Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

L’objectif global de l’isolement de la microglie magnétique CD11b est d’obtenir un rendement final de haute pureté de la microglie postnatale dans un laps de temps relativement court à des fins d’expérimentation in vitro polyvalente. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les mécanismes de signalisation pertinents à l’inflammation neuronale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuellement disponibles est que l’isolement prend environ 30 minutes, sans sacrifier la pureté, le rendement ou la viabilité.

Commencez par transférer les têtes fraîchement décapitées de bébés souris âgés d’un à deux jours dans une cagoule à flux d’air laminaire. Ensuite, utilisez des ciseaux de micro-dissection droits de 4,5 pouces pour faire une petite incision dans le crâne et les méninges en insérant les pointes dans l’ouverture formée par la décapitation et en coupant de la caudale à la rostrale. Après avoir fait l’incision, pelez l’un des hémisphères sur le côté.

Ensuite, utilisez une pince à épiler incurvée ou crochue pour retirer tout le cerveau. Transférez le cerveau dans un tube de 50 millilitres contenant deux millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA et incubez pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Lavez le cerveau avec un milieu de croissance frais en ajoutant et en retirant le milieu.

Une fois les lavages terminés, ajoutez deux millilitres de milieu de croissance par cerveau et homogénéisez en triturant le cerveau. Lorsque le tissu cérébral ne rétrécit pas, passez à une pipette avec une ouverture plus petite. À la fin de la trituration, lorsque la suspension est claire et qu’il n’y a pas de morceaux visibles, passez la suspension dans une crépine cellulaire de 70 microns pour créer une culture cellulaire unique.

Ensuite, pipetez huit à neuf millilitres de milieu de croissance dans des flacons T75, deux flacons par cerveau, et ajoutez un millilitre d’homogénat de cerveau dans chaque flacon. Cultivez les cellules jusqu’à l’isolement au seizième jour. Après seize jours, transférez le milieu de croissance du flacon dans un tube frais de 50 millilitres.

Ajouter trois millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA dans chaque fiole T75. Ensuite, agitez les flacons pendant cinq minutes à température ambiante sur un agitateur orbital. Centrifuger le milieu de croissance à 0,4 fois g pendant cinq minutes.

Après avoir agité pendant cinq minutes, ajoutez un minimum de quatre millilitres de milieu de culture centrifugé pour arrêter la réaction de la trypsine EDTA, et triturez pour vous assurer que toutes les cellules ont été détachées. Ensuite, passez les cellules dans une passoire de cellules de 70 micromolaires pour créer une culture cellulaire unique. Effectuez un comptage cellulaire, puis tournez à 0,4 fois g pendant cinq minutes.

Ensuite, prenez un tube de polystyrène de cinq millilitres, ajoutez un millilitre de milieu recommandé et marquez le ménisque. Ajoutez le milieu recommandé jusqu’à 2,5 millilitres et marquez également ce ménisque. Ensuite, retirez le fluide et remettez le granulé en suspension dans 500 microlitres du milieu recommandé.

Transférez ce mélange dans un tube de polystyrène de cinq millilitres, puis diluez jusqu’à ce qu’il atteigne le repère d’un millilitre. Ajoutez ensuite 50 microlitres de sérum de rat pour chaque millilitre de cellules en suspension et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, préparez le cocktail de sélection en mélangeant 25 microlitres du composant A et 25 microlitres du composant B. Une fois les cinq minutes écoulées, ajoutez 50 microlitres du cocktail de sélection dans les cellules et incubez pendant cinq minutes supplémentaires à température ambiante.

Faites vortex les microsphères pendant 45 secondes. Ajoutez ensuite 80 microlitres de microsphères par millilitre d’échantillon et incubez pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez le fluide recommandé jusqu’à 2,5 millilitres sur le tube en polystyrène.

Placez le tube dans le support magnétique pendant trois minutes à température ambiante. Après l’incubation, versez lentement le fluide dans un tube en polystyrène de 15 millilitres encore dans l’aimant. Répétez la séparation magnétique trois fois de plus, en ajoutant à chaque fois le fluide recommandé jusqu’à la marque de 2,5 millilitres.

Après la dernière séparation magnétique, ajoutez trois millilitres de milieu de croissance et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Plaquez les cellules dans des plaques recouvertes de poly-D-lysine pour les traitements. Plaquez la fraction négative du tube de 15 millilitres, qui contient principalement des astrocytes, dans des flacons T75.

Après au moins six heures d’incubation dans un incubateur à 37 degrés Celsius, remplacez tout le milieu de culture dans les flacons contenant la fraction négative avant de retourner dans l’incubateur. Cette image montre l’immunocytochimie d’une culture microgliale isolée sondée pour l’IBA, un marqueur de la microglie dans le canal vert, et le GFAP, un marqueur des astrocytes, dans le canal rouge. La coloration de Hoechst révèle la présence de noyaux cellulaires.

L’absence de cellules GFAP-positives démontre que les microglies isolées à l’aide du kit de sélection CD11b positif ont également une grande pureté. Ces protéines immunoblotties provenant d’une culture microgliale isolée ont été sondées pour détecter la GFAP, qui se présente sous la forme d’une bande d’environ 51 kilodaltons, et l’IBA1, qui se présente sous la forme d’une bande d’environ 15 kilodaltons. La bêta-actine a été utilisée comme contrôle de la charge et pèse environ 42 kilodaltons.

Un problème avec l’ancien kit d’isolement était que la fluorescence PE pouvait être observée dans le canal rouge, comme on le voit ici. La procédure modifiée ne produit aucune auto-fluorescence à partir des billes magnétiques, comme on le voit dans le canal rouge ici. La microglie isolée à l’aide de cette procédure peut être utilisée pour des études de signalisation.

L’analyse par transfert Western montre que Fyn et la tyrosine Y416 peuvent être détectées à partir de microglies isolées avec notre méthode nouvellement perfectionnée. La fraction négative de la séparation microgliale contient des astrocytes qui peuvent être utilisés pour les études de signalisation. Le Western blot montre que la fraction négative contient des cellules GFAP positives.

L’analyse par transfert Western montre que Fyn et la tyrosine Y416 phospho-src peuvent être détectées à partir des cellules positives à la GFAP. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la microscopie à fluorescence multicanaux, le western blot et la PCR quantitative, peuvent être effectuées pour répondre à des questions concernant l’expression des gènes et la signalisation des protéines. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser cette technique d’isolement rapide à des fins d’expérimentation microgliale.