Name: Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Apprenez l'isolement unicellulaire de TCR et la génération de vecteurs rétroviraux pour l'expression de TCRs humaines in vitro et in vivo. Cette méthode par PCR multiplexe et imbriquée permet d'analyser les répertoires TCR sans connaissance préalable des séquences.

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Cette étude a été financée par la FRDJ 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ et The Robert et Janice McNair Foundation.
Nous remercions Sandra Pena et Andrene McDonald pour le recrutement de patients, Samuel Blum pour l’assistance technique, le Dr George Makedonas pour le don d’anticorps et contrôle ADN utilisé pour l’optimisation de la PCR.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode efficace pour l’amplification de TCR unicellulaire et ultérieures sous clonage des chaînes appariées de TCR alpha et bêta dans un vecteur rétroviral expression de modèle. Bien que plusieurs protocoles PCR de cellule unique ont été développés, aucun jusqu'à présent ont été compatible avec immédiate sous clonage dans un vecteur d’expression. Dans la plupart des cas, une séquence partielle qui englobe les régions CDR3 très variables est amplifiée, avec assez de séquence d...

Le récepteur des cellules T (TCR) dicte décision sort des lymphocytes T au cours de développement, l’état stationnaire/homéostasie et une stimulation antigénique en périphérie1,2,3. Expansion récente des technologies de séquençage de profondeur a permis de découvrir une diversité TCR précédemment sous-estimé au sein de l’antigène des lymphocytes T spécifiques aux réponses. Diversité des TCR suggère un potentiel pour les lymphocytes T large point de vue fonctionnel. Afin d’intégrer l’analyse TCR répertoire des séquences avec des essais fonctionnels de TCR, les approches de séquençage devraient être conçus pour être compatible avec les systèmes expérimentaux et in vivo des modèles utilisés pour l’analyse fonctionnelle de select TCRs. Nous avons développé une approche efficace pour l’isolation de séquence humaine TCR et rationalisé sous clonage dans un vecteur de modèle des TCR de chimérique humain/souris compatible avec l’expression de TCR à souris humanisée HLA4. L’isolement des correspondants des chaînes alpha et bêta des hétérodimères TCRs nécessite l’amplification PCR des deux chaînes d’une seule cellule. Bien que plusieurs protocoles de clonage TCR unicellulaires ont été développés et utilisés, aucun jusqu'à présent ont été facilement compatible avec haut débit simplifiée clonage direct de TCRs Vα/Vβ inconnu dans des vecteurs rétrovirus nécessaires pour réexpression in vivo 4,5,6,7. Des études antérieures ont utilisé deux approches majeures, soit pour amplifier sélectivement une partie limitée du TCR suffit d’extrapoler la séquence, ou d’amplifier les TCR toute séquence4,5,6 , 7. analyse fonctionnelle en aval de TCR séquences obtenues par l’intermédiaire de la première approche exige la construction du TCR Assemblée et de novo coûteux en silico . Tandis que la seconde approche présente également la séquence complète de TCR, la région constante humaine n’est pas compatible avec in vivo l’expression des TCRs clonés dans des modèles murins. Notre approche est spécifiquement conçu pour être compatible avec in vivo analyse fonctionnelle des TCRs dans des modèles murins. Nous avons développé une cellule unique protocole PCR permettant directement sous clonage de fragments PCR dans le vecteur d’expression de modèle efficace et simplifiée.
Notre approche utilise une réaction de PCR de multiplex imbriqué très sensible qui s’effectue en deux étapes. Dans la première réaction de multiplexe étape une piscine de 40 amorces spécifiques pour toutes les chaînes de V-bêta et une piscine de 44 amorces spécifiques pour toutes les chaînes alpha-V sont utilisées pour amplifier la TCR-alpha ou bêta-TCR sans la connaissance préalable de la séquence (tableau 1). L’apprêt avant a une séquence de l’adaptateur, qui est incorporée dans la 5' du produit PCR. L’apprêt inverse est issu de la région constante du TCR. Nous avons identifié des sites de restriction uniques qui sont absents de la variable humaine ou jonction TCR régions et incorporés dans des amorces nouvellement redessinés de TCRα et TCRβ (Figure 1). Dans la deuxième réaction imbriquée, une amorce spécifique pour la séquence de l’adaptateur et une amorce inverse imbriquée au sein de la région constante sont utilisés pour amplifier encore les chaînes TCR avec une spécificité accrue (tableau 1, Figure 1). Après l’isolement de cellules du même, deux rondes de PCR (première réaction avec un pool d’amorces Vα tant Vβ et deuxièmement avec des amorces adaptateur) aboutir à un produit PCR qui peut être directement sous cloné dans le template vecteur rétroviral. La construction TCR finale doit pouvoir coder, dans un cadre de lecture seule (ORF), les régions variables humaines combinées avec les régions constantes souris reliées par la séquence protéique « Self clivage », P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. La séquence de P2A a été utilisée dans plusieurs systèmes et a été longuement testée spécifiquement pour l’expression de TCRs8,9,10,11. Bien que, après traduction la plupart de la P2A séquence reste attachée à l’extrémité C-terminale de la chaîne alpha, reliée par un flexible linker, tandis que la séquence de signaux de chaîne bêta a une proline supplémentaire, cette modification n’a aucun effet néfaste sur la fonction TCR. La région constante de la souris est utilisée dans la construction au lieu de l’homme pour éviter des interactions altérées avec des composants de signalisation en aval lors de ré-exprimé dans les cellules de souris. L’ORF unique entraînera stoechiométrique expression distincte d’alpha et bêta chaînes9,11. Le protocole actuel est issu des réactifs et des approches qui sont largement disponibles et est conçu pour être réalisées de manière simple et efficace. Bien que nous avons spécifiquement utilisé cette technique pour dosage de TCRs des cellules T autoréactives impliqués dans le diabète auto-immun, nous prévoyons que ce protocole peut être largement applicable pour l’identification et l’évaluation fonctionnelle des TCRs humaines spécifiques pour épitopes auto-immunes, cancer épitopes ou réponses aux pathogènes et aux vaccins.

<table><tbody><tr><td>CFSE&nbsp ;</td><td>eBioscience&nbsp ;</td><td>65-0850-84</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>anti-CD4 humain (OKT4) BV421</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>317433</td><td>2 mg/mL</td></tr> de <tr><td>CD3 anti-humain (OKT3) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>317336</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>d’anti-souris CD3 AF647</td><td>Biolegend&nbsp ;</td><td>100322</td><td>2,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Inhibiteur de l’ARNAse recombinante biotech grd 2,5KU&nbsp ; &nbsp ;</td><td>VWR</td><td>97068-158</td><td>0.7 U</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Kit RT ADNc à haute capacité&nbsp ;</td><td>Invirtogen&nbsp ;</td><td>4368814</td><td>9 U (enzyme RT)&nbsp ;</td></tr><tr><td>NF-H2O : Eau sans nucléase 1000mL</td><td>Invirtogen&nbsp ;</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Gotaq DNA polymérase 2500U</td><td>VWR</td><td>PAM3008</td><td>1 U</td></tr><tr><td>96 Puits Demi-Jupe Plaque PCR</td><td>Phénix</td><td>MPX-96M2</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Film Adhésif Transparent&nbsp ;</td><td>ThermoFisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>4306311</tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp ;</td><td>Invirtogen&nbsp ;</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>SnaBI</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>R0130</td><td>15 U (insert) 30 U (vecteur)</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>R0157</td><td>40 U (insert) 80 U (vecteur)</td></tr><tr><td>MfeI</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>R3589S</td><td>40 U (insert) 80 U (vecteur)</td></tr><tr><td>BstBI</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>R0519</td><td>40 U (insert) 80 U (vecteur)</td></tr><tr><td>Phosphatase intestinale du veau (CIP)</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>M0290S</td><td>10 U</td></tr><tr><td>Ligase rapide&nbsp ;</td><td>Biolabs de la Nouvelle-Angleterre&nbsp ;</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus minipreps systèmes de purification d’ADN&nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>A1460</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus midipreps systèmes de purification d’ADN²� ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>A7640</td><td></td></tr><tr><td>DNA clean & concentrator-25 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp ;</td><td>11-304C</td><td></td></tr><tr><td>ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit</td><td>Genesee Scientific&nbsp ;</td><td>11-306A</td><td></td></tr><tr><td>QIAkit rapide d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAkit de purification PCR rapide</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Efficacité de sous-clonage DH5a Cellules compétentes&nbsp ;</td><td>ThermoFisher&nbsp ;</td><td></td><td></td>18265017</tr><tr><td>Transit LT-1 Réactif 1mL (réactif de transfection)</td><td>Mirus&nbsp ;</td><td></td><td></td>MIR2300</tr><tr><td>BD FACS Aria II (trieur)</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Fortessa (cytomètre en flux)</td><td>BD&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rationalisé unicellulaire tcr isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour in vitro et in vivo expression de tcrs humaines

Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs

Bien que plusieurs méthodes de séquençage d’appariés T cell receptor (TCR) alpha et bêta chaînes de cellules T ont été développés, aucun jusqu'à présent ont été propices à l’aval en vivo analyse fonctionnelle des hétérodimères TCR. Nous avons développé un protocole amélioré basé sur une PCR en deux étapes de multiplex imbriquées, qui se traduit par un produit PCR qui s’étend sur les régions variables entières d’une chaînes humaines TCR alpha et bêta. Par identification des sites de restriction uniques et leur intégration dans les amorces PCR, nous avons fait le produit PCR compatible avec direct sous clonage dans le vecteur rétroviral de modèle. La construction rétrovirale qui en résulte encode une chimérique humain/souris TCR avec un domaine intracellulaire de la souris, qui est fonctionnel dans les cellules de souris ou de modèles de souris in vivo . Dans l’ensemble, le protocole décrit ici combine humaine seule cellule jumelé TCR alpha et bêta chaîne identification avec génération simplifiée des vecteurs rétroviraux aisément adaptables pour l’expression de TCR in vitro et in vivo . La vidéo et le matériel qui l’accompagne sont conçus pour donner une description très détaillée de la cellule unique PCR, afin que les étapes critiques puissent être suivies et potentiels pièges évités. En outre, nous fournir une description détaillée des étapes nécessaires pour générer le vecteur d’expression clonage. Une fois maîtrisé, tout le processus depuis la seule cellule de tri à l’expression de TCR peut être effectué dans un délai de deux semaines.

L’efficacité de la réaction de PCR multiplex imbriqué est activée à l’étape 3.2.7 (Figure 2) en exécutant sur 5 µl de la seconde réaction sur gel d’agarose. L’efficacité de l’amplification de la TCR-bêta en moyenne devrait se situer autour de 80 %, tandis que l’efficacité de la réaction de TCR-alpha est généralement plus bas, aux alentours de 50 %4. Seulement paires chaînes TCR-alpha et bêta-TCR peuvent être utilisés pour l’expression ...

Le cours combine protocole unicellulaire jumelé humain séquençage de TCR alpha et bêta de chaîne avec simplifié génération des vecteurs rétroviraux compatibles avec l’expression de TCR in vitro et in vivo .

Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines

Although, several methods for sequencing of paired T cell receptor (TCR) alpha and beta chains from single T cells have been developed, none so far have ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que le répertoire alpha et bêta des TCR d’une population spécifique d’antigène, ainsi que la fonctionnalité in vivo des TCR humains. Les principaux avantages de cette technique sont l’efficacité relativement élevée de la réaction PCR ainsi que sa compatibilité avec le clonage TCR ultérieur. Ce protocole utilise une PCR en deux étapes pour amplifier les chaînes alpha et bêta du TCR à partir d’une seule cellule sans connaissance préalable de la séquence TCR.La première PCR est une réaction multiplex utilisant un pool d’amorces variables alpha ou bêta spécifiques à une région en conjonction avec une amorce spécifique de la région constante. La deuxième PCR est une réaction imbriquée qui amorce la séquence de l’adaptateur incorporée à l’extrémité cinq premiers du produit PCR ainsi qu’une séquence interne de régions constantes. Ces amorces intègrent également des sites de restriction uniques dans les cinq extrémités principales et les trois extrémités principales du produit PCR pour faciliter le clonage ultérieur.Une fois clonée dans le vecteur modèle, la séquence TCR codée est chimérique, composée de régions variables humaines avec des régions constantes en miroir. La construction chimérique du TCR permet l’interaction entre le TCR et le complexe de signalisation CD3 en miroir, ce qui rend ce protocole de clonage TCR compatible avec des études fonctionnelles ultérieures dans des lignées cellulaires en miroir et dans des modèles de souris humanisées. Préparez-vous pour le tri unicellulaire en préparant les réactifs de transcription inverse dans une zone propre et sans matrice.En général, les personnes qui ne connaissent pas la méthode de PCR sur cellule unique auront des difficultés en raison des faibles niveaux de modèle. D’autre part, la sensibilité de la PCR multiplex imbriquée est sensible aux faibles niveaux de contamination de la matrice. Par conséquent, il est nécessaire de nettoyer soigneusement les zones dans lesquelles vous allez mettre en place les réactions PCR.Un mélange de trois amorces inverses spécifiques à la région constante des chaînes alpha et bêta est utilisé dans cette réaction. Préparez le master-mix de transcription inverse en combinant les réactifs dans un réservoir de pipetage. Pour tenir compte de l’erreur de pipetage, préparez suffisamment de mélange réactionnel pour dix puits supplémentaires.À l’aide d’un multicanaux, pipeter six microlitres par puits dans une plaque de PCR de 96 puits. Couvrez l’assiette sans serrer avec un joint et maintenez l’assiette sur de la glace. Préparez les lymphocytes T pour le tri unicellulaire en colorant les cellules avec des anticorps contre les marqueurs de surface cellulaire.Triez les lymphocytes T à la fois cellule par puits tout en laissant les douze rangées vides, qui serviront de contrôle négatif. Scellez la plaque avec un film adhésif et tournez-la à 1000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Exécutez immédiatement la réaction de transcription inverse.Si possible, exécutez la première réaction PCR le jour même. Pour exécuter la réaction multiplex, mélangez séparément les mélanges maîtres PCR V alpha et V bêta dans des réservoirs de pipetage. Conservez la plaque avec l’ADNc sur de la glace ou sur un bloc froid.Transférez 22,5 microlitres de réaction bêta TCR dans une nouvelle plaque PCR à 96 puits. Ensuite, utilisez un multicanal pour transférer 2,5 microlitres d’ADNc dans la plaque PCR. À l’aide d’un multicanal, pipeter 22,5 microlitres de réaction TCR alpha directement dans la plaque contenant le reste de l’ADNc.Scellez les plaques avec de l’adhésif, tournez doucement et tournez brièvement vers le bas. Exécutez la première réaction PCR. Les plaques peuvent être stockées à 20 degrés Celsius.Le lendemain, préparez les deuxièmes réactions PCR imbriquées. À l’aide d’une pipette multicanaux, le mélange maître pour les réactions TCR alpha et TCR bêta à 22,5 microlitres par puits dans deux nouvelles plaques PCR à 96 puits. Ajouter le modèle de réaction PCR multiplex à 2,5 microlitres par puits.Scellez les plaques, tourbillonnez doucement et tournez brièvement vers le bas. La première réaction PCR restante doit être scellée et stockée à 20 degrés Celsius pour servir de source de modèle de secours. Effectuez la deuxième réaction PCR.Une fois la deuxième réaction de PCR imbriquée terminée, épuisez cinq microlitres de la réaction sur un gel d’agarose à 1 %. Incluez les puits de contrôle positif et négatif. La bande attendue doit avoir une taille d’environ 500 paires de bases.Purifier le reste de la deuxième réaction, soit vingt microlitres, à l’aide d’un kit de purification PCR au format 96 puits et effectuer un séquençage de Sanger. Les séquences TCR obtenues peuvent être analysées à l’aide d’un logiciel immunogénétique disponible en ligne. Les informations de séquence peuvent être utilisées pour évaluer le répertoire et la clonalité de la population de lymphocytes T.Les séquences alpha et bêta appariées du TCR peuvent être utilisées dans une analyse fonctionnelle plus approfondie. Effectuez des ligatures consécutives de TCR bêta et TCR alpha dans le vecteur modèle. Les modèles TCR bêta et TCR alpha sont remplacés par les chaînes amplifiées par PCR.Lors de la première ligature, la matrice TCR bêta est remplacée par la chaîne bêta amplifiée par PCR. Une fois que l’insertion réussie de TCR bêta a été vérifiée par séquençage test-digest, remplacez la matrice TCR alpha par la chaîne alpha amplifiée par PCR. HEK293T cellules sont utilisées pour tester l’appariement réussi de la chaîne TCR et l’expression à la surface cellulaire.HEK293T cellules sont co-transfectées avec le vecteur TCR marqué par le rapporteur fluorescent amétrine et un vecteur codant pour le complexe CD3 marqué par GFP. L’expression de surface du TCR chimérique est vérifiée par cytométrie en flux en colorant les cellules avec un anticorps CD3 anti-souris. Le niveau d’expression de CD3 de surface dans les cellules transfectées avec la construction TCR chimérique devrait être comparable à celles transfectées avec le vecteur modèle de contrôle entièrement miroir.En résumé, nous avons décrit un protocole efficace basé sur la PCR pour l’identification et le clonage de chaînes TCR appariées à partir de cellules uniques. Nous prévoyons qu’il s’agira d’un outil précieux pour étudier les réponses des lymphocytes T humains dans l’auto-immunité, la surveillance des tumeurs et l’élimination des agents pathogènes. Le principal avantage du protocole PCR décrit ici est sa compatibilité avec les études in vitro et in vivo ultérieures.

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Nous présentons un protocole pour la transduction rétrovirale de l’ARN guide dans les lymphocytes T primaires de souris transgéniques Cas9, offrant une alternative efficace pour l’édition de gènes dans l’étude de la différenciation Th17.

Ciblage génique rétroviral médié par CRISPR/Cas9 pour l’étude de la différenciation Th17 in vitro

Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

Génération de lymphocytes T régulateurs du récepteur de l’antigène chimérique humain

Nous présentons des protocoles améliorés pour la transduction rétrovirale des récepteurs de trafic et le guidage compétitif afin d’étudier le positionnement des lymphocytes spécifiques aux organes et au microenvironnement médiés par les récepteurs. Cette méthode offre des informations précieuses sur les mécanismes de trafic des cellules immunitaires et a des applications potentielles dans la recherche fondamentale et thérapeutique future.

Transduction rétrovirale efficace et guidage compétitif pour l’étude de la localisation des lymphocytes T médiée par les RCPG dans divers microenvironnements tissulaires

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Ce protocole décrit les étapes essentielles pour la culture des lymphocytes T primaires, y compris leur isolement, leur activation, leur expansion et leur transfection transitoire par électroporation d’ARNm. De plus, un flux de travail et un panel d’anticorps pour l’analyse cytométrique en flux du phénotype, des marqueurs d’activation, de la viabilité et de l’expression du récepteur antigénique chimérique (CAR) sont proposés.

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR)

Apprenez l'isolement unicellulaire de TCR et la génération de vecteurs rétroviraux pour l'expression de TCRs humaines in vitro et in vivo. Cette méthode par PCR multiplexe et imbriquée permet d'analyser les répertoires TCR sans connaissance préalable des séquences.

Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines (Vidéo) | JoVE Journal

Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines

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