Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

Préparation et découpe avec un vibratome. Trois blocs d'agar sont nécessaires pour stabiliser le cerveau pendant la procédure de découpe. Pour éviter toute contamination, utilisez un ensemble d'instruments stérilisés au autoclave.

Retirez l'agar. Il doit être séché sur du papier filtre avant d'être collé sur la plaque métallique à l'aide d'une colle médicale à base de cyanoacrylate. À l’aide d'une spatule, retirez le cerveau et placez-le soigneusement dans la boîte de Pétri remplie de milieu de préparation.

Ensuite, séchez brièvement le cerveau sur du papier filtre. Recouvrez la plaque métallique de colle médicale à base de cyanoacrylate. Utilisez la pince et la spatule pour positionner le cerveau sur le porte-échantillon.

Utilisez les deux morceaux d'agar préparés précédemment pour assurer une stabilité mécanique des deux côtés. À ce stade, le cerveau doit être placé à côté du bloc d'agar et stabilisé à l'aide de deux autres blocs afin d'éviter tout dommage pendant la découpe. Placez la plaque métallique dans le vibratome et recouvrez le tissu avec du milieu de préparation froid.

Ensuite, disséquer le tissu horizontalement en tranches OHSC de 350 micromètres d'épaisseur à l'aide d'un vibratome coulissant. Transférer les tranches dans la boîte de Pétri, en utilisant l'extrémité cassée d'une pipette Pasteur pour recueillir les tranches. Maintenir les tranches de cerveau dans du milieu de préparation froid.

Évaluer les tranches optiquement à l’aide d’un microscope binoculaire. Séparer la région hippocampique et pénétrer dans le cortex interne à l’aide d’un scalpel muni d’une lame ronde de taille 15. Il est important de ne prélever que les tranches présentant une cytoarchitecture intacte, isolées de la partie médiane de l’hippocampe située entre l’hippocampe dorsal et l’hippocampe ventral.

Les OHSC de faible qualité doivent être jetés immédiatement. Transférez deux à trois tranches obtenues dans un insert de culture cellulaire doté d'une taille de pore de 0,4 micromètre. Aspirez un milieu de préparation depuis le haut de l'insert de culture cellulaire à l'aide d'une pipette Pasteur.

Placer l'insert dans une plaque de culture à six puits contenant un millimètre de milieu de culture par puits. Incuber les plaques à six puits à 35 degrés Celsius dans une atmosphère entièrement humidifiée avec 5%CO2 et changer le milieu de culture cellulaire tous les deux jours. Après six jours de culture pour le tissu de rat, ou 14 jours pour le tissu murin, les réactions inflammatoires associées à la procédure de découpe ont disparu.

Des expériences peuvent désormais être réalisées. Résultats représentatifs pour les études de neuroprotection. L’image A montre des OHSC non lésés conservés en milieu de culture pendant neuf jours in vitro sans aucun traitement, servant de tranches témoins.

Comme confirmé par la microscopie à balayage laser confocale, les OHSC témoins présentaient une bonne préservation neuronale. Les cellules microgliales positives pour l'isolectine B4 étaient principalement localisées dans les couches moléculaire et plexiforme et présentaient un phénotype ramifié. Dans la couche granulaire du gyrus denté, seules très peu de cellules microgliales positives pour l'isolectine B4 et pratiquement aucun noyau positif pour l'iodure de propidium n'ont été observés.

Un autre ensemble d’OHSC, illustré dans la partie B de l’image, a été maintenu dans le milieu de culture pendant six jours, puis lésé par du NMDA à 50 micromolaire pendant quatre heures, avant d’être conservé dans le milieu de culture pendant trois jours supplémentaires. Après la lésion induite par le NMDA, une accumulation massive de microglies activées, positives pour l’isolectine B4, s’est fixée au site de la lésion neuronale, à travers toutes les couches du gyrus denté.

L'analyse quantitative a révélé que, dans la couche granulaire du gyrus denté, le nombre de microglies positives pour l'isolectine B4 était plus élevé dans les COHS lésés par rapport aux conditions témoins. De manière similaire, le nombre de neurones en dégénérescence positifs pour l'iodure de propidium était fortement augmenté dans la couche granulaire des tranches lésées par le NMDA. Résultats types pour les études d'invasion tumorale.

Toutes les images montrent les résultats de l'invasion tumorale SS obtenus à l'aide de OHSC, visualisés au microscope confocal à balayage laser. La couleur rouge marque l'architecture cytoarchitecturale du OHSC et les cellules tumorales apparaissent en vert. L'image A illustre un motif d'invasion typique des cellules de glioblastome U138 ayant eu quatre jours pour envahir.

Des tumeurs claires, sphériques et bien délimitées peuvent être observées, et la structure du CHOS semble intacte, avec un gyrus denté et une substance de Cornu Ammonis clairement visibles. L'image B montre un motif d'invasion différent, généré par des cellules de glioblastome LN229 après quatre jours. Dans ce cas, les tumeurs individuelles ne peuvent pas être clairement distinguées en raison du réseau formé qui recouvre la majeure partie du CHOS, bien que l'architecture cytoarchitecturale reste intacte, avec un gyrus denté et une substance de Cornu Ammonis non déformés.

On peut en outre conclure que les cellules LN229 sont plus invasives que les cellules U138. Les images C et D montrent le même résultat d'envahissement tumoral pour les cellules LN229 après quatre jours d'envahissement. Sur le côté gauche, on observe que la masse tumorale couvre presque tout le champ de vision.

L'image D montre la coloration correspondante au propidium iodure. Sur cette coupe, l'architecture cytoarchitecturale n'est plus intacte, le cornu ammonis n'étant plus visible, et le gyrus dentelé est également déformé. Une cause possible de ce résultat pourrait être un OHSC qui n'était pas entièrement intact au début de l'expérience, un nombre trop élevé de cellules tumorales appliquées ou une durée d'envahissement trop longue ayant entraîné la perte structurelle observée.

Ainsi, ce type de résultat d'invasion doit être écarté. Les cultures organotypiques de tranches hippocampiques constituent un excellent modèle in vitro reflétant la physiologie du cerveau avec des connexions neuronales intactes. Étant donné qu'un seul modèle permet d'obtenir plusieurs cultures de tranches, il est possible de tester plusieurs conditions sur des tissus provenant d'un même animal, et les résultats sont hautement reproductibles.

En raison du haut degré d'accessibilité, les cultures de tranches hippocampiques organotypiques sont particulièrement adaptées à une grande variété de types d'expériences. Cela inclut des études électrophysiologiques et de neurogenèse, mais aussi des expériences sur la neuroprotection, l'invasion tumorale et les interactions entre cellules tumorales et tissu cérébral sain.