Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

L'objectif général de ce protocole de génération d'organoides cérébraux humains dérivés de cellules iPS est de modéliser les troubles neurodéveloppementaux humains précoces. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cérébral humain, telles que le rôle des synthésosomes et des cils dans la néonéogenèse et la microcéphalie primaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue un modèle robuste et rapide permettant d'obtenir des résultats reproductibles à partir d'organoides cérébraux dérivés de cellules iPS de patients.

La procédure sera démontrée par Elke Gabriel, une post-doctorante de mon laboratoire au Centre de médecine moléculaire de Cologne. Pour commencer cette procédure, recueillir les neurosphères à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres munie d’une pointe de deux millimètres préalablement coupée avec des ciseaux stériles. Ensuite, déposer les neurosphères à environ cinq millimètres d’intervalle sur un film de paraffine dans une boîte de 100 millilitres.

Et retirez soigneusement autant que possible du milieu restant. Ensuite, ajoutez une goutte de matrice EHS sur chaque neurosphère individuelle. Incubez les gouttes de matrice EHS avec les neurosphères pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, lavez soigneusement les neurosphères du film de paraffine en les rinçant avec le milieu de neurosphères. Incubez ensuite les neurosphères pendant les quatre jours suivants et ajoutez deux millimètres de milieu de neurosphères frais au jour deux. Dans cette procédure, ajoutez 100 millilitres de milieu d'organoides cérébraux à chaque flacon agité par ses bras latéraux.

Et préchauffez le milieu dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, assurez-vous que les neurosphères sont toutes séparées. Si deux ou plusieurs sont reliées par la matrice EHS, séparez-les en coupant la matrice de connexion avec un scalpel.

Configurer un programme d'agitation à 25 tr/min. Transférer soigneusement les neurosphères incluses dans la matrice EHS dans les flacons agitateurs contenant 100 millilitres de milieu d'organoides. Ensuite, disposer les flacons agitateurs sur une plateforme d'agitation magnétique dans l'incubateur pendant 14 jours à 37 degrés Celsius.

Ceci est le jour zéro de la culture d'organoïdes. Changer le milieu une fois par semaine en retirant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais. À cette étape, récupérer les organoïdes de la culture en flacon agité au jour 14 à l'aide d'une micropipette pré-coupée de un millilitre.

Placez-les tous dans une boîte de 60 millimètres et rincez-les une fois avec cinq millilitres de DMEM F12 chaud pendant trois minutes. Ensuite, préparez un tube de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PFA à 4 %, chaud. Placez chaque organoïde séparément dans chaque tube et fixez-les pendant 30 à 60 minutes à température ambiante.

Ensuite, utilisez un anneau d'inoculation pour prélever les organoïdes. Puis, éliminez le PFA et lavez les organoïdes fixés deux fois pendant 10 minutes chacune avec un millilitre de PBS. Par la suite, conservez les organoïdes dans un millilitre de PBS à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à 7 jours pour une utilisation ultérieure.

Pour inclure les organoïdes en vue d'une cryocoupe, retirez le PBS et ajoutez 1 millilitre de solution de saccharose à 30 % dans chaque tube afin de déshydrater les organoïdes avant leur congélation cryogénique. Après l'ajout de la solution de saccharose, les organoïdes doivent flotter à la surface. Conservez les organoïdes toute la nuit dans la solution de saccharose à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, les organoïdes devraient avoir coulé au fond du tube. Ensuite, remplissez un moule à échantillons en vinyle avec 400 millilitres de composé OCT. Utilisez ensuite une boucle d'ensemencement pour placer un organoïde au centre du moule.

Étiqueter le rebord du moule avec le nom de l'échantillon. Ensuite, congeler le moule contenant les organoïdes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à la cryoséctionnement. Par la suite, recouvrir les lames cryogéniques de PLL à 0,1 % dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, laissez sécher les lames pendant trois heures. Conservez les lames à quatre degrés Celsius et réchauffez-les à température ambiante avant utilisation. Par la suite, sectionnez les organoïdes congelés en tranches de 20 à 50 micromètres d'épaisseur sur les lames cryogéniques en verre revêtues de PLL.

Laisser sécher les coupes pendant une heure à température ambiante et conserver les coupes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à un traitement ultérieur. Imagerie en immunofluorescence d'organoïdes cryocoupés affichant une zone ventriculaire typique et une plaque corticale primitive. La zone ventriculaire s'étend du côté apical au côté basal.

Remarquez que les cellules situées dans la zone ventriculaire présentent des noyaux disposés en palissade, ce qui suggère qu'il s'agit de cellules gliales radiaires. Le panneau droit montre la coloration immunofluorescente de cellules progénitrices neuronales positives pour nestine situées dans la zone ventriculaire, ainsi que de neurones positifs pour TUJ1 dans la plaque corticale primitive. Deux exemples de zones ventriculaires colorées avec PVIM et ARL 13B sont présentés ici.

Les régions marquées par des carrés blancs sont agrandies. Les cellules gliales radiaires apicales se divisant du côté apical de la zone ventriculaire sont positives pour PVIM. Le plan de division d'une cellule en anaphase est horizontal par rapport à la ligne de surface du lumen, marquée par la coloration ARL 13B.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 23 jours si elle est correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer des contrôles de qualité périodiques ainsi que des contrôles de microplasma sur les cultures. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement en neurobiologie pour explorer les mécanismes du développement neuronal dans les organoïdes cérébraux humains.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des organoïdes cérébraux humains à partir de diverses lignées cellulaires de cellules souches pluripotentes induites, y compris des lignées cellulaires de patients présentant des fonctions cellulaires altérées.