Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que le répertoire alpha et bêta des TCR d’une population spécifique d’antigène, ainsi que la fonctionnalité in vivo des TCR humains. Les principaux avantages de cette technique sont l’efficacité relativement élevée de la réaction PCR ainsi que sa compatibilité avec le clonage TCR ultérieur. Ce protocole utilise une PCR en deux étapes pour amplifier les chaînes alpha et bêta du TCR à partir d’une seule cellule sans connaissance préalable de la séquence TCR.

La première PCR est une réaction multiplex utilisant un pool d’amorces variables alpha ou bêta spécifiques à une région en conjonction avec une amorce spécifique de la région constante. La deuxième PCR est une réaction imbriquée qui amorce la séquence de l’adaptateur incorporée à l’extrémité cinq premiers du produit PCR ainsi qu’une séquence interne de régions constantes. Ces amorces intègrent également des sites de restriction uniques dans les cinq extrémités principales et les trois extrémités principales du produit PCR pour faciliter le clonage ultérieur.

Une fois clonée dans le vecteur modèle, la séquence TCR codée est chimérique, composée de régions variables humaines avec des régions constantes en miroir. La construction chimérique du TCR permet l’interaction entre le TCR et le complexe de signalisation CD3 en miroir, ce qui rend ce protocole de clonage TCR compatible avec des études fonctionnelles ultérieures dans des lignées cellulaires en miroir et dans des modèles de souris humanisées. Préparez-vous pour le tri unicellulaire en préparant les réactifs de transcription inverse dans une zone propre et sans matrice.

En général, les personnes qui ne connaissent pas la méthode de PCR sur cellule unique auront des difficultés en raison des faibles niveaux de modèle. D’autre part, la sensibilité de la PCR multiplex imbriquée est sensible aux faibles niveaux de contamination de la matrice. Par conséquent, il est nécessaire de nettoyer soigneusement les zones dans lesquelles vous allez mettre en place les réactions PCR.

Un mélange de trois amorces inverses spécifiques à la région constante des chaînes alpha et bêta est utilisé dans cette réaction. Préparez le master-mix de transcription inverse en combinant les réactifs dans un réservoir de pipetage. Pour tenir compte de l’erreur de pipetage, préparez suffisamment de mélange réactionnel pour dix puits supplémentaires.

À l’aide d’un multicanaux, pipeter six microlitres par puits dans une plaque de PCR de 96 puits. Couvrez l’assiette sans serrer avec un joint et maintenez l’assiette sur de la glace. Préparez les lymphocytes T pour le tri unicellulaire en colorant les cellules avec des anticorps contre les marqueurs de surface cellulaire.

Triez les lymphocytes T à la fois cellule par puits tout en laissant les douze rangées vides, qui serviront de contrôle négatif. Scellez la plaque avec un film adhésif et tournez-la à 1000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Exécutez immédiatement la réaction de transcription inverse.

Si possible, exécutez la première réaction PCR le jour même. Pour exécuter la réaction multiplex, mélangez séparément les mélanges maîtres PCR V alpha et V bêta dans des réservoirs de pipetage. Conservez la plaque avec l’ADNc sur de la glace ou sur un bloc froid.

Transférez 22,5 microlitres de réaction bêta TCR dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits. Ensuite, utilisez un multicanal pour transférer 2,5 microlitres d’ADNc dans la plaque PCR. À l’aide d’un multicanal, pipeter 22,5 microlitres de réaction TCR alpha directement dans la plaque contenant le reste de l’ADNc.

Scellez les plaques avec de l’adhésif, tournez doucement et tournez brièvement vers le bas. Exécutez la première réaction PCR. Les plaques peuvent être stockées à 20 degrés Celsius.

Le lendemain, préparez les deuxièmes réactions PCR imbriquées. À l’aide d’une pipette multicanaux, le mélange maître pour les réactions TCR alpha et TCR bêta à 22,5 microlitres par puits dans deux nouvelles plaques PCR à 96 puits. Ajouter le modèle de réaction PCR multiplex à 2,5 microlitres par puits.

Scellez les plaques, tourbillonnez doucement et tournez brièvement vers le bas. La première réaction PCR restante doit être scellée et stockée à 20 degrés Celsius pour servir de source de modèle de secours. Effectuez la deuxième réaction PCR.

Une fois la deuxième réaction de PCR imbriquée terminée, épuisez cinq microlitres de la réaction sur un gel d’agarose à 1 %. Incluez les puits de contrôle positif et négatif. La bande attendue doit avoir une taille d’environ 500 paires de bases.

Purifier le reste de la deuxième réaction, soit vingt microlitres, à l’aide d’un kit de purification PCR au format 96 puits et effectuer un séquençage de Sanger. Les séquences TCR obtenues peuvent être analysées à l’aide d’un logiciel immunogénétique disponible en ligne. Les informations de séquence peuvent être utilisées pour évaluer le répertoire et la clonalité de la population de lymphocytes T.

Les séquences alpha et bêta appariées du TCR peuvent être utilisées dans une analyse fonctionnelle plus approfondie. Effectuez des ligatures consécutives de TCR bêta et TCR alpha dans le vecteur modèle. Les modèles TCR bêta et TCR alpha sont remplacés par les chaînes amplifiées par PCR.

Lors de la première ligature, la matrice TCR bêta est remplacée par la chaîne bêta amplifiée par PCR. Une fois que l’insertion réussie de TCR bêta a été vérifiée par séquençage test-digest, remplacez la matrice TCR alpha par la chaîne alpha amplifiée par PCR. HEK293T cellules sont utilisées pour tester l’appariement réussi de la chaîne TCR et l’expression à la surface cellulaire.

HEK293T cellules sont co-transfectées avec le vecteur TCR marqué par le rapporteur fluorescent amétrine et un vecteur codant pour le complexe CD3 marqué par GFP. L’expression de surface du TCR chimérique est vérifiée par cytométrie en flux en colorant les cellules avec un anticorps CD3 anti-souris. Le niveau d’expression de CD3 de surface dans les cellules transfectées avec la construction TCR chimérique devrait être comparable à celles transfectées avec le vecteur modèle de contrôle entièrement miroir.

En résumé, nous avons décrit un protocole efficace basé sur la PCR pour l’identification et le clonage de chaînes TCR appariées à partir de cellules uniques. Nous prévoyons qu’il s’agira d’un outil précieux pour étudier les réponses des lymphocytes T humains dans l’auto-immunité, la surveillance des tumeurs et l’élimination des agents pathogènes. Le principal avantage du protocole PCR décrit ici est sa compatibilité avec les études in vitro et in vivo ultérieures.