Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

L’objectif global de la procédure d’extraction séquentielle du sel est de caractériser les profils de liaison des protéines à la chromatine en vrac et d’évaluer comment la liaison est modifiée lorsque la protéine, ou son environnement, est manipulé. Cette méthode mesure l’affinité relative des régulateurs épigénétiques pour la chromatine et peut être utilisée pour évaluer comment ces interactions changent lors de manipulations génétiques, chimiques et environnementales. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un moyen rapide et peu coûteux d’évaluer les profils de liaison des protéines de liaison à la chromatine.

Les personnes novices dans le domaine de la chromatine sont souvent confrontées à l’immunoprécipitation de la chromatine, ou ChIP. L’extraction séquentielle du sel est une vieille technique que même les scientifiques inexpérimentés peuvent utiliser pour répondre à bon nombre des mêmes questions. Pour commencer la procédure, récoltez 8 000 000 de cellules de chaque lignée cellulaire d’intérêt.

Lavez deux fois chaque échantillon de cellule avec cinq millilitres de PBS glacé. Remettre en suspension chaque échantillon et un millilitre d’un tampon hypotonique avec des inhibiteurs de protéase. Transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Faites pivoter les suspensions, de haut en bas, pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis centrifugez la suspension pendant cinq minutes à cette même température à 6 000 G. Jetez le surnageant. Équipez une micro-pipette d’un embout d’un millilitre.

Ajoutez au granulé 200 microlitres de tampon ripa modifié sans sel avec inhibiteurs de protéase. Tapotez la pointe de la pipette contre le fond du tube de microcentrifugation pour aspirer la pastille dans la pointe. Pipetez la pastille de haut en bas 15 fois.

L’échantillon doit devenir épais et collant à mesure que la pastille se brise. Homogénéisez chaque échantillon de cette manière et incubez les échantillons sur de la glace pendant trois minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 6500 G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Transférez les surnageants dans des tubes de microcentrifugation propres de 1,5 millilitre. À chaque granule, ajoutez 200 millilitres de tampon ripa modifié avec 100 millimolaires de chlorure de sodium et avec des inhibiteurs de protéase. Pipetez la pastille de haut en bas 15 fois.

Si la pastille est initialement difficile à aspirer dans la pointe de la pipette, tapotez la pointe au bas du tube. Répétez ce processus pour chaque échantillon et incubez les échantillons sur de la glace pendant trois minutes. Centrifugez les échantillons à 6500 G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Poursuivre l’extraction des échantillons dans des solutions tampons de ripa modifiées avec des concentrations croissantes de chlorure de sodium. Lorsque la pastille ne reste plus au fond du tube, placez la pastille dans le capuchon du tube de centrifugation avant de décanter le surnageant.

Après l’extraction en série du sel, pour chaque échantillon, ajoutez 70 millilitres de colorant quatre fois chargé en protéines à chacune des cinq fractions surnageantes. Chargez 30 microlitres de chaque fraction sur un gel d’acrylamide SDS. Effectuez un western blot standard en transférant les protéines dans une membrane et en les colorant avec les anticorps primaires appropriés.

Incuber le transfert dans des anticorps secondaires marqués avec un colorant infrarouge et imager le transfert. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour calculer l’intensité de la bande de chaque concentration de sel. Tracez l’intensité de la bande en fonction de la concentration en sel pour déterminer le modèle d’élution de la protéine d’intérêt.

L’extraction séquentielle au sel des protéines ARID1a et Polybromo 1 a montré une élution constante avec des concentrations de sel de 200 et 300 millimolaires, respectivement. L’extraction non séquentielle au sel des mêmes protéines a montré des résultats moins cohérents. Le temps d’incubation doit être optimisé pour chaque protéine examinée.

Ainsi, la SSE a été utilisée pour examiner les profils d’élution après des durées d’incubation variables. Un activateur transcriptionnel, Polybromo 1, a montré des profils d’élution similaires lorsqu’il a été incubé pendant trois minutes et 10 minutes. Le répresseur transcriptionnel, Polycomb Repressive Complex 1, indiqué par BMI1, a eu besoin de plus de trois minutes pour être libéré de la chromatine.

Les interactions protéine-protéine ont été étudiées en examinant la modification des profils d’élution. En présence d’un inhibiteur, le bromodomaine contenant la protéine quatre a fait allusion à des concentrations de sel plus faibles que sans l’inhibiteur. Des différences dans les motifs des histones ont été observées lorsque les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de l’histone désacétylase, modifiant le paysage de la chromatine.

Les changements dans la liaison aux protéines lorsque les cellules ont subi un stress génomique se sont également reflétés dans les profils d’élution. Ici, l’augmentation de la concentration en sel nécessaire à l’élution suggère que le Polybromo 1 se lie plus étroitement à la chromatine après des dommages à l’ADN avec la doxorubicine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est exécutée correctement.

Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas d’être aussi cohérent que possible dans votre traitement de chaque échantillon. Cette procédure peut être utilisée dans les premières étapes d’une étude pour élucider le mécanisme et la régulation d’une protéine de liaison à la chromatine. Cela permet d’économiser du temps et de l’argent sur des études inutiles à l’échelle du génome.