Recombinante α-β - et γ-Synucleins stimuler l’activité de protéine Phosphatase 2 a sous-unité catalytique en essais libres de cellules

Les synucléines recombinantes alpha, beta et gamma stimulent l'activité de la sous-unité catalytique de la protéine phosphatase 2A dans des tests sans cellules. Bonjour, je m'appelle Sovanarak Lek. Je suis étudiant en médecine au Texas Tech University Health Sciences Center, El Paso, Paul L. Foster School of Medicine.

Dans cette vidéo, je vais démontrer un dosage colorimétrique bidirectionnel de la protéine phosphatase en utilisant des protéines synucléines recombinantes. Préparation des tampons et des réactifs. Préparation du tampon p-Nitrophénol phosphate.

Pour préparer 50 ml de tampon pNPP, dissoudre la base Trizma dans 25 ml d'eau désionisée ultrapure dans un bécher. Ajouter une barre d'agitation propre et placer sur un agitateur magnétique. Une fois la Trizma dissoute, ajouter le chlorure de calcium en continuant à agiter.

Régler le pH à 7,0. Transférer la solution dans un cylindre gradué. Amener le volume total final à 50 mils avec de l’eau déionisée ultrapure.

Préparation de la solution de vert malachite. La solution de vert malachite nécessite trois solutions, parties A, B et C. La solution A est de l'acide chlorhydrique quatre molaire. La solution B est une combinaison de molybdate d'ammonium et de la solution A. La solution C est du sel d'oxalate de vert malachite à 0,045 %.

Pour préparer la solution D, mélanger une partie de B avec trois parties de C, dans un rapport un pour trois. Agiter pendant une heure à température ambiante. Enfin, filtrer la solution D à travers une membrane de 22 micromètres et conserver à quatre degrés Celsius.

Protéger de la lumière. Préparation de l'activateur. L'activateur est une solution de Tween 20 à un pour cent.

Prélvez 10 microlitres de Tween 20 dans 990 microlitres d'eau déionisée ultrapure. Agitez au vortex jusqu'à dissolution complète du Tween 20. Préparation de la solution de travail au vert malachite contenant du Tween 20.

Ajouter l'activateur à la solution D dans un rapport de un à cent. Préparation du phosphopeptide de thréonine. Pour préparer une solution mère de pT à deux mM, ajouter 550 microlitres d'eau déionisée ultrapure à un milligramme de pT.

Vortexer jusqu'à ce que le phosphopeptide soit complètement dissous. Placer sur de la glace et utiliser immédiatement. Conserver les aliquotes supplémentaires de pT à moins 20 degrés Celsius.

Préparation de la synucléine. Resuspendre un milligramme de synucléine dans un millilitre d'eau ultrapure désionisée à une concentration finale de un milligramme par millilitre. Agiter doucement au vortex pour solubiliser.

Utiliser immédiatement et conserver les aliquotes inutilisées à moins 80 degrés Celsius. Préparation des étalons de phosphate. Étape 1 de la préparation des étalons de phosphate.

Pour préparer une solution mère de phosphate à 1 mM, dissoudre du phosphate de potassium dans de l'eau déionisée ultrapure dans un bécher contenant un barreau aimanté. Transférer dans une éprouvette graduée et ajuster le volume final à 100 mils. Il s'agit d'une solution à 10 mM.

Filtrer toute la solution à l’aide d’un filtre de 22 microns en utilisant une seringue de grande taille. Diluer ce filtrat 1 à 100 pour obtenir une solution de phosphate à 1 mM destinée à être utilisée comme étalon pour le dosage. Étape deux des étalons de phosphate.

Ajouter la quantité appropriée de phosphate ainsi que de l'eau désionisée ultrapure dans des tubes de 1,5 ml, comme indiqué dans le tableau. Cela permettra d'obtenir des tubes contenant 150, 300, 600, 1 200 et 2 400 pmol de phosphate. Conserver les aliquots à −20 degrés Celsius.

Test d'activité de la PP2A. Préparez le test de la PP2A dans des tubes de 1,5 ml sur glace. Ajoutez 43 microlitres de tampon pNPP.

Ajouter un microlitre de PP2Ac recombinante humaine. Ajouter la synucléine et incuber la PP2A avec la synucléine pendant 30 minutes sur un Nutator à quatre degrés Celsius. Ensuite, ajouter 16 microlitres de pT à 2 mM.

Incuber 10 minutes à 30 degrés Celsius dans un bain-marie. Sur une plaque 96 puits à fond plat, ajouter 25 microlitres de chaque étalon de phosphate en double, du plus faible au plus élevé. Prélever 24 microlitres de chaque test PP2A en double et les transférer sur la même plaque 96 puits contenant les étalons.

Transférez 75 microlitres de la solution D contenant du Tween 20 dans chaque échantillon et chaque standard. Après l'ajout de MGT, vous observerez un changement de couleur dans les puits lorsque des phosphates libres sont présents. Analyse photométrique.

Analyser sur un spectrophotomètre réglé à 630 nanomètres. Résultats représentatifs. Ici, nous présentons un dosage représentatif de la PP2A et le graphique illustrant la courbe standard.

À gauche se trouvent les étalons de phosphate. Plus les puits contiennent de phosphate, plus la teinte de vert est foncée. À droite, nous avons la PP2A qui a été incubée avec des synucléines alpha, bêta ou gamma à différentes concentrations molaires.

Des concentrations plus élevées se sont révélées plus efficaces pour stimuler l'activité de la sous-unité catalytique de la PP2A. Nous observons ici la représentation graphique de l'activité de la PP2A en réponse à des concentrations variables de l'alpha-synucléine, de la bêta-synucléine et de la gamma-synucléine. L'alpha-synucléine, la bêta-synucléine et la gamma-synucléine ont toutes significativement stimulé l'activité de la PP2A à une concentration de un à deux micromoles.

Seules l'alpha-synucléine et la bêta-synucléine se sont révélées des stimulateurs significatifs de l'activité de la PP2A à une concentration de 0,5 micromolaire. La figure trois illustre l'interaction de la PP2Ac avec les synucléines endogènes dans le cerveau de souris. En A, les alpha-, bêta- et gamma-synucléines recombinantes sont présentées comme témoins positifs.

Dans B, une co-immunoprécipitation a été réalisée à l'aide de l'anticorps spécifique de PP2Ac, 1D6, qui a permis de précipiter PP2Ac ainsi qu'une quantité considérable de synucléine alpha interagissant, mais pratiquement aucune synucléine beta. Aucune synucléine gamma n'a été co-précipitée avec PP2Ac lors de la co-immunoprécipitation. Ces données suggèrent que la synucléine alpha est le modulateur endogène de PP2Ac in vivo.

Nous tenons à remercier toutes les personnes qui nous ont aidés à réaliser cette vidéo. En conclusion, voici Ruth Perez. Sonavarak Lek.

Javier Vargas. Nous vous souhaitons beaucoup de succès. Au revoir et bonne chance.