Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser des méthodes de culture cellulaire tridimensionnelle contrôlée en stimulation électrique pour favoriser la maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, notamment comment différents paramètres de stimulation électrique ou la durée affectent la fonction des cellules cardiaques et l’état de maturation. Le résultat final est des tissus cardiaques humains modifiés de maturité améliorée.

Les implications de cette technique s’étendent aux applications de diagnostic telles que les tests de sécurité et d’efficacité de nouveaux médicaments, car les cardiomyocytes présentant des caractéristiques matures telles que le progrès électrique sont les plus susceptibles de servir de modèles plus précis de cellules cardiaques humaines dans les études de dépistage de médicaments. Combinez le monomère PDMS et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 et mélangez bien. Laissez reposer pendant cinq minutes pour dégazer.

Chargez ensuite une boîte de Pétri contenant le maître pour le modèle de biofil avec le mélange PDMS. Essayez de minimiser la formation de bulles d’air. Ensuite, durcissez le PDMS à 70 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, récupérez le moule solidifié en utilisant d’abord une lame tranchante sur les bords, puis en le décollant. Ensuite, coupez l’excédent de PDMS et rassemblez tous les gabarits dans une poche de stérilisation. Vapeur auto clave les modèles à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, chargez chaque modèle dans une boîte de Pétri stérile sous la ventilation d’une enceinte de biosécurité. Maintenant, pour chaque modèle, utilisez une pince à épiler pour monter un morceau de suture en soie 6.0 stérile dans la rainure couvrant tout le canal. Les modèles sont alors prêts pour l’ensemencement des cellules.

La suture servira de modèle pour la formation de constructions 3D qui s’alignent le long de l’axe de la suture, imitant la forme des fibres cardiaques. Pour chaque chambre, faites une paire de pièces rectangulaires en polycarbonate qui serviront de cadre à la chambre de stimulation électrique. Le long de la ligne médiane de chaque pièce, percez deux trous de trois millimètres de large, à deux centimètres l’un de l’autre.

Pour chaque chambre, préparez deux tiges de carbone de 1,5 centimètre de long. À environ 3 millimètres de l’extrémité de chaque tige, percez un trou d’un millimètre de large. Enfilez ensuite chaque trou avec un fil de platine et enroulez une extrémité du fil autour de la tige.

Ensuite, pour chaque chambre, insérez deux tiges entre deux pièces de polycarbonate formant un cadre. Versez ensuite environ deux millilitres de PDMS dans un puits d’une plaque à six puits et placez le cadre dans le puits avec du PDMS, en immergeant le bas des cadres. Faites durcir le PDMS à 70 degrés Celsius pendant deux heures afin qu’il sécurise le cadre.

Retirez ensuite la chambre terminée de la plaque avec le PDMS attaché. Pour tester le fonctionnement d’une chambre assemblée, connectez les fils de platine à une batterie et utilisez un voltmètre pour vérifier que l’électricité passe à travers les tiges. Transférez maintenant les chambres fonctionnelles dans une poche de stérilisation et utilisez 20 minutes de stérilisation à la vapeur à 121 degrés Celsius pour les préparer à la culture cellulaire.

Pour préparer le gel, prérefroidissez tous les composants du gel sur de la glace avant de les mélanger dans un tube stérile. Assurez-vous d’ajouter le collagène et la matrice extracellulaire en dernier et de mélanger les composants à l’aide du pipetage. Car les cellules ont des cardiomyocytes différenciés des cellules souches pluripotentes humaines.

Collectez les cellules et pour chaque plante de préparation de biofils, préparez 3,5 microlitres de gel de collagène contenant un demi-million de cellules. Utilisez maintenant une pointe de pipette P10 pour charger environ quatre millilitres de suspension dans le modèle de canal de 0,5 centimètre de long de chaque plat. Ajustez la position de la suture à l’aide d’une pince stérile au besoin afin qu’elle soit complètement étirée.

Une fois les cellules ensemencées, assurez-vous de toujours remettre en suspension le mélange de cellules de gel avant de prendre l’autoclave afin d’avoir des résultats cohérents. Après avoir chargé les canaux, couvrez le fond du plat avec du PBS stérile en veillant à ne pas toucher le gel. Cela garantira que les biofils ne se déshydratent pas pendant la polymérisation.

Après avoir incubé les biofils à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, remplacez le PBS par suffisamment de milieu de culture pour couvrir les cellules. 12 millilitres suffisent généralement. Ensuite, cultivez le plat pendant une semaine en remplaçant le milieu tous les deux jours.

Dans une enceinte de sécurité biologique, ajoutez deux millilitres de PBS dans chaque puits d’une plaque à six puits qui abritera une chambre de stimulateur électrique. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler stérile, placez délicatement les dispositifs d’autoclave dans les puits. Une fois en place, jetez le PBS et remplacez-le par cinq millilitres de milieu chaud qui devraient couvrir complètement les tiges de carbone.

Avant de cultiver les cellules pendant 24 heures, observez la contractilité des cardiomyocytes en réponse à la stimulation électrique pour vous assurer que les cellules captent le stimulus électrique et répondent par des contractions. Ensuite, placez les biofils dans la chambre du stimulateur électrique et orientez les canaux perpendiculairement aux tiges de carbone. Étendez les fils de platine loin de la plaque, puis couvrez les plaques.

Connectez les fils à un stimulateur électrique. Réglez le stimulateur pour qu’il délivre des impulsions biphasiques d’une milliseconde à un hertz et à trois volts par centimètre. Transférez ensuite les préparations dans le stimulateur électrique dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Augmentez progressivement le taux de stimulation toutes les 24 heures, passant d’un hertz au jour zéro à six hertz au jour six. Pendant cette semaine de culture, changez de média tous les deux jours. Et observer la contractilité des cardiomyocytes au quotidien.

Après sept jours de préculture dans le biofil, les cellules ont remodelé le gel autour de la suture. Les cellules se sont assemblées le long de l’axe de la suture pour former un tissu cardiaque aligné. Les cellules exprimant des protéines contractiles cardiaques présentaient une bande sarcomérique dans l’appareil contractile et leurs myofibrilles étaient alignées le long de l’axe de la suture.

Les cellules du biofil présentaient des taux de prolifération plus faibles que les cellules des corps embryoïdes. La manipulation du calcium a été significativement améliorée dans les cardiomyocytes cultivés dans les biofils. Le traitement à la caféine a induit une libération brutale de calcium du réticulum sacroplasmique.

De tels transitoires n’ont été trouvés que dans les cellules stimulées. Il y avait également une fréquence de stimulation significativement plus élevée en fonction des amplitudes de libération de calcium. De plus, les cardiomyocytes cultivés dans des biofils ont montré une amélioration des densités de courant hERG et de courant redresseur vers l’intérieur par rapport à la culture dans des corps embryoïdes, qui a été encore renforcée par la stimulation électrique.

L’amélioration du courant redresseur vers l’intérieur était compatible avec une expression accrue du canal de rectification du potassium vers l’intérieur, jean, KCN J2. L’automaticité, c’est-à-dire la capacité de battre spontanément, était significativement plus élevée dans les cardiomyocytes dérivés du corps embryoïde par rapport aux biofils contrôlés. Le contrôle a montré une automaticité comparable à la préparation de biofils soumise au régime de six hertz. Une fois maîtrisé, la mise en place des biofils peut se faire en une demi-journée.

La mise en place de la stimulation électrique prendra quelques heures et les résultats finaux peuvent être obtenus en deux semaines. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les cardiomyocytes différenciés de différentes lignées cellulaires ou par différents protocoles peuvent varier légèrement dans leur maturité et leur pureté. Par conséquent, il peut être nécessaire d’optimiser les paramètres expérimentaux tels que le taux de stimulation de vos cellules.

À la suite de cette procédure, d’autres conditions, y compris la variation de la composition cellulaire et l’utilisation de cardiomyocytes mutants, peuvent être optimisées pour répondre à une foule de questions supplémentaires.