Name: Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Découvrez la génération d'organoides cérébraux dérivés d'iPSC pour modéliser les troubles neurodéveloppementaux précoces comme la microcéphalie. Cette méthode robuste offre des résultats reproductibles pour étudier la neurogenèse.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation Fritz Thyssen (Az.10.14.2.152). Nous sommes reconnaissants à l&#39;installation d&#39;enrobage des tissus et l&#39;installation de base de microscope de CMMC. Nous sommes reconnaissants pour les discussions et le soutien technique fourni par les membres du Laboratoire de biologie Centrosome et cytosquelette. Nous remercions Li Ming Gooi pour la relecture du manuscrit.

1. Génération du cerveau organites (23 jours) <ol><li> Initiation de neuroectoderme (5 jours) REMARQUE: Les points suivants doivent être pris en considération avant le début de la différenciation. La méthode de reprogrammation (lentiviral-, sendai-virus-, épisomiques ou etc. , selon microARN) pour obtenir CSPi humaines devrait idéalement être la même pour tous les patients et le contrôle des lignes iPSC. Divers kits de reprogrammation et instructions basées sur des protocoles publiés sont disponibles 15, 16, 17, 18. La qualité des lignes iPSC humaines est la clé pour une différenciation optimale accomplir. Surveiller la colonie et la morphologie des cellules au microscope et valider la pluripotence en testant l&#39;expression de marqueurs tels que Oct3 / 4, Nanog, ou TRA-1-60. <ol><li> CSPi humaines de la culture dans des conditions sans alimentation dans le milieu A sur un plat recouvert de Engelbreth-Holm-Swarmmatrice (EHS). REMARQUE: cultiver des liaisons de connexion iPSCs humains et exempt de sérum pour maintenir une condition de culture défini et d&#39;éviter une étape supplémentaire pour l&#39;élimination des cellules nourricières embryonnaires de souris (MEF) avant le début de la différenciation. Le nombre de passage optimal pour l&#39;homme iPSCs pour démarrer les plages de différenciation de passage 15 lors de la reprogrammation de passage 70 au total. Lorsque repiquage, détacher colonies hiPSC en tant que cellules globale à l&#39;aide d&#39;une solution de détachement cellulaire appropriée avec une faible contrainte mécanique et d&#39;une pipette sérologique de 2 mL pour transférer les agrégats dans une nouvelle boîte. Évitez la dissociation des cellules individuelles, car cela pourrait induire la différenciation et l&#39;apoptose dans la plupart des lignes iPSC. Il a été rapporté que le long terme, une seule cellule repiquage pourrait augmenter les altérations génomiques dans CSPi humaine 19, 20. Évitez les procédures de détachement de cellules, qui nécessitent une étape de centrifugation pour éliminer la solution de détachement, car cela réduit la viabilité globale de CSPi. Testertoutes les cultures pour microbiennes, en particulier les contaminations mycoplasmes, sur une base régulière, car cela pourrait altérer la qualité des CSPi et leur capacité de différenciation. <ol><li> Enduire un plat de culture de tissu de 60 mm avec la matrice EHS selon les instructions du fabricant. </li><li> Décongeler une aliquote de 1 x 10 6 iPSCs humains. Ensemencer les iPSCs dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm revêtues dans une matrice EHS et contenant 5 ml de milieu A (voir le tableau des matériaux). Changer le support quotidien et passage après 5 à 7 jours lorsque les cellules atteignent ~ 80% de confluence. REMARQUE: Passage de la iPSCs à 80% de confluence décongelées en utilisant des méthodes standard, telles que le détachement sans enzyme de colonies 21, au moins une fois avant de commencer la différenciation. En bref, éliminer le milieu COPS, laver les cellules une fois avec préchauffé à 37 ° C modifié par Dulbecco milieu Eagle: mélange nutritif F12 (DMEM / F12), et laisser incuber les CSPi suivant le fabricantdes instructions en utilisant le réactif A (voir le tableau de matériaux). Ne pas dépasser le temps d&#39;incubation recommandé afin d&#39;éviter la dissociation des cellules individuelles. CSPi humaines doivent être détachés et flottants sous forme d&#39;agrégats, non pas comme des cellules individuelles. Ils peuvent ensuite être transférés vers de nouveaux plats enrobés de matrice EHS; par exemple, COPSi agrégats d&#39;un plat de 60 mm peut être distribué à 4 nouveaux plats de 60 mm. </li><li> Vérifier les mycoplasmes avec un kit de détection de mycoplasmes selon les instructions du fabricant. Utilisez uniquement CSPi sans mycoplasmes, comme mycoplasmes peut modifier la capacité de différenciation des CSPi. </li></ol></li><li> Dissociable iPSCs (80% de confluence) et préparer une suspension de cellules isolées à l&#39;aide de réactif B. <ol><li> Laver les iPSCs une fois avec préchauffé (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Ajouter le réactif préchauffé B (par exemple, 1 mL dans une boîte de 60 mm) et incuber les iPSCs pendant 5 min à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Flick 20 fois avec un doigt sur le côté et le bas dele plat à détacher les CSPi. Vérifiez que le détachement des cellules au microscope. </li><li> Pipeter la suspension cellulaire et dans le plat 5 fois avec une micropipette 1 ml. </li><li> Ajouter 3 ml de milieu A pour diluer 1 ml de réactif B et récupérer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 15 ml. </li><li> tourner doucement les iPSCs (500 xg) pendant 4 min à température ambiante. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu B et compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre. REMARQUE: Sachez que l&#39;utilisation moyenne B pour la remise en suspension. Éviter d&#39;utiliser le milieu A, car il contient une concentration trop élevée de bFGF, ce qui pourrait inhiber la différenciation. </li></ol></li><li> Diluer la suspension de cellules à 4,5 x 10 5 cellules par ml dans du milieu B supplémenté avec 10 pM de protéine kinase associée à rho-inhibiteur (Y-27632). </li><li> Ajouter 100 ul par puits dans un non-adhérent, v-fond, la plaque à 96 puits. REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont également distribuées dans le SUSpension en secouant le tube à chaque fois avant de retirer des portions de 100 ul. Il est important que chaque puits contienne un nombre équivalent de cellules afin d&#39;obtenir des neurosphères homogènes en taille et en forme (ronde, des surfaces définies). </li><li> Tourner doucement la plaque avec les cellules à 500 xg et à température ambiante pendant 3 minutes et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Changer le support quotidien en enlevant 50 pi et en ajoutant 50 pi de milieu frais B dans chaque puits pour les 5 prochains jours. </li></ol></li></ol> 2. Embedding Neurosphères dans Matrix EHS (4 jours) <ol><li> Préparer milieu neurosphères en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 sans (p / o) la vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM d&#39;acides aminés non essentiels (MEM), 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d&#39;insuline et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol. </li><li> Recueillir l&#39;esprit neurosphèresha 200 ul micropipette utilisant un ~ 2 mm pointe préalablement coupé avec des ciseaux stériles. </li><li> Placer les neurosphères environ 5 mm de distance les uns des autres sur un film de paraffine (3 x 3 cm 2) dans un récipient vide de 100 mm et enlever soigneusement autant du milieu restant possible. </li><li> Ajouter une goutte (7 pi) de la matrice EHS sur chaque neurosphères unique. </li><li> Incuber la matrice EHS gouttes avec les neurosphères pendant 15 min dans un incubateur. </li><li> Laver les neurosphères soigneusement du film de paraffine par les bouffées de chaleur avec le milieu Neurosphère. Pour rincer, utiliser une micropipette de 1 ml et une nouvelle boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de milieu neurosphères. </li><li> Incuber les neurosphères pour les 4 prochains jours et ajouter 2 ml de milieu frais Neurosphère le jour 2. REMARQUE: Assurez-vous que les étagères dans l&#39;incubateur sont à plat afin que les neurosphères de matrice intégrée EHS ne s&#39;agglutiner d&#39;un côté du plat. </li></ol> 3. organites dans une suspension RotaryCulture (14 Jours) <ol><li> Préparer cerveau moyen organoïde en mélangeant ce qui suit: mélange 1: 1 de DMEM / F12 et le milieu C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplément 1, 1: 100 (v / v) Supplément 2 w / o La vitamine A, 1: 100 L-glutamine, 0,05 mM de MEM, 100 U / mL de pénicilline, 100 ug / mL de streptomycine, 1,6 g / L d&#39;insuline, 0,5 pM dorsomorphin, 5 uM SB431542, et 0,05 mM de β-mercaptoéthanol. </li><li> Ajouter 100 ml de cerveau organoide moyenne à chaque flacon à rotation par ses bras latéraux et les placer dans un incubateur pour préchauffage pendant au moins 20 min. </li><li> Mettre en place un programme d&#39;agitation à 25 tours par minute, selon les instructions du fabricant. NOTE: Avant de transférer les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons spinner, assurez-vous qu&#39;ils sont tous séparés. Si deux ou plus sont connectés à travers la matrice EHS, les séparer par découpage de la matrice de liaison avec un scalpel. </li><li> Transférer délicatement les neurosphères de matrice intégrée EHS dans des flacons contenant spinner 100 ml de milieu organoide nousune pipette sérologique ing 2 ml. Utiliser les bras latéraux de la fiole centrifuge pour transférer les neurosphères dans le ballon. </li><li> Placer les flacons rotatifs sur une plate - forme d&#39;agitation magnétique dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2; c&#39;est le jour 0 de la culture organoide. </li><li> Changer le support une fois par semaine (ou plus souvent quand il y a un changement de couleur) en supprimant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais. REMARQUE: Lorsque vous prenez les flacons spinner de l&#39;incubateur, attendez 3-5 minutes pour laisser les organites couler au fond du flacon. Éliminer le milieu en plaçant la pointe de pipette en verre (relié à une pompe) sur la surface du liquide; aspirer le milieu avec précaution à travers une ouverture latérale / bras du ballon. Ces manipulations doivent être effectuées sous la hotte laminaire. </li></ol> 4. Analyse du cerveau organites <ol><li> Fixation des organites <ol><li> Recueillir les organites au jour 14 de la culture de flacon spinner with une réduction de 1 ml micropipette (cut ~ 5 mm). Mettez tous dans un plat de 60 mm et les laver une fois avec 5 ml de DMEM / F12 chaud pendant 3 min. </li><li> Préparer un tube de 1,5 ml avec 500 ul de chaleur paraformaldehyde à 4% (PFA). Attention: Porter une protection peau et les yeux et le travail sous une hotte de sécurité lors de la manipulation PFA fixatif. </li><li> Placez chaque organoide séparément dans chaque tube et les fixer pendant au moins 30 min à température ambiante. Ne pas fixer les organites pendant plus de 60 min. Pour déplacer les organites, utilisez une boucle d&#39;inoculation ou tout autre legs qui est pratique. </li><li> Retirer le PFA et laver les organites fixes deux fois pendant 10 min chacune avec 1 ml de PBS. </li><li> Stocker les organites dans 1 ml de PBS à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 7 jours, jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Intégrer les organites pour cryosectioning <ol><li> Retirez le PBS et ajouter 1 ml de saccharose à 30% dans une solution d&#39;eau distillée par tube pour déshydrater les organites avant de les cryofreezing; après avoir ajouté sucrosolution soi, les organites doit être flottant à la surface. Stocker les organites pendant une nuit dans une solution de saccharose à 4 ° C; le lendemain, les organites auraient dû sombré au fond du tube. REMARQUE: Les organites peuvent être conservés jusqu&#39;à 3-5 jours à 4 ° C en solution de saccharose, le cas échéant. </li><li> Remplir un moule de spécimen de vinyle avec 400 pi de composé de température de coupe optimale (OCT) et en utilisant une boucle d&#39;inoculation pour placer une organoïde au centre du moule. Étiqueter le bord du moule avec le nom de l&#39;échantillon. </li><li> Congeler le moule organoïde contenant à -80 ° C jusqu&#39;à ce que cryosectioning. </li><li> Manteau cryoslides de verre avec 0,1% de poly-L-lysine solution (PLL) dans du PBS pendant 5 min à température ambiante et laisser les lames sécher pendant 3 h. Conserver les lames à 4 ° C et les réchauffer au tempérée ambiante avant utilisation. REMARQUE: PLL revêtement est une étape importante, car elle empêche les tranches organoïdes de flotter loin. Collecter et stocker une solution PLL à 4 ° C pendant jusqu&#39;à 3mois. Avant de réutiliser, filtrer avec une seringue de 0,22 um et laisser réchauffer à la température ambiante. </li><li> Section cryofrozen organites dans des tranches 20-50 pm d&#39;épaisseur sur verre revêtu PLL-cryoslides 22. Laissez les lames avec les sections sécher pendant 1 h à température ambiante. Stocker les sections à -80 ° C jusqu&#39;à traitement ultérieur. </li></ol></li></ol> 5. immunofluorescente des sections organoide Staining NOTE: Pour la caractérisation générale des organites, coloration avec nestine, un marqueur progénitrices neurales et TUJ1, un marqueur pan-neuronale, il est recommandé. A titre d&#39;exemples supplémentaires, une coloration immunofluorescente avec phospho-vimentine (p-VIM), qui marque mitotiques apicales des cellules gliales radiales, et Arl13b, pour cil, sont décrits. Pour tester l&#39;apoptose, utilisez le test terminal désoxynucléotidyle transférase (TdT) dUTP Nick-End étiquetage (TUNEL). Placer les lames dans une boîte en plastique pendant les incubations pour les protéger de la poussière, la lumière,et sécher. <ol><li> Décongeler les diapositives pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Laver les lames deux fois avec 200 pl de PBS-glycine (0,225 g de glycine dans du PBS) pendant 3 min pour étancher l&#39;autofluorescence induite par PFA. </li><li> Perméabiliser les sections avec 200 ul de 0,5% de Triton X100 / 0,1% de Tween dans une solution de PBS pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les deux fois avec 200 ul de solution PBS-glycine pendant 3 min. </li><li> les incuber avec 200 ul de 0,5% de gélatine de poisson / 0,1% de Triton X100 dans du PBS pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C pour bloquer la liaison non spécifique d&#39;antigène. NOTE: Si un test TUNEL est nécessaire, effectuer l&#39;essai selon le protocole du fabricant. Commencez par le dosage TUNEL avant d&#39;effectuer la immunomarquage, car elle pourrait interférer avec des anticorps secondaires et étancher fluorophores quand il est utilisé par la suite. </li><li> Diluer les anticorps dans une solution de blocage aux concentrations suivantes: nestine, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TUJ1, 1: 200;Arl13b, 01h20; et des anticorps secondaires, 1: 1.000. </li><li> Incuber avec 200 ul du premier anticorps primaire (par exemple, la nestine) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage. </li><li> Diluer le premier anticorps secondaire (anti-souris 488) 1: 1000 dans une solution de blocage et incuber la lame dans 200 ul pendant 1-2 h à température ambiante. Désormais, protéger toujours les diapositives de la lumière. </li><li> Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage. </li><li> Incuber avec 200 ul de la prochaine anticorps primaire (par exemple, TUJ1) pendant 1-2 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver 3 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage. </li><li> Ajouter 200 ul de l&#39;anticorps secondaire suivant (anti-lapin 647) pendant 1-2 h à la température ambiante. </li><li> Laver 3 x 3 min. avec 200 pi de solution de blocage. </li><li> Ajouter 200 ul de 4&#39; , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une 30 nM Concntration dans du PBS pendant 15 min à température ambiante pour la coloration nucléaire. </li><li> Laver 2 x 3 min avec 200 pi de solution de blocage. </li><li> Laver 1 x 1 min avec 200 pi d&#39;eau distillée et laisser les sections sécher pendant 10-20 min, jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune goutte d&#39;eau évidente est plus visible. </li><li> Monter les sections avec un milieu d&#39;inclusion. les conserver à l&#39;abri de la lumière à 4 ° C pendant plusieurs semaines. </li><li> Procéder à une analyse microscopique de l&#39;image d&#39;une vue d&#39;ensemble de la zone organoïde, ventriculaire, la plaque corticale primitive, et d&#39;autres zones d&#39;intérêt. </li><li> Utiliser un microscope confocal avec les filtres objectifs et fluorescents huile 63X, choisi en fonction des anticorps secondaires marqués par un colorant fluorescents utilisés 1, 10. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

MCPH est un trouble neurodéveloppemental complexe humain qui ne peut être récapitulé dans des modèles animaux in vivo ou dans un langage simple culture de cellules humaines approche in vitro. La manifestation clinique de MCPH commence à apparaître au cours du premier trimestre, lorsque la neurogenèse précoce commence. Ainsi, organites du cerveau 3D représentent un système expérimental fiable pour modéliser le développement MCPH. De plus, 3D organites du cerveau humain sont une approche idéale car i) il...

troubles neurodéveloppementaux humains, tels que microcéphalie, ne peuvent être mal étudiés dans des modèles animaux en raison du fait que les cerveaux humains ont une surface corticale étendue, une caractéristique unique différent des animaux non humains. Cet aspect rend le développement du cerveau humain un processus complexe qui ne peut pas être suffisamment étudié dans une 2D, système in vitro de culture cellulaire. Nouvelles techniques de culture 3D permettent la génération d&#39;organites analogue à un tissu à partir de cellules souches pluripotentes induites (CISP). La différenciation des cellules souches pluripotentes dans une culture en suspension 3D in vitro permet la formation de différents types de cellules en temps opportun et spécifique à la région, ce qui donne lieu à une organisation, d&#39;un tissu stratifié 1, 2, 3. Merci aux laboratoires qui furent les pionniers des technologies de culture 3D et démystifié la complexité de la formation d&#39;organes, à partir de cellules souches,nous avons développé une méthode robuste de générer organites du cerveau pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et de modéliser microcéphalie in vitro 1, 2, 3. Il est à noter que nous avons adapté la méthode originale développée par Lancaster et al. pour générer des organites cérébraux 1. Cette méthode a été modifiée en fonction de nos exigences expérimentales. Le but d&#39;une étude de Gabriel et al. était d&#39;analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l&#39;entretien des cellules souches neurales au cours du développement du cerveau. Pour ce faire, une étude mécaniste a été réalisée en analysant les cellules progénitrices neurales (PNJ) dans organites du cerveau 3D provenant d&#39;un patient microcéphalie 4. Ce patient effectue une mutation dans CPAP, une protéine centrosomale conservée nécessaire pour biogenèse centrosome 5. Une hypo largement acceptéethèse est que microcephaly est le résultat d&#39;une diminution de la piscine de l&#39; APN, et cela peut être dû soit à la mort cellulaire ou de différenciation précoce 1, 6, 7, 8, 9. En analysant les zones ventriculaires (VZS) de organites du cerveau microcéphalie, il a été montré qu&#39;un nombre important de PNJ subissent une division cellulaire asymétrique, contrairement organites du cerveau provenant d&#39;un donneur sain 4. De nombreuses analyses microscopiques et biochimiques des organites du cerveau microcéphalie ont révélé un rôle inattendu pour la PPC dans le démontage de 4 cil en temps opportun. Plus précisément, CPAP mutée est associée à un démontage de cil retardé et le cycle cellulaire retardée ré-entrée, ce qui conduit à la différenciation prématurée des NPC 4. Ces résultats suggèrent un rôle dans microcéphalie et cilia eimplication EIR lors du contrôle de la neurogenèse et la taille du cerveau 10. La première partie de ce protocole est une description d&#39;un procédé en trois étapes pour générer des organites homogènes du cerveau. Comme mentionné précédemment, le protocole de Lancaster original a été adapté et modifié en fonction de notre objectif 1. Tout d&#39;abord, iPSCs humains sont cultivées dans un état opérationnel sans matrice définie sur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Cette étape permet d&#39;éviter les variations des cultures de cellules souches pluripotentes dépendant de l&#39;alimentation. Dans ce protocole, l&#39;induction de la différenciation de neurones pour former un épithélium neural commence directement à partir de iPSCs. En sautant l&#39;étape de formation corps embryoïdes (EB), le produit de différenciation de neurones, d&#39;une manière plus contrôlée et dirigée. Cette approche limite la formation spontanée et non orienté d&#39;autres couches de cellules germinales, tels que le mésoderme et l&#39;endoderme. En appliquant ce protocole, neurosphères contenant des rosettes de neurones peuvent être récoltées au jour 5 pour EHS enrobage de matrice et une culture en suspension stationnaire. Le milieu organoïde utilisé pour la troisième étape de notre protocole est complété par dorsomorphin et SB431542. Dorsomorphin est un inhibiteur de petite molécule de protéine morphogénique osseuse (BMP), et SB431542 inhibe la TGFß / activine / voie de signalisation nodal. La combinaison de ces facteurs pourrait favoriser la différenciation neuronale plus efficace que l&#39; acide rétinoïque seul 11, 12, 13, 14. Au total, ces modifications permettent la génération reproductible de organites du cerveau, avec des variations minimes à travers organites. Fait important, cette méthode a été appliquée pour générer des organites robuste du cerveau microcéphales de iPSCs patients qui portent des mutations dans des gènes qui affectent centrosomes et de la dynamique du cycle cellulaire. La seconde partie de ce protocole donne des instructions pour préparer brain organites pour l&#39;analyse et l&#39;interprétation des défauts cellulaires dans microcéphalie. Cela comprend la fixation, cryosectioning, immunofluorescence et analyse microscopique confocale. Ce protocole fournira au lecteur une description détaillée des résultats attendus et des conseils d&#39;interprétation.

<table><tbody><tr><td>Anti-souris 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-lapin 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B anticorps polyclonal de lapin&nbsp ;</td></tr><tr><td>Système CELLSPIN</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dichlorhydrate ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, États-Unis</td><td>31331093</td><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium : Mélange de nutriments F-12&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dorsomorphine</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Milieu d’enrobage</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol ; milieu d’enrobage ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel matrice qualifiée hESC ; important : qualifié hESC</td></tr><tr><td>Gélatine de poisson&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gélatine provenant de peau de poisson d’eau froide ; plusieurs fournisseurs ; autoclave après ajout au PBS pour dissoudre et stériliser, stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine pour la biologie moléculaire ; fournisseurs multiples&nbsp ;</td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation avec aiguille, jetable (1 & micro ; L)</td> <td>Sigma Aldrich, États-Unis</td><td>BR452201-1000EA</td><td>plusieurs fournisseurs&nbsp ;</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM) ; milieu de différenciation neurale</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Kit de détection de mycoplasmes ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal anticorps (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4 % en PBS, solution de magasin à -20 &deg ; C; Attention : Portez une protection cutanée et oculaire et travaillez sous la cagoule</td></tr><tr><td>PBS</td><td>comprimés Gibco, US</td><td>18912014</td><td>Voir le fabricant&acute ; ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, États-Unis</td><td>15140122</td><td>Plusieurs fournisseurs Solution</td></tr> de <tr><td>poly-L-lysine (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentine (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&nbsp ;</td><td>Technologies des cellules souches</td><td># 05872</td><td>Note relative au Protocole 1.1.1.2 ; ReLSR (réactif de sélection et de passage des cellules ES et iPS humaines sans enzymes) ; Veuillez suivre manufactorer&acute ; ; produits alternatifs de plusieurs fournisseurs disponibles</td></tr><tr><td>Réactif B&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>La solution d’accutase est une solution enzymatique pour la dissociation de cellules uniques ; plusieurs fournisseurs ; protocole 1.1.2 « solution de dissociation de cellules enzymatiques » &nbsp ;</td></tr><tr><td>Recherche Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S Fournisseurs</td><td>multiples</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>Fournisseurs multiples Fiole tournante 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus lames de microscope Thermo</td><td>scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Les lames doivent être étiquetées avec un « + » et chargées positivement</td></tr><tr><td>Supplément 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplément (100x)</td></tr><tr><td>Supplément 2 sans vitamine A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>supplément B-27 (50x), moins la vitamine A ; plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td> Plusieurs <td>fournisseurs</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&beta ;-Tubulin III (polyclonal de lapin)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Système fluorométrique TUNEL</td></tr> ; plusieurs fournisseurs <tr><td>Tween 20 pour la biologie moléculaire</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Plusieurs fournisseurs</td></tr><tr><td>de feuille imperméable</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm " M&rdquo;; fournisseurs multiples</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp ;</td><td>Selleckchem.com</td> inhibiteur de ROCK <td>S1049</td><td>(Y-27632 2HCL) ;</td></tr> <tr><td>plusieurs fournisseurs & bêta-mercaptoéthanol</td><td>Gibco, États-Unis</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoéthanol (50 mM) ; plusieurs fournisseurs</td></tr></tbody></table>

génération de ipsc dérivés du cerveau humain organites au modèle des troubles du développement neurologique précoce

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

La disponibilité limitée de modèles in vitro appropriés capables de représenter de manière fiable le développement complexe du cerveau humain est un goulot d’étranglement important qui limite la traduction de la recherche fondamentale sur le cerveau en application clinique. Alors que les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) ont remplacé les cellules souches embryonnaires humaines éthiquement discutables, les études de différenciation neuronale basées sur les iPSC restent descriptives au niveau cellulaire mais ne parviennent pas à fournir de manière adéquate les détails qui pourraient être dérivés d’un tissu cérébral humain complexe en 3D. 
Cette lacune est maintenant comblée par l’application d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC, « Brains in a dish », qui modélisent de nombreuses caractéristiques du développement complexe du cerveau humain. Ici, une méthode de génération d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC est décrite. Les organoïdes peuvent aider à modéliser la microcéphalie primaire autosomique récessive (MCPH), un trouble neurodéveloppemental humain rare. Une explication largement acceptée de la malformation cérébrale dans la MCPH est un épuisement du pool de cellules souches neurales au cours des premiers stades du développement du cerveau humain, un défaut de développement difficile à recréer ou à prouver in vitro. 
Pour étudier la MCPH, nous avons généré des iPSC à partir de fibroblastes dérivés de patients porteurs d’une mutation dans la protéine centrosomale CPAP. En analysant la zone ventriculaire d’organoïdes cérébraux 3D de microcéphalie, nous avons montré la différenciation prématurée des progéniteurs neuraux. Ces organoïdes cérébraux 3D sont un puissant système in vitro qui jouera un rôle déterminant dans la modélisation des troubles cérébraux congénitaux induits par des produits chimiques neurotoxiques, des infections virales neurotrophiques ou des mutations génétiques héréditaires.

La génération des organites du cerveau nécessite au moins trois semaines de culture en continu (Figure 1A). Pour obtenir des résultats reproductibles, nous recommandons que le chercheur documente toutes les étapes et, surtout, évite toute modification concernant les composants du milieu, des points de temps, et la manipulation des cellules. Nous donnons ici un résumé de la façon d&#39;évaluer si les étapes critiques sont atteints afin d&#39;obtenir organites de qualité s...

La modélisation du développement du cerveau humain a été entravée en raison de la complexité sans précédent du tissu épithélial neural. Ici, une méthode de génération robuste d’organoïdes cérébraux pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et modéliser la microcéphalie in vitro est décrite.

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

L'objectif général de ce protocole de génération d'organoides cérébraux humains dérivés de cellules iPS est de modéliser les troubles neurodéveloppementaux humains précoces. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement cérébral humain, telles que le rôle des synthésosomes et des cils dans la néonéogenèse et la microcéphalie primaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle constitue un modèle robuste et rapide permettant d'obtenir des résultats reproductibles à partir d'organoides cérébraux dérivés de cellules iPS de patients.La procédure sera démontrée par Elke Gabriel, une post-doctorante de mon laboratoire au Centre de médecine moléculaire de Cologne. Pour commencer cette procédure, recueillir les neurosphères à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres munie d’une pointe de deux millimètres préalablement coupée avec des ciseaux stériles. Ensuite, déposer les neurosphères à environ cinq millimètres d’intervalle sur un film de paraffine dans une boîte de 100 millilitres.Et retirez soigneusement autant que possible du milieu restant. Ensuite, ajoutez une goutte de matrice EHS sur chaque neurosphère individuelle. Incubez les gouttes de matrice EHS avec les neurosphères pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, lavez soigneusement les neurosphères du film de paraffine en les rinçant avec le milieu de neurosphères. Incubez ensuite les neurosphères pendant les quatre jours suivants et ajoutez deux millimètres de milieu de neurosphères frais au jour deux. Dans cette procédure, ajoutez 100 millilitres de milieu d'organoides cérébraux à chaque flacon agité par ses bras latéraux.Et préchauffez le milieu dans l'incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, assurez-vous que les neurosphères sont toutes séparées. Si deux ou plusieurs sont reliées par la matrice EHS, séparez-les en coupant la matrice de connexion avec un scalpel.Configurer un programme d'agitation à 25 tr/min. Transférer soigneusement les neurosphères incluses dans la matrice EHS dans les flacons agitateurs contenant 100 millilitres de milieu d'organoides. Ensuite, disposer les flacons agitateurs sur une plateforme d'agitation magnétique dans l'incubateur pendant 14 jours à 37 degrés Celsius.Ceci est le jour zéro de la culture d'organoïdes. Changer le milieu une fois par semaine en retirant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais. À cette étape, récupérer les organoïdes de la culture en flacon agité au jour 14 à l'aide d'une micropipette pré-coupée de un millilitre.Placez-les tous dans une boîte de 60 millimètres et rincez-les une fois avec cinq millilitres de DMEM F12 chaud pendant trois minutes. Ensuite, préparez un tube de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PFA à 4 %, chaud. Placez chaque organoïde séparément dans chaque tube et fixez-les pendant 30 à 60 minutes à température ambiante.Ensuite, utilisez un anneau d'inoculation pour prélever les organoïdes. Puis, éliminez le PFA et lavez les organoïdes fixés deux fois pendant 10 minutes chacune avec un millilitre de PBS. Par la suite, conservez les organoïdes dans un millilitre de PBS à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à 7 jours pour une utilisation ultérieure.Pour inclure les organoïdes en vue d'une cryocoupe, retirez le PBS et ajoutez 1 millilitre de solution de saccharose à 30 % dans chaque tube afin de déshydrater les organoïdes avant leur congélation cryogénique. Après l'ajout de la solution de saccharose, les organoïdes doivent flotter à la surface. Conservez les organoïdes toute la nuit dans la solution de saccharose à quatre degrés Celsius.Le lendemain, les organoïdes devraient avoir coulé au fond du tube. Ensuite, remplissez un moule à échantillons en vinyle avec 400 millilitres de composé OCT. Utilisez ensuite une boucle d'ensemencement pour placer un organoïde au centre du moule.Étiqueter le rebord du moule avec le nom de l'échantillon. Ensuite, congeler le moule contenant les organoïdes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à la cryoséctionnement. Par la suite, recouvrir les lames cryogéniques de PLL à 0,1 % dans du PBS pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, laissez sécher les lames pendant trois heures. Conservez les lames à quatre degrés Celsius et réchauffez-les à température ambiante avant utilisation. Par la suite, sectionnez les organoïdes congelés en tranches de 20 à 50 micromètres d'épaisseur sur les lames cryogéniques en verre revêtues de PLL.Laisser sécher les coupes pendant une heure à température ambiante et conserver les coupes à moins 80 degrés Celsius jusqu'à un traitement ultérieur. Imagerie en immunofluorescence d'organoïdes cryocoupés affichant une zone ventriculaire typique et une plaque corticale primitive. La zone ventriculaire s'étend du côté apical au côté basal.Remarquez que les cellules situées dans la zone ventriculaire présentent des noyaux disposés en palissade, ce qui suggère qu'il s'agit de cellules gliales radiaires. Le panneau droit montre la coloration immunofluorescente de cellules progénitrices neuronales positives pour nestine situées dans la zone ventriculaire, ainsi que de neurones positifs pour TUJ1 dans la plaque corticale primitive. Deux exemples de zones ventriculaires colorées avec PVIM et ARL 13B sont présentés ici.Les régions marquées par des carrés blancs sont agrandies. Les cellules gliales radiaires apicales se divisant du côté apical de la zone ventriculaire sont positives pour PVIM. Le plan de division d'une cellule en anaphase est horizontal par rapport à la ligne de surface du lumen, marquée par la coloration ARL 13B.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 23 jours si elle est correctement exécutée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer des contrôles de qualité périodiques ainsi que des contrôles de microplasma sur les cultures. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du développement en neurobiologie pour explorer les mécanismes du développement neuronal dans les organoïdes cérébraux humains.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des organoïdes cérébraux humains à partir de diverses lignées cellulaires de cellules souches pluripotentes induites, y compris des lignées cellulaires de patients présentant des fonctions cellulaires altérées.

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Developmental Biology

Biologie du développement

La vidéo montre une méthode de génération d’organoïdes cérébraux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites. Il montre comment la neurosphère forme une couche neuroectodermique, qui supprime la formation d’autres couches germinales. Les neurosphères sont intégrées dans une matrice de gel 3D et forment des bourgeons neuroépithéliaux. Lorsqu’ils sont incubés avec des organes organoïdes, ces bourgeons neuroépithéliaux se différencient en régions cérébrales spécifiques, ce qui...

Une méthode in vitro pour générer des organoïdes cérébraux humains

Cette vidéo montre un test permettant de générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les iPSC humaines sont amenées à former des corps embryoïdes (EB). Les EB sont cultivés sur un échafaudage polymère à l’aide d’un milieu d’induction, favorisant la différenciation en cellules souches neurales, cellules progénitrices et neurones immatures. Enfin, les EB sont intégrés dans une matrice et transférés dans un milieu d’entretien pour la formation...

Génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Organoïdes cérébrales représentent un nouveau système modèle pour étudier au début cerveau humain développement in vitro. Cet article présente la méthodologie détaillée pour générer efficacement homogène du prosencéphale dorsale de type organoïdes à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites notamment les étapes cruciales de caractérisation et validation.

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.

Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSI). Pour obtenir des organoïdes cérébraux en grande quantité et de haute qualité, nous utilisons des mini-bioréacteurs faits maison.

Génération d’organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites dans des mini-bioréacteurs faits maison

Dans cette étude, nous fournissons une technique détaillée pour un système de culture organoïde corticale simple mais robuste utilisant des cultures hPSC standard sans mangeoire. Il s’agit d’un protocole rapide, efficace et reproductible pour générer des organoïdes qui modélisent les aspects de la sénescence cérébrale in vitro.

Génération robuste et hautement reproductible d’organoïdes cérébraux corticaux pour la modélisation de la sénescence neuronale cérébrale in vitro

Nous présentons un protocole pour générer un organoïde cérébral humain avec une microglie résidente en incorporant des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans le développement d’organoïdes.

Dérivation d’un organoïde du cerveau humain avec développement de la microglie

Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.

Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

Découvrez la génération d'organoides cérébraux dérivés d'iPSC pour modéliser les troubles neurodéveloppementaux précoces comme la microcéphalie. Cette méthode robuste offre des résultats reproductibles pour étudier la neurogenèse.

Génération de iPSC dérivés du cerveau humain organites au Modèle des troubles du développement neurologique précoce

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