Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

L'objectif général de l'isolement magnétique des microglies par CD11b est d'obtenir un rendement final de microglies postnatales de haute pureté en un temps relativement court, afin de permettre des expérimentations in vitro polyvalentes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les mécanismes de signalisation liés à l'inflammation neuronale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuellement disponibles réside dans le fait que l'isolement prend environ 30 minutes, sans compromettre la pureté, le rendement ou la viabilité.

Commencez par transférer les têtes fraîchement décapitées de souriceaux âgés d'un à deux jours dans une hotte à flux laminaire. Ensuite, utilisez des ciseaux microchirurgicaux droits de 4,5 pouces pour pratiquer une petite incision dans le crâne et les méninges en insérant les pointes dans l'ouverture formée par la décapitation, puis coupez de la partie caudale vers la partie rostrale. Après avoir réalisé l'incision, écartez l'un des hémisphères sur le côté.

Ensuite, utilisez une paire de pinces courbées ou crochues pour retirer l'ensemble du cerveau. Transférez le cerveau dans un tube de 50 millilitres contenant deux millilitres de trypsine EDTA à 0,25 %, puis incubez pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lavez le cerveau avec du milieu de croissance frais en ajoutant et en retirant le milieu.

Après avoir terminé les lavages, ajouter deux millilitres de milieu de croissance par cerveau et homogénéiser en triturant le cerveau. Lorsque le tissu cérébral ne diminue pas en taille, passer à une pipette ayant une ouverture plus petite. À la fin de la trituration, lorsque la suspension est limpide et ne présente plus d'agrégats visibles, filtrer la suspension à travers un filtre cellulaire de 70 microns afin d'obtenir une culture monocellulaire.

Ensuite, pipeter huit à neuf millilitres de milieu de croissance dans des fioles T75, deux fioles par cerveau, et ajouter un millilitre d'homogénat cérébral dans chaque fiole. Faire croître les cellules jusqu'à l'isolement au seizième jour. Après seize jours, transférer le milieu de croissance de la fiole vers un nouveau tube de 50 millilitres.

Ajouter trois millilitres de trypsine EDTA à 0,25 % dans chaque flacon T75. Ensuite, agiter les flacons pendant cinq minutes à température ambiante sur un agitateur orbital. Centrifuger le milieu de croissance à 0,4 fois g pendant cinq minutes.

Après agitation pendant cinq minutes, ajouter un minimum de quatre millilitres de milieu de culture centrifugé pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA, puis procéder à la trituration afin de s'assurer que toutes les cellules ont été détachées. Ensuite, faire passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres pour obtenir une culture monocellulaire. Effectuer un dénombrement cellulaire, puis centrifuger à 0,4 ×g pendant cinq minutes.

Ensuite, prenez un tube en polystyrène de cinq millilitres, ajoutez un millilitre de milieu recommandé et marquez le ménisque. Ajoutez du milieu recommandé jusqu’à 2,5 millilitres, et marquez également ce ménisque. Puis, retirez le milieu et re-suspendez le culot dans 500 microlitres de milieu recommandé.

Transférez ce mélange dans un tube en polystyrène de cinq millilitres, puis diluez jusqu'au trait d’un millilitre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de sérum de rat pour chaque millilitre de cellules en suspension, et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, préparez le cocktail de sélection en mélangeant 25 microlitres du composant A et 25 microlitres du composant B. Une fois les cinq minutes écoulées, ajoutez 50 microlitres du cocktail de sélection aux cellules, et incubez pendant cinq minutes supplémentaires à température ambiante.

Vortexez les microsphères pendant 45 secondes. Ajoutez ensuite 80 microlitres de microsphères par millilitre d'échantillon, et incubez pendant trois minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite le milieu recommandé jusqu'au trait de 2,5 millilitres sur le tube en polystyrène.

Placer le tube dans le support magnétique pendant trois minutes à température ambiante. Après l'incubation, verser lentement le milieu dans un tube en polystyrène de 15 millilitres toujours placé sur l'aimant. Répéter la séparation magnétique trois fois supplémentaires, en ajoutant à chaque fois du milieu recommandé jusqu'au trait de 2,5 millilitres.

Après la dernière séparation magnétique, ajouter trois millilitres de milieu de croissance et dénombrer le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Ensemencer les cellules dans des plaques revêtues de poly-D-lysine pour les traitements. Ensemencer la fraction négative provenant du tube de 15 millilitres, qui contient principalement des astrocytes, dans des flacons T75.

Après au moins six heures d'incubation dans un incubateur à 37 degrés Celsius, remplacer tout le milieu de croissance dans les flacons contenant la fraction négative avant de les remettre dans l'incubateur. Cette image montre une immunocytochimie d'une culture microgliale isolée, révélant IBA, un marqueur des microglies, en canal vert, et GFAP, un marqueur des astrocytes, en canal rouge. La coloration au Hoechst révèle la présence des noyaux cellulaires.

L'absence de cellules positives pour GFAP démontre que les microglies isolées à l'aide du kit de sélection positive CD11b présentent également une grande pureté. Les protéines immunodétections issues d'une culture microgliale isolée ont été analysées pour GFAP, qui apparaît sous forme d'une bande d'environ 51 kilodaltons, et pour IBA1, qui apparaît sous forme d'une bande d'environ 15 kilodaltons. La bêta-actine a été utilisée comme témoin de chargement et apparaît à environ 42 kilodaltons.

Un problème avec l'ancien kit d'isolement était que la fluorescence de la PE pouvait être observée dans le canal rouge, comme indiqué ici. La procédure modifiée ne produit aucune auto-fluorescence provenant des billes magnétiques, comme observé dans le canal rouge ici. Les microglies isolées à l'aide de cette procédure peuvent être utilisées pour des études de signalisation.

L'analyse par immunotransfert montre que Fyn et la tyrosine phosphorylée de Src en Y416 peuvent être détectées dans les microglies isolées à l'aide de notre méthode nouvellement affinée. La fraction négative issue de la séparation des microglies contient des astrocytes qui peuvent être utilisés pour des études de signalisation. L'immunotransfert révèle que la fraction négative contient des cellules positives pour GFAP.

L'analyse par immunotransfert montre que la Fyn et la tyrosine phosphorylée de la Src en Y416 peuvent être détectées dans les cellules positives pour GFAP. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la microscopie à fluorescence multicanal, l'immunotransfert et la PCR quantitative, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant l'expression génique et la signalisation protéique. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser cette technique d'isolement rapide à des fins d'expérimentation sur les microglies.