Name: Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Apprenez l'isolation magnétique CD11b des microglies postnatales de souris en 30 minutes avec haute pureté et rendement. Cette méthode permet des études in vitro polyvalentes sur l'inflammation neuronale.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH): le nom de subventions NS088206 et ES026892. W. Eugene et Linda Lloyd président à Doué AGK et les doyens Professorat à AK sont également reconnues.

L&#39;utilisation des animaux et des procédures de protocole ont été approuvés et supervisés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l&#39;Iowa State University (Ames, IA, États-Unis) 1. Croissance des cultures mixtes gliales <ol><li> 1- 2 chiots Décapitez âgés jour rapidement avec 5,5 pouces ciseaux d&#39;exploitation, et placer les têtes immédiatement dans un tube de 50 ml sur la glace. Notez que cette décapitation est le mode d&#39;euthanasie. </li><li> Dans une hotte à flux laminaire, une petite incision dans le crâne et les méninges en utilisant 4,5 pouces ciseaux micro-dissection droites. Commencer à couper à partir de l&#39;extrémité caudale à l&#39;extrémité rostrale (nez). Obtenir sous la peau à l&#39;aide de l&#39;ouverture formée par la décapitation. <ol><li> Après l&#39;incision, peler une des hémisphères sur le côté. Ensuite, utilisez une paire de pinces courbes ou crochet pour enlever l&#39;ensemble du cerveau. </li></ol></li><li> Immerger le cerveau (s) dans un nouveau tube de 50 ml contenant 0,25% de trypsine-ethylenediaminetetraacetmangé acide (EDTA) pendant 15 min dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. Utiliser 2 ml de trypsine-EDTA par cerveau. </li><li> Laver le cerveau (s) avec des produits frais du milieu de croissance (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% de pyruvate de sodium, et 1% d&#39;acides aminés non essentiels) en ajoutant et en enlevant le médias. Répétez cette 4x. </li><li> Pour chaque cerveau, plaque deux T-75 flacons contenant un milieu de croissance. Par conséquent, ajouter 2 ml de milieu de croissance par cerveau au tube. Ainsi, il sera un équivalent de 1 ml de cerveau homogénéisés avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75. </li><li> Homogénéiser par triturer le cerveau (s) avec des pipettes de différentes tailles d&#39;ouverture, pour le plus grand au plus petit. Quand il est visible que le tissu du cerveau ne reçoit pas plus petit, la transition à la pipette suivante. A la fin de la trituration, la suspension doit être claire, sans morceaux visibles. <ol><li> Utiliser une pipette de 25 ml, pipette 5 ml, puis une pipette de 10 ml de manière séquentielle. </li></ol></li><li> Passez chaque homogsuspension Enous du cerveau à travers un tamis cellulaire de 70 um à en faire une culture d&#39;une cellule unique. </li><li> Pour chaque cerveau homogénéisé, plaque deux flacons T-75 contenant un milieu de croissance, tel que décrit à l&#39;étape 1.5 (1 ml de cerveau homogénéisé avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75). </li><li> Changer les médias de croissance après 6 d et croître jusqu&#39;à l&#39; isolement le 16 e jour. </li></ol> 2. Isolement des cellules microgliales <ol><li> Après 16 jours, retirez le support de croissance du ballon et le placer dans un nouveau tube de 50 ml. Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque flacon T-75. Agiter les flacons pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur orbital. <ol><li> Centrifuger la milieu de croissance retiré à 0,4 g pendant 5 min et en utilisant pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA dans l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> Après agitation pendant 5 min, ajouter un minimum de 4 ml de milieu de croissance (frais ou le support utilisé à partir 2.1.1) pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA. </li><li> Triturer pour faire en sorte que tous les cElls ont été détachés. </li><li> Après trituration, passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um pour en faire une seule culture cellulaire, effectuer une numération cellulaire, puis centrifuger les cellules à 0,4 g pendant 5 min. </li><li> Pour chaque 100 x 10 6 cellules (environ 15 x flacons T-75), en utilisant 1 ml de milieu recommandé (2% de FBS, du DPBS (calcium et sans chlorure de magnésium), EDTA 1 mM) pour remettre en suspension le culot cellulaire. REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont adaptées pour une séparation 1 ml. </li><li> Prenez un tube de polystyrène 5 ml, ajouter 1 ml de supports recommandés, et marquer le ménisque. Ajouter un média recommandée jusqu&#39;à 2,5 ml et marquer aussi. Jeter les médias recommandée et transférer les cellules remises en suspension dans le tube de polystyrène 5 ml. </li><li> Ajouter 50 pi de sérum de rat pour chaque 1 ml de cellules en suspension. Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Préparer cocktail de sélection en mélangeant 25 pi de composant A et 25 ul de composant B. Ces composants sont exclusifs. </li><li> Ajouter 501; L du cocktail de sélection aux cellules. Incuber pendant 5 min à température ambiante. NOTE: Pour les cultures plus pures, répétez l&#39;étape 2.9 (recommandé mais non obligatoire). </li><li> microsphères de Vortex pour 45 s. Ajouter 80 pi de microsphères par 1 ml d&#39;échantillon. Incuber pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Porter le volume à 2,5 ml dans le tube de polystyrène en ajoutant les supports recommandés. </li><li> Placer le tube dans l&#39;aimant pendant 3 min à température ambiante. Ajuster l&#39;incubation pour augmenter la pureté. Verser lentement le support recommandé dans un tube de 15 ml avec l&#39;aimant toujours dans le tube de polystyrène. </li><li> Répétez l&#39;étape 2,12 trois fois plus. peuvent être effectués incubations magnétiques supplémentaires pour augmenter la pureté. </li><li> Ajouter 3 ml de milieu de croissance et compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules. </li><li> Cellules de la plaque en conséquence de Poly-D-Lysine (PDL) des plaques revêtues d&#39;pour les traitements. Traiter les cellules 48 h après l&#39;ensemencement des plaques revêtues de inPDL. Cela permet aux cellules de récupérer du stress de la séparation. NOTE: Check la pureté de la culture en utilisant une immunocytochimie comme décrit précédemment 15. </li><li> Plaque de la fraction négative (recueilli dans un tube de 15 ml), qui contient principalement des astrocytes, dans des flacons T-75 dans le milieu de croissance. </li><li> Après au moins 6 heures d&#39;incubation à 37 ° C incubateur, changer le milieu et laisser croître O / N. Diviser les astrocytes le lendemain pour les traitements. </li></ol>

<ol><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
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<li>Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+isolation+of+murine+microglia+by+mild+trypsinization%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization.</a> Glia. 44 (3), 183-189 (2003).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+magnetic+separation+method+for+high-yield+isolation+of+pure+primary+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia.</a> J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).</li>
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<li>Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting%3A+a+fast+and+effective+method+of+concurrent+isolation+of+high+purity+viable+astrocytes+and+microglia+from+neonatal+mouse+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).</li>
<li>Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+receptor+signaling+in+the+brain+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adenosine receptor signaling in the brain immune system.</a> Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).</li>
<li>Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li>
<li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+epigenetic+regulation%2C+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li>
<li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Anciennes méthodes d&#39;isolement microgliales ont des recouvrements limités qui ne sont pas appropriés pour diverses analyses de protéines par Western Blot et des analyses ARN par qRT-PCR. L&#39;adhérence différentielle et les méthodes de trypsinisation douces sont deux approches courantes avec de faibles rendements microgliales 13, 14, 15. L&#39;approche basée CD11b colonne de récupération est également faible, mais permet d...

Les microglies sont macrophages résidents Myb indépendants d&#39;origine mésodermique, qui se différencient à partir de c-kit + / CD45- érythromyéloïde progéniteurs dans les îlots sanguins de la vésicule ombilicale 1, 2. Une fois embryologique microglie ont colonisé le système nerveux central (SNC), leur transition d&#39;une amoeboid à une forme ramifiée 3. Ces microglies adultes sont classés comme Surveillant puisque leurs ramifications dynamiques sonde le parenchyme cérébral sain pour les insultes potentiels 4. Bien que les microglies ne contribuent à environ 10% de la population de cellules du système nerveux central, leur capacité à carreaux entre l&#39;autre assure la numérisation maximale du parenchyme 4, 5. Motifs moléculaires associés danger (DAMPS), tels que α-synucléine 6, 7 et 8 β-amyloïde, ou pmotifs moléculaires associés athogen (PAMP) tels que le lipopolysaccharide (LPS) 9, classiquement activer la microglie , de promouvoir une réaction inflammatoire caractérisée par le retour à l&#39;état actif de amoeboid et la production d&#39;oxyde nitrique, le facteur-α de nécrose tumorale (TNF), l&#39; interleukine 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, et le ligand motif chimiokine CC 2 9, 10, 11. Dans des conditions neuro - inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, dans laquelle pathogène α-synucléine a accumulé, un cycle neurodégénérative est créé à partir de la mort des neurones dopaminergiques, qui libèrent α-synucléine agrégée plus, en favorisant en outre l&#39; activation de la microglie classique 7. Similaires aux macrophages périphériques, la microglie peut également avoir la capacité d&#39;activer alternativement en présence des cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-10, en leur donnant la puissanteial de favoriser la réparation neuronale et l&#39; inflammation 2 atténuer, 11. En plus de leurs rôles immunologiques dans le système nerveux central, la microglie ont été décrits en tant que régulateurs vitaux des circuits neuronaux par la taille synapses au cours du développement. Par exemple, les souris KO ont Cx3cr1- microglie moins denses et réduit la taille synaptique, ce qui conduit à une surabondance d&#39;épines dendritiques immatures, synapses, et les motifs électrophysiologiques d&#39;une sous - développée du système nerveux central 12. La compréhension de ces complexités physiologiques et les divers rôles fonctionnels des microglies dans l&#39;homéostasie du système nerveux central est essentiel à la recherche de thérapies ciblant les maladies neurodégénératives. Dans le domaine de la neuro - immunologie, des expériences in vitro sont hautement souhaitables en raison de la plus grande faisabilité des études mécanistes, les coûts d&#39;entretien et d&#39;être moins de temps et de main-d&#39;œuvre. Furthermore, la capacité d&#39;isoler des populations de cellules est essentielle pour délimiter la fonctionnalité de ces cellules cibles dans des conditions prescrites. De nombreuses méthodes d&#39;isolement microgliales existent, mais ils sont limités par leur capacité à obtenir un nombre relativement élevé et la pureté pour une large expérimentation 13, 14, 15. Par exemple, un groupe d&#39;11b de différenciation (CD11b) est un marqueur de surface commune des monocytes, les macrophages et les microglies 16. En exploitant CD11b, un procédé de séparation magnétique a d&#39; abord été décrit comme étant une approche basée sur colonne qui a donné ~ pureté de 99,5% et ~ 1,6 x 10 6 par la microglie cerveau néonatal 17. Notre laboratoire a récemment mis au point un procédé de séparation magnétique CD11b libre de la colonne 15, que nous avons effectuée dans un tube de polystyrène par le marquage CD11b avec un anticorps monoclonal conjugué à la phycoérythrine (PE). Un bispécifique secondary anticorps à PE et complexes dextrane avec le PE. Une fois lié, les particules magnétiques revêtues de dextrane sont introduits, qui se lient à la fin de dextrane du complexe d&#39;anticorps. Enfin, le tube en polystyrène est placé dans un aimant pour l&#39;isolement de la microglie. Cette approche a doublé le rendement à ~ 3,2 x 10 6 microglies par cerveau du nouveau - né , mais au coût de la réduction à la pureté ~ 97%. Ici, nous démontrons un protocole magnétique CD11b sans colonne rapide et raffinée séparation (figure 1). Cette méthode améliorée reste aussi possible que notre méthode sans colonne d&#39;origine puisque le prix du kit de séparation magnétique CD11b est le même. La durée de traitement est réduit de moitié, ce qui peut être crucial pour optimiser le rendement et la survie cellulaire. En particulier, la pureté obtenue à partir de cette méthode optimisée est ~&gt; 99%, une nette amélioration par rapport à la pureté obtenue à partir de la méthode sans colonne originale développée par notre laboratoire 15. Plus important encore, CD11b-PEn&#39;est pas utilisé, ce qui élimine la nécessité de laisser incuber abri de la lumière et permettant l&#39;utilisation du canal rouge pour la microscopie de fluorescence. Enfin, comme dans le procédé CD11b original, une fraction astrocytaire de rendement élevé et une pureté est obtenue avec ce procédé amélioré. Les astrocytes sont les plus nombreuses cellules gliales du système nerveux central, ce qui conduit à l&#39;idée que leurs fonctions sont indispensables homéostatique par rapport à 18 physiopathologie. Ces cellules gliales jouent un rôle dans diverses fonctions physiologiques telles que la formation de la barrière hémato-encéphalique, fournissant un soutien en éléments nutritifs, le maintien de l&#39;homéostasie des neurotransmetteurs, formant des cicatrices gliales en réponse à des blessures, la neuroprotection, l&#39;apprentissage et la mémoire, et neuroinflammation, ce qui illustre leur potentiel d&#39;enquête dans gliale biologie 19. Morphologique et la fonctionnalité de la microglie et astrocytes ont été vérifiés par microscopie confocale, Western Blot quantitative en temps réel Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gdosage de nitrite Riess, et le dosage des cytokines multiplex Luminex. Le raffinement fourni par ce protocole offre une plus grande confiance concernant la pureté des microglies ou astrocytes, une application plus large de la microscopie à fluorescence avec la disponibilité du canal rouge, et fait gagner du temps, qui sont tous importants pour l&#39; expérimentation in vitro.

<table><tbody><tr><td>EasySep CD11b Separation Kit II</td><td>StemCell Technologies</td><td>18970</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>13H469</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco de Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr></tbody></table>

rapide et raffiné cd11b isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Les microglies sont les répondeurs principaux aux insultes du système nerveux central; Cependant, il reste encore beaucoup de leur rôle dans la régulation neuro-inflammation. Microglies sont des cellules mésodermiques qui fonctionnent de manière similaire aux macrophages dans le stress inflammatoire arpentage. Le classique (M1-type) et alternatif (M2 type) activations de macrophages ont également été étendues à microglie dans le but de mieux comprendre l&#39;interaction sous-jacente de ces phénotypes ont dans des conditions neuro-inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, d&#39;Alzheimer et la maladie de Huntington. Dans l&#39; expérimentation in vitro en utilisant la microglie primaire offre des résultats rapides et fiables qui peuvent être étendues à l&#39;environnement in vivo. Bien que ce soit un net avantage sur l&#39; expérimentation in vivo, l&#39; isolement microglies tout en obtenant des rendements adéquats de pureté optimale a été un défi. Les méthodes courantes actuellement utilisées souffrent soit de faible récupération, de faible pureté, ou les deux. Ici, nous demontrer un perfectionnement du procédé de séparation magnétique CD11b sans colonne qui permet d&#39;obtenir une récupération élevée de cellules et de pureté améliorée dans la moitié de la quantité de temps. Nous vous proposons cette méthode optimisée comme un modèle très utile d&#39;isolement microglie primaire aux fins de l&#39;étude et la neuro-inflammation neurodégénérescence.

Microglie isolés en utilisant le kit de sélection positive CD11b II ont une grande pureté microglies de souris primaires ont été isolés en utilisant le protocole mentionné ci-dessus et étalées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine pour vérifier la pureté de l&#39;isolement. Dix mille cellules ont été étalées par puits et l&#39;analyse immunocytochimique a été effectuée en utilisant la molécule d&#39;adaptateur de liaison du ...

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l&#39; expérimentation in vitro. Cette méthode d&#39;isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l&#39;élucidation de la biologie de la microglie.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

L'objectif général de l'isolement magnétique des microglies par CD11b est d'obtenir un rendement final de microglies postnatales de haute pureté en un temps relativement court, afin de permettre des expérimentations in vitro polyvalentes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les mécanismes de signalisation liés à l'inflammation neuronale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes actuellement disponibles réside dans le fait que l'isolement prend environ 30 minutes, sans compromettre la pureté, le rendement ou la viabilité.Commencez par transférer les têtes fraîchement décapitées de souriceaux âgés d'un à deux jours dans une hotte à flux laminaire. Ensuite, utilisez des ciseaux microchirurgicaux droits de 4,5 pouces pour pratiquer une petite incision dans le crâne et les méninges en insérant les pointes dans l'ouverture formée par la décapitation, puis coupez de la partie caudale vers la partie rostrale. Après avoir réalisé l'incision, écartez l'un des hémisphères sur le côté.Ensuite, utilisez une paire de pinces courbées ou crochues pour retirer l'ensemble du cerveau. Transférez le cerveau dan

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Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules CD11b, y compris la microglie, du cerveau des petits de souris en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement. Les tissus cérébraux sont homogénéisés pour obtenir des suspensions unicellulaires, qui sont incubées avec des microbilles enrobées d’anticorps anti-CD11b, suivies d’une séparation sur colonne magnétique pour purifier la population de cellules CD11b+.

Isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau d’un bébé souris

Cette vidéo présente un protocole d’extraction de cellules microgliales à partir de lésions démyélinisantes dans le cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire magnétique. Le protocole consiste à disséquer le tissu cérébral lésé contenant des cellules microgliales, à traiter le tissu avec des enzymes spécifiques pour obtenir une suspension unicellulaire et à utiliser des billes magnétiques spécifiques des récepteurs microgliaux pour isoler les cellules microgliales.

Isolement de la microglie à partir de lésions démyélinisantes du cerveau de souris à l’aide du tri cellulaire activé par magnétoscopie

La vidéo a démontré la méthode d’isolement et de culture de cellules à partir du cerveau d’une souris néonatale. Il impliquait une dissociation enzymatique et mécanique du cerveau, suivie d’une culture dans un milieu de croissance dépourvu de facteur de croissance neuronale pour obtenir une population gliale mixte.

Obtention d’une culture mixte de cellules gliales à partir d’un cerveau de souris néonatale

Un protocole pour l’isolement des microglies primaire du cerveau murin est présenté. Cette technique contribue à faire avancer la compréhension actuelle des maladies neurologiques. Centrifugation en gradient de densité et de la séparation magnétique sont combinés pour produire une récolte suffisante d’un échantillon très pur. En outre, nous exposent les étapes pour la caractérisation des cellules microgliales.

La caractérisation et l’isolement des microglies primaire de souris par Centrifugation en Gradient de densité

Efforts pour comprendre en détail le fonctionnement du microgliales ont été entravées par le manque de modèles de culture microgliales qui récapitule les propriétés des matures in vivo de cellules microgliales. Ce protocole décrit une démarche d’isolement et de la culture visant à maintenir la survie robuste des microglies rat mature très ramifié dans des conditions définies et moyen.

Isolement et Culture des microglies rongeurs pour promouvoir une dynamique ramifié morphologie dans un milieu sans sérum

Nous décrivons l’isolement immunomagnetic des oligodendrocytes principal de la souris, qui permet d’isoler des cellules in vitro culture rapide et spécifique.

Isolation de Immunomagnetic rapide et spécifique de souris primaire Oligodendrocytes

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.

Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires

Nous présentons ici un protocole pour isoler et purifier la microglie primaire dans des modèles animaux de maladies démyélinisantes, en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement en colonne.

Isolement de la microglie primaire de souris par tri cellulaire activé magnétiquement dans des modèles animaux de démyélinisation

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .

Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme  

Apprenez l'isolation magnétique CD11b des microglies postnatales de souris en 30 minutes avec haute pureté et rendement. Cette méthode permet des études in vitro polyvalentes sur l'inflammation neuronale.

Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

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