Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes
2 octobre 2017
Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.
L’objectif global de la procédure d’extraction séquentielle du sel est de caractériser les profils de liaison des protéines à la chromatine en vrac et d’évaluer comment la liaison est modifiée lorsque la protéine, ou son environnement, est manipulé. Cette méthode mesure l’affinité relative des régulateurs épigénétiques pour la chromatine et peut être utilisée pour évaluer comment ces interactions changent lors de manipulations génétiques, chimiques et environnementales. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un moyen rapide et peu coûteux d’évaluer les profils de liaison des protéines de liaison à la chromatine.
Les personnes novices dans le domaine de la chromatine sont souvent confrontées à l’immunoprécipitation de la chromatine, ou ChIP. L’extraction séquentielle du sel est une vieille technique que même les scientifiques inexpérimentés peuvent utiliser pour répondre à bon nombre des mêmes questions. Pour commencer la procédure, récoltez 8 000 000 de cellules de chaque lignée cellulaire d’intérêt.
Lavez deux fois chaque échantillon de cellule avec cinq millilitres de PBS glacé. Remettre en suspension chaque échantillon et un millilitre d’un tampon hypotonique avec des inhibiteurs de protéase. Transférez les suspensions cellulaires dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Faites pivoter les suspensions, de haut en bas, pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, puis centrifugez la suspension pendant cinq minutes à cette même température à 6 000 G. Jetez le surnageant. Équipez une micro-pipette d’un embout d’un millilitre.
Ajoutez au granulé 200 microlitres de tampon ripa modifié sans sel avec inhibiteurs de protéase. Tapotez la pointe de la pipette contre le fond du tube de microcentrifugation pour aspirer la pastille dans la pointe. Pipetez la pastille de haut en bas 15 fois.
L’échantillon doit devenir épais et collant à mesure que la pastille se brise. Homogénéisez chaque échantillon de cette manière et incubez les échantillons sur de la glace pendant trois minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à 6500 G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.
Transférez les surnageants dans des tubes de microcentrifugation propres de 1,5 millilitre. À chaque granule, ajoutez 200 millilitres de tampon ripa modifié avec 100 millimolaires de chlorure de sodium et avec des inhibiteurs de protéase. Pipetez la pastille de haut en bas 15 fois.
Si la pastille est initialement difficile à aspirer dans la pointe de la pipette, tapotez la pointe au bas du tube. Répétez ce processus pour chaque échantillon et incubez les échantillons sur de la glace pendant trois minutes. Centrifugez les échantillons à 6500 G à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.
Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Poursuivre l’extraction des échantillons dans des solutions tampons de ripa modifiées avec des concentrations croissantes de chlorure de sodium. Lorsque la pastille ne reste plus au fond du tube, placez la pastille dans le capuchon du tube de centrifugation avant de décanter le surnageant.
Après l’extraction en série du sel, pour chaque échantillon, ajoutez 70 millilitres de colorant quatre fois chargé en protéines à chacune des cinq fractions surnageantes. Chargez 30 microlitres de chaque fraction sur un gel d’acrylamide SDS. Effectuez un western blot standard en transférant les protéines dans une membrane et en les colorant avec les anticorps primaires appropriés.
Incuber le transfert dans des anticorps secondaires marqués avec un colorant infrarouge et imager le transfert. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour calculer l’intensité de la bande de chaque concentration de sel. Tracez l’intensité de la bande en fonction de la concentration en sel pour déterminer le modèle d’élution de la protéine d’intérêt.
L’extraction séquentielle au sel des protéines ARID1a et Polybromo 1 a montré une élution constante avec des concentrations de sel de 200 et 300 millimolaires, respectivement. L’extraction non séquentielle au sel des mêmes protéines a montré des résultats moins cohérents. Le temps d’incubation doit être optimisé pour chaque protéine examinée.
Ainsi, la SSE a été utilisée pour examiner les profils d’élution après des durées d’incubation variables. Un activateur transcriptionnel, Polybromo 1, a montré des profils d’élution similaires lorsqu’il a été incubé pendant trois minutes et 10 minutes. Le répresseur transcriptionnel, Polycomb Repressive Complex 1, indiqué par BMI1, a eu besoin de plus de trois minutes pour être libéré de la chromatine.
Les interactions protéine-protéine ont été étudiées en examinant la modification des profils d’élution. En présence d’un inhibiteur, le bromodomaine contenant la protéine quatre a fait allusion à des concentrations de sel plus faibles que sans l’inhibiteur. Des différences dans les motifs des histones ont été observées lorsque les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de l’histone désacétylase, modifiant le paysage de la chromatine.
Les changements dans la liaison aux protéines lorsque les cellules ont subi un stress génomique se sont également reflétés dans les profils d’élution. Ici, l’augmentation de la concentration en sel nécessaire à l’élution suggère que le Polybromo 1 se lie plus étroitement à la chromatine après des dommages à l’ADN avec la doxorubicine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures si elle est exécutée correctement.
Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas d’être aussi cohérent que possible dans votre traitement de chaque échantillon. Cette procédure peut être utilisée dans les premières étapes d’une étude pour élucider le mécanisme et la régulation d’une protéine de liaison à la chromatine. Cela permet d’économiser du temps et de l’argent sur des études inutiles à l’échelle du génome.
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Aperçu
La procédure d'extraction séquentielle par sels est conçue pour caractériser les profils de liaison des protéines à la chromatine globale et évaluer comment ces liaisons sont modifiées par diverses manipulations. Cette méthode est particulièrement utile pour évaluer l'affinité des régulateurs épigénétiques envers la chromatine.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie de la chromatine
- Interactions protéiques
- Épigénétique
Contexte
- L'extraction séquentielle par sels est une technique permettant l'étude des protéines liant la chromatine.
- Elle constitue une alternative rapide et économique à la précipitation immunitaire de la chromatine (ChIP).
- Cette méthode est accessible même pour les scientifiques inexpérimentés.
- Elle permet d'évaluer comment les interactions protéiques évoluent en fonction de facteurs génétiques, chimiques et environnementaux.
Objectif de l'étude
- Caractériser les profils de liaison des protéines liant la chromatine.
- Évaluer les effets de diverses manipulations sur la liaison des protéines.
- Fournir une méthode simple aux chercheurs spécialisés dans le domaine de la chromatine.
Méthodes utilisées
- Récupération de 8 000 000 de cellules à partir de chaque lignée cellulaire d'intérêt.
- Extraction séquentielle par sels pour isoler les protéines liées à la chromatine.
- Évaluation de l'affinité de liaison des protéines à la chromatine.
- Analyse des modifications des profils de liaison dans différentes conditions.
Résultats principaux
- La méthode caractérise efficacement les profils de liaison des protéines.
- Elle montre comment les affinités de liaison peuvent être modifiées par des facteurs environnementaux.
- Les résultats indiquent l'utilité de cette technique tant pour les chercheurs expérimentés que pour les novices.
- Elle fournit des informations sur les interactions entre les régulateurs épigénétiques et la chromatine.
Conclusions
- L'extraction séquentielle par sels est un outil précieux pour l'étude des interactions de la chromatine.
- La méthode est efficace et accessible pour diverses applications de recherche.
- Elle améliore la compréhension des dynamiques de liaison des protéines en biologie de la chromatine.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans le secteur industriel
L'extraction séquentielle par sels (SSE) fournit une méthode rapide et rentable pour évaluer l'affinité des protéines liantes de la chromatine, permettant une validation précoce des cibles dans la découverte de médicaments axée sur l'épigénétique. En quantifiant la manière dont des perturbations génétiques, chimiques ou environnementales modifient les interactions protéine-chromatine, la SSE contribue à l'analyse mécanistique des complexes modifiant la chromatine avant de s'engager dans des tests exigeants en ressources. Cette approche améliore la fiabilité prédictive de l'identification de composés candidats en distinguant les effets de liaison directs des réponses cellulaires indirectes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Mesure les variations relatives de l'affinité de liaison lors de la perte de sous-unités du complexe ou de l'inactivation de domaines, précisant ainsi la contribution fonctionnelle des protéines individuelles à l'engagement avec la chromatine.
- Valeur scientifique : Analyse les profils d'élution sous des concentrations croissantes de sel afin de distinguer la liaison spécifique à la chromatine des associations non spécifiques, réduisant ainsi les faux positifs dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet à des non-spécialistes de produire des données quantitatives sur la liaison sans expertise spécialisée en ChIP, accélérant ainsi le test d'hypothèses en phase précoce.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des profils d'élution reproductibles qui servent de paramètres quantitatifs pour l'analyse des effets des composés sur les modifications du paysage chromatinien.
- Valeur opérationnelle : Utilise une infrastructure standard de western blot et d'analyse d'images, facilitant la normalisation des tests entre laboratoires et réduisant la variabilité technique.
- Valeur opérationnelle : Nécessite uniquement du matériel de base pour la centrifugation et l'électrophorèse, réduisant ainsi les obstacles à son adoption dans les cascades de criblage de modulateurs épigénétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Établit un lien entre les altérations de l'environnement de la chromatine (par exemple, via des inhibiteurs de l'HDAC) et les modifications de la liaison des protéines, soutenant ainsi des études mécanistiques alignées sur des biomarqueurs dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur scientifique : Évalue les changements de liaison en conditions de stress génomique (par exemple, dommages de l'ADN induits par la doxorubicine), fournissant ainsi des données pour des modèles prédictifs de l'engagement de la cible dans des conditions physiopathologiques.
- Valeur opérationnelle : Complète les tests cellulaires et biochimiques en offrant une validation orthogonale de la continuité des interactions avec la chromatine, du stade de découverte au stade préclinique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La SSE s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'optimisation de composés précurseurs, offrant un lien mécanistique entre les tests biochimiques de liaison et les analyses phénotypiques cellulaires dans les programmes d'épigénétique.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant l'impact de modifications complexes sur la liaison à la chromatine, permettant ainsi de clarifier les voies biologiques et de réduire les risques associés aux cibles épigénétiques.
- Criblage : Fournit des profils d'élution dépendants du sel comme sorties quantitatives, permettant de comparer les changements d'état de la chromatine induits par des composés au cours de campagnes de criblage.
- Analytique : Génère des données d'intensité des bandes tracées en fonction de la concentration en sel, offrant des décalages quantifiables d'affinité de liaison qui éclairent les discussions sur les relations structure-activité.
- Recherche translationnelle : Relie les modifications de liaison in vitro aux altérations du paysage de la chromatine au niveau cellulaire, facilitant l'alignement de biomarqueurs translationnels lorsqu'elle est associée à des mesures fonctionnelles.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité standardisée et peu coûteuse, applicable à plusieurs cibles de chromatine, favorisant la réutilisation de la plateforme dans les pipelines de découverte de médicaments épigénétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en distinguant la liaison directe à la chromatine des effets cellulaires indirects grâce à une élution contrôlée par sel.
- Valeur opérationnelle : Fournit des profils de liaison reproductibles et quantitatifs à l’aide d’équipements de laboratoire largement disponibles, améliorant ainsi la standardisation entre équipes.
- Valeur stratégique : Réduit la dépendance vis-à-vis de la ChIP, peu performante, pour les évaluations initiales de liaison, optimisant l’efficacité du capital dans les projets précoces d’épigénétique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles impliquant des complexes modificateurs de la chromatine, fondée sur la résilience quantitative de la liaison face à des perturbations environnementales.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biochimie de la chromatine et en quantification par immunotransfert (western blot) afin d'assurer une interprétation précise des profils d'élution.
- Dépend de l'accès à des centrifugeuses réfrigérées, à des tubes de microcentrifugation et à un équipement standard pour l'électrophorèse SDS-PAGE et les immunotransferts.
- Implique l'utilisation de protocoles standardisés de récolte et de lyse cellulaire afin de minimiser la variabilité entre échantillons et d'obtenir des résultats comparables lors de l'extraction par sels.
- Implique l'optimisation des temps d'incubation pour chaque protéine ciblée, car les cinétiques de libération des interactions varient selon les complexes modifiant la chromatine.
- Se limite à des comparaisons d'affinité relative ; la détermination des constantes d'affinité absolues nécessite des méthodes biophysiques complémentaires pour la validation.
