li> Saisissez soigneusement la pointe du cecum avec des pinces atraumatiques et lissez-la doucement en la caressant en avalD avec un deuxième ensemble de pinces humidifié avec une solution salée chaude. </li><li> Placez la canule directement au-dessus du cecum. </li><li> Effectuez les étapes suivantes sous contrôle visuel avec un microscope chirurgical binoculaire. </li><li> Saisissez soigneusement le cecum avec deux pinces atraumatiques aux deux extrémités de la partie extériorisée du cecum, étirez-la légèrement puis tirez lentement sur la canule qui est positionnée parallèlement et directement au-dessus. Il est crucial de ne pas perforer la totalité de la paroi intestinale (en injectant ainsi les cellules dans la lumière) et de ne pas perforer la séreuse au-delà du point de pénétration initial car cela entraînerait une fuite et une diffusion péritonéale. <ol><li> Déplacez l&#39;intestin vers la canule, pas la canule vers l&#39;intestin. Tenir et étirer l&#39;intestin entre deux pinces. Les mains du chirurgien doivent reposer sur une surface afin de réduire les tremblements. </li></ol></li><li> Injecter les cellules entre la serose (vue comme une doublure très mince et translucide au-dessus de laE les vaisseaux sanguins intra-moraux) et la musculaire. La canule doit donc être placée visuellement au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la mince membrane translucide. </li><li> Utilisez un interrupteur pour démarrer l&#39;injection afin de réduire le tremblement pendant que la canule est à l&#39;intérieur de la paroi intestinale. </li><li> Une fois que la canule est en position, commencer l&#39;injection. Utilisez une durée de 20 s, ce qui entraîne un réglage de 1 μL / s sur l&#39;unité de commande de la pompe. REMARQUE: L&#39;injection dans un vaisseau sanguin endommagé ou proche d&#39;elle entraîne une dissémination intravasculaire directe et une métastase à distance et devrait donc être évitée. </li><li> Une fois l&#39;injection terminée, retirez soigneusement la canule en la tirant vers l&#39;arrière. </li><li> Placez un écouvillon sec sous le cécum, puis rincez soigneusement le cecum avec de l&#39;eau distillée pour lyser les cellules filtrées et ainsi éviter la dissémination artificielle péritonéale. </li></ol></li><li> Fermeture de l&#39;abdomen et récupération postopératoire <ol><li> Après rEn train de déposer doucement le cecum à la cavité abdominale. </li><li> Fermer la paroi abdominale avec des sutures de course 6-0 rapidement absorbables. </li><li> Fermez la peau avec des clips chirurgicaux. </li><li> Placez la souris sur un plan de chauffage réglé à 38 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement récupéré de l&#39;anesthésie. </li><li> Observez de près l&#39;état postopératoire des souris pendant les 48 h suivantes. En cas de détresse, traiter avec 0,05 mg / kg buprénorphine toutes les 12 h. </li><li> Surveiller les souris au moins une fois par jour pour détecter les signes de détresse due à la croissance tumorale. </li></ol></li></ol> 3. Isolation des cellules tumorales circulantes à partir d&#39;échantillons de sang total NOTE: Obtenez du sang par ponction cardiaque transcutanée chez des souris anesthésiées, suivi d&#39;une euthanasie. Idéalement, 1000 μL de sang sont aspirés dans une seringue préremplie de 100 μl d&#39;anticoagulant (acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) ou héparine). Utiliser un anti-humain-EpCAM (adhésion de cellules épithélialesMolécule) pour identifier les CTC. Cela fonctionne très bien si les lignées cellulaires épithéliales humaines sont utilisées dans le modèle de la souris. Pour d&#39;autres appareils, des anticorps différents peuvent être nécessaires. <ol><li> L&#39;enrichissement en CTC: <ol><li> Pré-remplir des tubes de 15 mL avec un milieu gradient de densité de 5 mL et transférer soigneusement le sang dans le tube de 15 mL. </li><li> Centrifugeuse (30 min à 300 xg sans frein) et retirez soigneusement le surnageant supérieur. </li><li> Versez le reste dans un nouveau tube de 15 ml et centrifugez (15 min, 300 xg avec frein). </li><li> Récupérer l&#39;interphase contenant les cellules mononucléaires (jeter le reste) et laver les cellules deux fois avec du PBS. </li><li> Remettre en suspension la pastille dans 200 μl de PBS / 1% d&#39;EDTA et ajouter 4 μL d&#39;anticorps EpCAM. Incuber 20 min sur de la glace dans le noir. </li></ol></li><li> Projection et sélection <ol><li> Préparez le tampon suivant (appelé ci-après tampon de prélèvement): PBS + 10% de sérum de veau foetal (FCS) + 1% de pénicilline / STreptomycine (1%) + 0,8% d&#39;EDTA. </li><li> Utilisez un stylo PAP pour dessiner un cercle de ~ 1 cm dans une boîte de Petri stérile de 6 cm (empêche le fluide de se disperser dans le plat) et faites pipeter 700 μL de tampon de prélèvement dans ce cercle. </li><li> Ajouter 50 μL de suspension cellulaire au tampon de prélèvement de 700 μL dans le cercle. Vérifiez la densité des cellules au microscope. Divisez l&#39;échantillon dans différentes plats s&#39;il est trop dense. </li><li> Attendez que les cellules s&#39;installent (~ 5 min). </li><li> Écran de la goutte de suspension cellulaire pour les cellules colorées (= EpCAM-positives). </li><li> Une fois qu&#39;une cellule est trouvée, choisissez la cellule avec le micromanipulateur et placez-le dans un tampon de 50 μl en fonction de l&#39;analyse en aval prévue ( p . Ex. , Tampon d&#39;extraction d&#39;ARN ou milieu de culture). </li><li> Selon les analyses en aval prévues, isoler les cellules négatives et / ou les médiums par EpCAM comme témoins négatifs. </li><li> Procédez avec des analyses en aval ( p . Ex. , Culture cellulaire, PCR). </li></ol></li></ol>

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<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Malgré leur activité précliniquement prouvée dans les modèles de souris sous-cutanés, la grande majorité des nouveaux composés échouent dans les essais cliniques et n&#39;atteignent jamais la clinique. 11 Cette insuffisance évidente de modèles de souris sous-cutanés pour simuler de manière précise la biologie et les modèles de croissance des tumeurs a conduit au développement de modèles de souris orthotopiques basés sur l&#39;injection de cellules tumorales directement dans l&#39;organe original....

Le cancer colorectal (CRC) est l&#39;une des causes les plus fréquentes de décès par cancer dans les pays occidentaux. 1 Alors que la tumeur primaire peut souvent être réséquée, l&#39;apparition de métastases à distance aggrave considérablement le pronostic et conduit souvent à la mort. 2 , 3 La corrélation biologique de la métastase est la circulation des cellules tumorales (CTC), qui se détachent de la tumeur, survivent en circulation, attachent à l&#39;épithélium dans l&#39;organe cible, envahissent l&#39;organe et finissent par dépasser de nouvelles lésions. 4 Bien que les CTC connaissent une pertinence pronostique, 5 , 6 , 7 , 8 , 9, leur biologie n&#39;est que partiellement comprise en raison de leur extrême rareté dans le CRC. dix Les modèles de souris sont un puissant tOol pour étudier divers aspects de la biologie du cancer. Les modèles classiques de tumeur sous-cutanée sont produits par injection sous-cutanée de cellules tumorales dans des souris destinataires, qui peuvent être immunocompétentes (si des cellules tumorales murines syngéniques sont utilisées) ou immunodéficientes. Les modèles de tumeur sous-cutanée sont peu coûteux et produisent rapidement des données; Leur croissance tumorale de point final peut être mesurée de manière simple et non invasive. Cependant, 88% des nouveaux composés qui ont démontré une activité antitumorale dans de tels modèles échouent dans les essais cliniques. 11 Cela s&#39;explique en partie par les différences interspécifiques entre les humains et les souris; Cependant, une grande partie de cette défaillance est due à la faible valeur prédictive des modèles de souris sous-cutanés. Les modèles de souris orthotopiques, dans lesquels les cellules tumorales sont injectées dans l&#39;organe d&#39;origine et donc poussent dans leur microenvironnement original, sont de plus en plus utilisés dans la recherche sur le cancer. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Les modèles orthotopiques ne simulent pas seulement les conditions locales de croissance tumorale; En raison du site anatomiquement correct de la croissance de la tumeur, les modèles de souris orthotopiques permettent également une simulation réaliste des métastases et sont donc utilisés pour étudier la biologie CTC 8 , 15 , 16 ou leur réponse à différents traitements dans le CRC. 13 , 17 Un inconvénient majeur des modèles de souris orthotopiques est leur complexité technique. Selon l&#39;organe dans lequel les cellules doivent être injectées, la courbe d&#39;apprentissage jusqu&#39;à ce que l&#39;expérimentateur puisse induire des tumeurs reproductibles soit assez longue. Cela s&#39;applique particulièrement aux modèles de cancer colorectal, car les cellules tumorales doivent être injectées dans la paroi intestinale, ce qui entraîne souvent une perforation, une fuite de cellules tumorales ou une perte de cellules tumorales endoluminales. C&#39;est unL&#39;article a pour but de décrire le procédé de préparation cellulaire à partir d&#39;échantillons de tissus primaires, de lignées cellulaires 2D et de culture organo-3D et leur injection dans le cécum des souris. La technique décrite ici conduit à des tumeurs hautement uniformes et, en fonction de la biologie tumorale de la lignée cellulaire utilisée pour l&#39;injection, de la formation reproductible de métastases à distance et de CTC chez la souris destinataire. 15

<table><tbody><tr><td>Milieux de culture cellulaire et composants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ moyen</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Glutamax-I Supplement (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ medium</td></tr><tr><td>Pénicilline/ Streptomycine (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ moyen</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>milieu de base de lignées cellulaires 2D (DMEM/10 % FCS</td></tr><tr><td>)Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>milieu de base de lignées cellulaires 2D (DMEM/10 % FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Tampon de dissociation enzymatique express</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrice à membrane basale Matrigel (BMM, sans rouge de phénol)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %, Phenol-Red)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6/48 puits avec couvercle</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire 75 cm&sup2 ;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>fiole de culture cellulaire 150 cm&sup2 ;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>tubes Eppendorf 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 15 mL, 50 mL</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Lames de comptage (pour machine de comptage TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur (verre, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>finement tirées à l’aide d’un bec Bunsen</td></tr><tr><td>gentleDissociateur MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>pour la préparation des tissus tumoraux primaires</td></tr><tr><td>MACSmix Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>pour la préparation des tissus tumoraux primaires</td></tr><tr><td>douxMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>pour la préparation des tissus tumoraux primaires</td></tr><tr><td>Kit de dissociation des tumeurs humaines</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>pour la préparation</td></tr> <tr><td>des tissus tumoraux primairesFaucon 70 et micro ; m Cell Strainer</td><td>Corning B.V. Life Sciences</td><td>352350</td><td>pour la préparation de tissus tumoraux</td></tr> <tr><td>primairesName</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Surgical Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Oxygène</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>médical</td><td>Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprénorphine <td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- pommade ophtalmique</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Saline normale 0,9 % (E154)</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL (sans volume mort) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>aiguille d’injection 30G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>écouvillons en cellulose</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Pince Micro-Adson</td><td>FST - Outils de science fine</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris - ToughCut</td><td>FST - Outils de science fine</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Porte-aiguille</td><td>FST - Outils de science fine</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Kit AutoClip</td><td>FST - Outils de science fine</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgical suture)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’anesthésie de recherche de table sans chasse d’eau O2 et vaporisateur de sévoflurane</td><td>Pompe UltraMicro Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>avec contrôleur Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>Équipement UMP3-4</td><td>pour injection orthotopique hautement contrôlée</td></tr><tr><td>Pédale pour contrôleur SYS-Micro4</td><td>World Precision Instruments</td><td>15867</td><td>Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée</td></tr><tr><td>Micromanipulateur manuel à trois axes</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée</td></tr><tr><td>Support magnétique pour micromanipulateur</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td>Équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée</td></tr><tr><td>Plaque de base en acier pour M10 Support magnétique</td><td>World Precision Instruments</td><td>5479</td><td>équipement pour l’injection orthotopique hautement contrôlée</td></tr><tr><td>Hot Plate 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Rasoir à cheveux</td><td>AESCULAP -</td><td></td> Microscope chirurgical binoculaire Braun <td></td></tr><tr><td></td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CTC isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Gradient de densité medium &ndash ; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-souris CD326 (EpCAM) Clone d’anticorps G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, &oslash ; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2 ;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de culture cellulaire à fluorescence</td>Micromanipulateur <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td> Pompe d’aspiration <td>Eppendorf</td><td></td><td>connectée au micromanipulateur</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>nécessaire pour la fabrication de microcapillaires pour l’aspiration unicellulaire</td></tr><tr><td>Prism Glass Capillaries</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylo PAP</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>tampon de cueillette</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>Tampon de cueillette</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>tampon de cueillette</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>tampon de prélèvement</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-human CD326 (EpCAM) clone d’anticorps 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM immunohistochemistry (cf, fig. 2C)</td></tr><tr><td>HRP lapin anti-souris IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immunohistochimie (cf, fig 2C)</td></tr></tbody></table>

isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Malgré les avantages d&#39;une applicabilité et d&#39;une rentabilité faciles, les modèles de souris sous-cutanés ont de graves limites et ne simulent pas exactement la biologie tumorale et la dissémination de cellules tumorales. Des modèles de souris orthotopiques ont été introduits pour surmonter ces limites; Cependant, ces modèles sont techniquement exigeants, en particulier dans les organes creux tels que le gros intestin. Afin de produire des tumeurs uniformes qui se développent de manière fiable et de métastases, des techniques normalisées de préparation et d&#39;injection de cellules tumorales sont essentielles. Nous avons développé un modèle orthotopique de cancer colorectal (CRC) qui développe des tumeurs hautement uniformes et peut être utilisé pour des études de biologie tumorale ainsi que des essais thérapeutiques. Les cellules tumorales provenant des tumeurs primaires, des lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ou des organoïdes tridimensionnels (3D) sont injectées dans le cécum et, selon le potentiel métastatique des cellules tumorales injectées, forment des tumeurs hautement métastatiques. En outre,Les CTC peuvent être consultés régulièrement. Nous décrivons ici la technique de la préparation des cellules tumorales à partir des lignées cellulaires 2D et des organoïdes 3D, ainsi que du tissu tumoral primaire, des techniques chirurgicales et d&#39;injection ainsi que de l&#39;isolement des CTC des souris portant une tumeur et des conseils pour le dépannage.

La génération réussie et reproductible de tumeurs colorectales dans ce modèle dépend de manière critique d&#39;une injection précise des cellules sans déversement ou fuite. Si cela est atteint, ce modèle est extrêmement fiable et entraîne très rarement une diffusion péritonéale artificielle. La cinétique de croissance des tumeurs ainsi que leurs profils de diffusion dépendent de la biologie des organoïdes et des cellules utilisés. 15 Alors que les cellules HCT116 ...

Nous décrivons l&#39;établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l&#39;isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Le but général de cette technique microchirurgicale est d'injecter des cellules tumorales colorectales dans la paroi cæcale afin d'induire des tumeurs colorectales reproductibles et métastatiques chez la souris. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules tumorales circulantes ; ses principaux avantages sont la grande reproductibilité et l'uniformité des tumeurs, permettant une prédiction fiable du stade tumoral et des cellules tumorales circulantes. Commencez par utiliser une pince atraumatique pour extérioriser soigneusement le cæcum d'une souris immunodéprimée âgée de six à huit semaines.Placer l'extrémité fermée du caecum sur l'abdomen de manière à ce que la poche soit orientée vers la partie crânienne. Pour l'injection intracaecale, monter une seringue standard d'un millilitre équipée d'une canule de 30 gauge et chargée des cellules tumorales sur une pompe de micro-injection fixée à un micromanipulateur. Ensuite, utiliser une pince atraumatique pour saisir délicatement l'extrémité du caecum et une seconde pince, humidifiée avec du sérum physiologique tiède, pour lisser doucement le caecum par des mouvements descendant.Déplacez maintenant l'animal sous un microscope chirurgical binoculaire et, avec la canella parfaitement parallèle et positionnée au-dessus du caecum, utilisez deux pinces atraumatiques pour étirer délicatement les tissus aux deux extrémités de l'extrémité du caecum exposée. Tirez lentement le caecum par-dessus la canella, en prenant soin de ne pas perforer la bande pariétale ni la séreuse au-delà du point initial de pénétration, et placez la canella au-dessus des vaisseaux sanguins et sous la fine membrane translucide située à l'intérieur de la bande pariétale. Une fois la canella en place, utilisez une pédale pour injecter 20 microlitres de cellules sur une durée de 20 secondes.Entre la séreuse translucide mince, au-dessus des vaisseaux sanguins intramuraux et la musculeuse. Une fois que toutes les cellules ont été injectées, retirer soigneusement la canule et placer un écouvillon sec sous le caecum. Pour éviter une dissémination péritonéale artificielle, lyser toutes les cellules échappées par un rinçage abondant à l'eau distillée et replacer délicatement le caecum dans la cavité abdominale.Fermer la paroi abdominale à l’aide de points de suture résorbables rapides en surjet, puis fermer la peau à l’aide de pinces chirurgicales pour plaies. Ensuite, placer la souris sur un tapis chauffant réglé à 38 degrés celsius, avec surveillance jusqu’à récupération complète de la position couchée. Pour isoler les cellules tumorales circulantes, au point final expérimental approprié, remplir des tubes coniques de 15 millilitres avec cinq millilitres de milieu de gradient de densité par tube, puis transférer soigneusement les échantillons de sang total prélevés chez les animaux porteurs de tumeur sur les couches de gradient de densité.Séparer les cellules par centrifugation et récupérer soigneusement l'interface contenant les cellules mononucléées. Transférer les cellules mononucléées à l'aide d'une pipette dans un nouveau tube de 15 millilitres pour une deuxième centrifugation. Procéder ensuite aux lavages du tube dans du PBS.Après le deuxième lavage, reprendre les culots dans 200 microlitres de PBS supplémenté en EDTA et ajouter quatre microlitres d'anticorps anti-amp camp à chaque échantillon, puis incuber 20 minutes sur glace à l'abri de la lumière. Ensuite, utiliser un stylo traceur hydrophobe pour dessiner un cercle d'environ un centimètre de diamètre dans une boîte de Pétri stérile de six centimètres de diamètre par échantillon, ajouter 700 microlitres de tampon de prélèvement dans chaque cercle, puis 50 microlitres de suspension cellulaire. Utiliser un microscope pour vérifier la densité des cellules et laisser les échantillons se déposer pendant environ cinq minutes.Ensuite, analyser la goutte de cellules pour la positivité à l'amp camp et utiliser le micromanipulateur pour transférer les cellules d'intérêt dans 15 microlitres du tampon approprié destiné à l'analyse en aval prévue. L'utilisation de cellules colorectales dans ce modèle donne de manière fiable des souris plus nombreuses en moins de 35 jours suivant l'injection des cellules tumorales, les tumeurs primaires mesurant environ 10 millimètres de taille, et les métastases hépatiques et pulmonaires ainsi que les cellules tumorales circulantes étant presque invariablement présentes. De plus, les cellules tumorales circulantes peuvent être facilement isolées pour une analyse en aval.Une fois maîtrisée et si elle est correctement réalisée, cette technique peut être effectuée en moins de 10 minutes, facilitant la formation de tumeurs uniformes et métastatiques pouvant être utilisées à la fois pour des études thérapeutiques et moléculaires. Les limites du modèle incluent sa dépendance aux lysats cellulaires, qui présentent leurs propres limitations, ainsi que l'immunodéficience des souris ; ces deux contraintes peuvent être surmontées par l'utilisation de cellules cancéreuses colorectales mutantes. En raison de sa simplicité, ce modèle pourrait constituer un complément précieux aux modèles de cancer colorectal actuellement disponibles.

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Deux techniques peuvent être utilisées pour établir ce modèle: l'injection d'une suspension de cellules cancéreuses dans le mur caecal ou la transplantation d'un morceau de tumeur sous-cutanée sur le caecum. Ce modèle est utile pour étudier l'évolution naturelle du cancer colorectal et le test de nouveaux agents thérapeutiques contre le cancer colorectal.

Modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Cette vidéo décrit le protocole permettant d’établir un modèle murin de métastases spontanées de xénogreffes dérivées de patients atteints de cancer colorectal ou PDX. Ces modèles de xénogreffes imitent partiellement les caractéristiques des carcinomes humains et comprennent les aspects critiques des tumeurs malignes humaines, y compris l’invasion et les métastases.

Modèles murins de métastases spontanées : une plateforme pour étudier le potentiel métastatique des cellules cancéreuses colorectales injectées orthotopiquement

Cette vidéo décrit le protocole de génération de métastases par les organoïdes CRC dérivés de PDX marqués avec le lentivirus GFP dans la rate d’une souris immunodéficiente. Les micrométastases cancéreuses colonisant d’autres organes peuvent être détectées à l’aide d’un microscope à fluorescence pour évaluer l’expression de la GFP.

Établissement d’un modèle murin expérimental de métastases : implantation de cellules organoïdes CRC exprimant la GFP dans un modèle PDX pour détecter les micrométastases

La vidéo décrit la technique d’injection intra-génétique de cellules cancéreuses pour développer un modèle murin orthotopique avec des tumeurs très uniformes. Par conséquent, le modèle de souris orthotopique permet une simulation réaliste des métastases, fournissant un outil précieux pour étudier les changements de phénotype pendant la croissance et la dissémination de la tumeur.

Injection de cellules tumorales intracécales : une technique d’administration de cellules cancéreuses pour l’établissement d’un modèle murin de cancer colorectal orthotopique

Cette vidéo décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules tumorales circulantes à partir de l’échantillon de sang entier d’un modèle murin de tumeur colorectale euthanasiée. Ces CTC isolés peuvent être cultivés et utilisés pour l’analyse en aval prévue.

Isolement des CTC à partir d’un échantillon de sang total : une méthode pour obtenir des CTC à partir d’un modèle murin de cancer colorectal

Il a été démontré que la classe Les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle important dans les métastases tumorales. Ici, une méthode d’isolement et de propagation de CTC à partir du sang total d’un modèle de tumeur de souris syngénique de métastases de carcinome hépatocellulaire (CHC) est décrite.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Un modèle animal est nécessaire pour décrypter le rôle des cellules tumorales (CTC) dans la promotion de la colonisation lors de métastases du cancer pulmonaire en circulation. Ici, nous avons mis en place et a effectué avec succès une in vivo test d’essai spécifiquement l’exigence de la fibronectine polymériques (polyFN) Assemblée sur CTC pour la colonisation de poumon.

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

La culture des CTC permet une caractérisation fonctionnelle plus profonde du cancer, en testant l’expression de marqueurs spécifiques et en évaluant la résistance aux médicaments et la capacité de coloniser le foie, entre autres possibilités. Dans l’ensemble, la culture du CCT pourrait être un outil clinique prometteur pour la médecine personnalisée afin d’améliorer les résultats pour les patients.

Les lignées cellulaires tumorales circulantes : un outil innovant pour la recherche fondamentale et translationnelle

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

Ce protocole décrit l’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients dans la paroi du caecum de souris immunodéficientes. Le modèle récapitule la maladie métastatique du cancer colorectal avancé et permet l’évaluation de nouveaux médicaments thérapeutiques dans un scénario cliniquement pertinent de métastases pulmonaires et hépatiques.

L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Découvrez une technique microchirurgicale pour injecter des cellules tumorales colorectales dans le cæcum de souris immunodéprimées. Cette méthode permet d'isoler les cellules tumorales circulantes et d'étudier la métastase du cancer colorectal.

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

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