Name: Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Découvrez la visualisation de l'angiogenèse par microscopie multiphoton in vivo dans des échafaudages 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés. Cette méthode permet d'observer en temps réel la formation vasculaire pour la réparation osseuse.

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Cette étude a été financée par le programme de paon Shenzhen, Chine (no 110811003586331), le programme de recherche fondamentale de Shenzhen (no. JCYJ20150401150223631, no JCYJ20150401145529020 et no JCYJ20160331190714896), le Guangdong Public Research and Capacity Building programme spécial (n° 2015A020212030), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 81501893), le programme de recherche de base Major National de Chine (2013CB945503) et le Programme d’Innovation de SIAT d’excellents jeunes chercheurs (Y5G010).

la protection des animaux était en conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation du laboratoire animaux de la Province du Guangdong. Toutes les procédures ont été effectuées sous la surveillance et l’approbation du Comité d’éthique pour la recherche animale, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Académie chinoise des Sciences.
 1. Production des gènes (LV) site <ol><li>Clone le cDNA de pdgf-b dans un vecteur d’expression des gènes (pLenti6/5-eGFP ou LV-eGFP) à un multiple-clonage personnalisé en aval du promoteur cytomégalovirus utilisant Spe I et Sal J’ai des sites de restriction pour construire le plasmide pLenti6/5-PDGFB-eGFP (LV - pdgfb) 25.</li>
	<li>Produisent des Particules Lentivirales (LV - pdgfb) des cellules HEK - 293 FT par transfectants conjointement avec des plasmides d’emballage de virus (pLP1, pLP2 et pVSV-G) à l’aide de la méthode standard phosphate de calcium à la chloroquine (concentration finale : 25 µM) 25.</li> <li>après 48 h de la transfection, récolter et filtrer 500 mL contenant virus du surnageant avec un filtre (0,45 µm). Par la suite, se concentrent les particules virales par ultracentrifugation à 89 000 x g pendant 2 h. remettre dans 200 µL de tampon phosphate salin (PBS), aliquote et stocker à -80 ° C.</li>
	<li>Pour déterminer le titre des lentivirus, incuber les cellules HEK293T avec en série des gènes solution pendant 24 h et calculer le titre des gènes, comme décrit précédemment 25.</li>
</ol> 2. Fabrication d’imprimés 3D PLGA/PNVS échafaudages et immobilisation LV <ol><li>dissoudre 20 g de PLGA (Poly D, L-lactide-co-glycolide) matériel dans 20 mL de 1, 4-dioxane pour former une solution homogène. Ajouter 2 g de taille nanométrique poudre HAp (nano-hydroxyapatide) (PNVS) à la solution ; la PLGA : PNVS rapport devrait être de 10:1 (w/w).</li>
	<li>Agiter la solution mixte vigoureusement (en mélangeant Vitesse : 1500 tr/min) à température ambiante pendant 16 h, à l’aide d’un agitateur magnétique pour former une pâte homogène. Il fabriquer dans les échafaudages PLGA/PNVS poreux à l’aide d’une imprimante 3D de basse température avec une buse informatisée qui dépose le bas couche par couche, de pâte vers le haut, selon un modèle préconçu 26 ; la taille des pores des échafaudages varie de 200 à 400 µm.</li>
	<li>Vide lyophiliser les échafaudages pendant 48 h enlever le dissolvant aussi complètement que possible. Faire tremper les échafaudages en solution alcoolique 75 % pendant 1 h pour la stérilisation et lyophiliser pour obtenir des échafaudages neutres, aseptiques. 
	Remarque : Les paramètres importants pour la lyophilisation sous vide incluent la température de condensation (° C) et le degré de vide (Pa). En vertu d’un degré de vide de 45 Pa, les échafaudages PLGA/PNVS étaient vide lyophilisé à-78 ° C pendant 48 h à complètement éliminer le solvant.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de particules LV (4,5 x 10 5) à chaque PLGA/PNVS d’échafaudage (4 x 4 x 2 mm) et incuber les échafaudages pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié pour permettre à adsorption.</li>
	<li>Après l’immobilisation, rincer les échafaudages deux fois avec du PBS pour enlever les particules de LV non liés. Clin d’oeil-gel les échafaudages de particules revêtus de LV dans l’azote liquide, lyophiliser nouveau et stocker à-80 ° C pour une utilisation future.</li>
</ol> 3. In Vitro Cinétique de libération de particules LV d’échafaudages et d’analyse d’activité de Transduction LV <ol><li>Incuber les échafaudages 3D (4 x 4 x 2 mm) comptable LV-vert protéine fluorescente (LV-eGFP, 4,5 x 10 5 LV particules) dans 1 mL de DMEM complet à 2,0 mL cryogénique flacons à 37 ° C sous agitation pendant 5 jours.</li>
	<li>Prendre un échantillon de 1 mL chaque 12 h de 12 h à 120 h après d’incubation et remplacer le support. À chaque moment, ajouter 1 mL de milieu frais au lieu de 1 mL de milieu d’incubation.</li>
	<li>Utiliser les médias collectés pour transmettre les cellules HEK293T co incubation pendant 48 h. mesure le nombre de particules de LV bioactifs en déterminant le nombre de séropositifs au GFP HEK293T cellules par cytométrie de flux 27.
	<ol><li>Avant de faire les cellules HEK293T, enlevez le milieu de culture et rincer les cellules HEK293T deux fois avec du PBS. Ajouter les médias collectés contenant lentivirus détache les échafaudages dans le puits (1 mL/puits) et de la culture avec les cellules HEK293T pendant 48 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié.</li>
	</ol></li></ol> 4. In Vitro Évaluation de la Migration de MSC (BMSC) moelle osseuse <ol><li>avant le test de migration, préparer BMSC exprimant la protéine fluorescente de tomate (BMSC-T) et de protéines (BMSC-P) de PDGF-BB 28.</li>
	<li>Effectuer le test de migration BMSC avec une chambre de Boyden, utilisant une plaque 24 puits et filtres en polycarbonate avec une taille de pores de 8 µm.
	<ol><li>Place 0,5 mL de BMSC (5 x 10, 4) transfectées avec LV exprimant la protéine fluorescente de tomate (BMSC-T) dans les cavités supérieures. Verser 0,5 mL de BMSC (2 x 10, 5) transfectées avec LV exprimant la protéine PDGF-BB (BMSC-P) dans les cavités inférieures.</li>
	</ol></li> <li>Comprend six groupes dans cette expérience et ajouter 500 µL dans le compartiment inférieur de chaque puits. 
	A. blank contrôle, sans sérum moyen seulement contrôle B. FBS, moyenne additionné de 10 % FBS contrôle C. PDGF-BB, 4 ng/mL PDGF-BB dans un milieu sans sérum D. PDGF-BB saisir groupe, PDGF-BB (4 ng/mL) et anticorps polyclonal anti-PDGF-BB (4 ng/mL) en un milieu sans sérum groupe BMSC E., 2 x 10 5 BMSC dans un milieu sans sérum groupe F. BMSC-P, 2 x 10 5 BMSC-P dans un milieu sans sérum.</li>
	<li>Incuber pendant 48 heures à 5 % de CO 2 et 37 ° C dans un incubateur humidifié. Ensuite, enlever les cellules migrés sur le côté inférieur de la chambre et à leur rassemblement pour la quantification du nombre de BMSC-T par cytométrie.
	<ol><li>Supprimer cellules migrés sur la chambre basse côté à l’aide d’un grattoir de cellules et remettre en suspension les cellules migrées avec 2 mL de PBS. Quantifier le nombre de migré BMSC-T par écoulement cytometry 29.</li>
	</ol></li></ol> 5. Création d’un modèle murin substance critique de défaut en os et échafaudage Transplantation Remarque : souris mâles BALB/c (7 semaines) ont été achetées à Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Guangdong, Chine).
Experiment de souris mâles <ol><li>inscrire un total de 42 pour le défaut de substance osseuse. Au hasard de diviser les souris en trois groupes, avec quatorze ans dans chaque groupe qui reçoivent des traitements suivants : groupe A, à aucun implants ; Le groupe B, les échafaudages PH implanté (PLGA/PNVS) ; et le groupe C, PHp échafaudages implantés (PLGA/PNVS/LV-pdgfb).</li>
	<li>Anesthésier les animaux avec l’administration intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (50 mg/kg). Enlever la fourrure avec pâte épilatoire et nettoyer la peau de tête avec la solution d’alcool 75 % avant d’effectuer la première incision. Fixer la tête de chacune des souris avec un instrument stéréotaxique pour le garder encore pendant la chirurgie.</li>
	<li>Faire une incision initiale avec un scalpel et puis agrandissez-le with ciseaux pour créer une incision de 1 cm de peau linéaire. Gratter le périoste de l’os du crâne pour révéler la surface osseuse du crâne à l’aide d’un coton-tige stériles.</li>
	<li>Permet de créer un défaut de taille critique de 4 mm de diamètre sur le côté gauche de la calotte cranienne 30 une bavure de trépan. Repiquez l’échafaud dans le site du défect osseux. 
	NOTE : Défauts de taille critique (CSDs) ont été définis initialement comme &#34; la plus petite taille intra-osseux enroulé dans un OS particulier et les espèces animales qui ne guérira pas spontanément au cours de la durée de vie de l’animal. &#34; dans cette expérience, le défaut de 4 mm de diamètre est un défect osseux de taille critique, selon l’étude précédemment 31 , 32.</li>
	<li>Utiliser forceps ophtalmique pour ramener le périoste doucement pour couvrir le champ opératoire. Suturer la peau incisée avec trois mailles / cm.</li>
	<li>Soins post-opérationnelle Perform. Administrer l’analgésique buprénorphine (0,1 mg/kg) pour soulager la douleur. Maintenir la température du corps avec un coussin chauffant jusqu'à ce que l’animal se réveille. Par la suite, nourrir les animaux avec la nourriture et d’eau et d’enregistrer leur activité tous les jours jusqu'à la fin de l’essai. Remarque : L’analgésie peut être administrée avant l’intervention selon vos directives de Comité animalier local.</li></ol> 6. In Vivo Imagerie de l’angiogenèse dans l’aménagement le défect osseux avec MPM Remarque : conjugué FITC 250 kD dextran (10 mg/mL) dans une solution saline était par voie intraveineuse injectées à des souris d’obtenir haute-SNR (rapport signal sur bruit) images de nouveaux vaisseaux sanguins selon une précédente étude 33. Veuillez noter que ceci est une procédure de survie. <ol><li>monter le système de microscopie multiphoton (MPM) pour deux photons fluorescence excité (TPEF) et de l’imagerie de signal (SHG) deuxième génération harmonique.</li>
	<li>Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (50 mg/kg) et immobiliser les animaux sur une plaque chauffante pour maintenir leur température corporelle à 37 ° C au cours des expériences. Utilisez gaz isoflurane 3,0 % dans 100 % d’oxygène pour maintenir satisfaisante anesthésie et analgésie pendant le processus d’imagerie. Injecter par voie intrapéritonéale saline (200 µL/animal) pour prévenir la déshydratation avant imagerie.</li>
	<li>Tune le laser femtoseconde Ti-Sapphire à 860 nm. Créer une zone de 512 x 512 µm d’échantillonnage par balayage d’une paire de miroirs galvo et utiliser lentille d’objectif-immersion dans l’eau NA1.0 à faisceau d’excitation focusthe dans l’échantillon et de recueillir le signal TPEF/SHG rétrodiffusé. 
	Remarque : L’imagerie a été réalisée sur un système d’imagerie microscopique multiphotonique (MPM) de maison-construction. Au cours de l’imagerie, un laser femtoseconde Ti-Sapphire était réglé à 860 nm comme la longueur d’onde d’excitation optimal. Le faisceau laser a été raster analysé à travers un plan d’échantillonnage à l’aide d’une paire de miroirs de galvanomètre. Après avoir passé à travers un miroir dichroïque de 685 nm, le faisceau se concentrait sur l’échantillon par un objectif de NA1.0 X 20. Les signaux TPEF et SHG induits ont été recueillies par le même objectif. Les signaux ont été réparties du laser d’excitation par le miroir dichroïque mentionnés ci-dessus et purifiée par un filtre de courte passe de 680 nm. Les signaux TPEF et SHG ont été recueillies par un faisceau de fibres et menées à un spectrographe. Le détecteur sur le spectrographe était une rangée linéaire de tubes photomultiplicateurs (PMT). La combinaison du spectrographe et linéaire PMTs a offert la possibilité d’enregistrer le signal dans 16 bandes spectrales consécutives, de 400 nm à 600 nm, à des intervalles de 12,5 nm. Par conséquent, les signaux TPEF et SHG ont été détectés en même temps et séparés dans des domaines spectres. En outre, pour l’imagerie 3D, un moteur axial a été utilisé pour contrôler la profondeur d’imagerie. La zone de chaque image a été fixée à 512 x 512 µm, et l’intervalle de profondeur a été fixé à 2 µm (groupe témoin, 5 µm). Notamment, 5 sites sur chaque défaut ont été imagées pour collecter les données statistiquement significatives, et les sites d’imagerie sélectionnés ont été distribués uniformément et au hasard le long de la défectuosité.</li>
	<li>Scan 5 sites sur chaque défaut de recueillir des données statistiquement significatives pour mesurer la formation de vaisseaux.
	<ol><li>Utilisation numérisation sites régulièrement et aléatoirement répartis le long de la défectuosité. Pour le groupe témoin, ont le champ d’afficher la couverture (FOV) la zone osseuse d’origine et le bord de la hernie, mais pour les groupes de PH et de PHp, a le champ de vision sur l’échafaud implanté.</li>
		<li>Faire une incision de 1 cm de peau linéaire à l’aide d’un scalpel et suture la peau ouverte à la fixation de révéler le site de la transplantation. Utiliser une seringue pour déposer une goutte d’eau qui sépare la lentille trempage et les greffes pour former un verre d’eau.</li>
	</ol></li> <li>Image Acquire empile chaque 12 s sur un 2 h, période d’imagerie. Afficher et d’analyser les données volumétriques à l’aide d’un programme personnalisé de MATLAB et de quantifier les zones de vaisseau sanguin avec ImageJ logiciel 34 , 35.</li>
</ol> 7. Analyse de l’Expression génique du pdgf-b et des gènes liés à l’angiogénèse par RT-qPCR Remarque : PCR a été réalisée suivant la procédure habituelle : 95 ° C pendant 30 s, 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 30 s. Post-PCR fonte courbes a confirmé la spécificité de l’amplification de la cible unique, et le changement de pli du gène d’intérêt par rapport au β-actine a été déterminé. La réaction pour chaque échantillon a été testée trois fois.
<ol><li>Récolte implanté les échafaudages et les tissus des souris expérimentales à 2, 4 et 8 semaines après l’opération 36 ; groupe échantillons de contrôle (n = 4), prises sur les mêmes points de temps, devrait être du tissu osseux adjacent. 
	Remarque : À chaque point dans le temps (2, 4 et 8 semaines), euthanasié les souris avec inhalation de CO 2. Disséquer la calotte cranienne et, par la suite, de retirer et de récolter les échafaudages implantés de la calotte cranienne.</li>
	<li>Utiliser un réactif commercial pour extraire l’ARN total de chaque échantillon selon le fabricant &#39; protocole s. Utilisez le Kit de Transcription inverse pour renverser-transcrire l’ARN en ADNc suivant le fabricant &#39; protocole de s.</li>
	<li>Perform quantitative PCR en temps réel en utilisant le système de détection SYBR Green ; les amorces sont énumérés au tableau 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td colspan="8"> Primer(5&#39;&#8211;3&#39;)</td></tr> <tr><td colspan="2" rowspan="1"> Gene</td>
			<td colspan="2" rowspan="1"> vers l’avant</td>
			<td colspan="4" rowspan="1"> Reverse</td></tr>
		<tr><td>pdgfb</td> <td colspan="3"> CATCCGCTCCTTTGATGATCTT</td> <td colspan="4"> GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT</td></tr>
		<tr><td>vWF</td> <td colspan="3"> CTCTTTGGGGACGACTTCATC</td> <td colspan="4"> TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC</td></tr>
		<tr><td>VEGFR2</td> <td colspan="3"> AG GAAATGACACTGGAGCCTACA</td> <td colspan="4"> TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G</td></tr>
		<tr><td>β-actine</td> <td colspan="3"> GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG</td> <td colspan="4"> CAAT GCAGTACATAATTTACACAGAAG</td></tr></tbody>
</table> tableau 1 : ensembles de Pimer.
 8. MicroCT analyse de régénération osseuse <ol><li>euthanasier souris dotées de CO 2 par inhalation à post-opération de 8 semaines. Dans un environnement bien aéré, délicatement placer chaque souris dans une cage propre souris et pompe à gaz de CO 2 dans la cage à anesthésier les souris avant l’euthanasie.</li>
	<li>De disséquer le crâne pour l’imagerie de la gamme de la région de défaut osseux. Utilisateur qui suit analyse les paramètres dans les expériences : 9 µm résolution, Al 0,5 mm filtre, 50 kV voltage et courant 142 µA.</li>
	<li>Reconstruct toutes les données d’imagerie utilisant des logiciels commerciaux fournis par l’entreprise. Calibrer les scans à l’aide de la fonction de calibrage d’un logiciel de CTAn. 
	NOTE : Placer une unité Hounsfield (HU) sous les souris à chaque balayage.</li>
</ol>

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’OS est un tissu très vascularisé avec une capacité unique pour guérir et remodeler tout au long de la durée de vie d’un individuel1en permanence. Le niveau de la vascularisation est important pour l’ostéogenèse et défaut de réparation. Vascularisation faible limite l’application large clinique tissulaire osseuse. Construction d’un OS tissulaire fortement vascularisé selon la théorie de biomimetics est devenu un outil pour la réparation des défauts osseux grand segment. Différents types d’échafau...

L’OS est un tissu très vascularisé qui continue à remodeler au cours de la durée de vie d’un individuel1. La régénération osseuse rapide et efficace des défauts grand OS résultant d’un traumatisme, non syndiqué, résection de la tumeur ou des malformations cranio-faciales est un processus physiologique complex. Les approches thérapeutiques traditionnels utilisés pour la réparation osseuse défaut incluent implantation autogreffe et allogreffe, mais leur utilisation implique plusieurs problèmes et limitations, telles que la disponibilité limitée, morbidité site donateur important, un risque élevé d’infection, et l’hôte de rejet immunitaire2,3. Cependant, les greffes osseuses artificielle offrent une alternative efficace pour pallier ces limitations. Ils peuvent être faits de matériaux biodégradables, sont faciles à être fabriquer avec une taille de pore adapté et peuvent être génétiquement modifié4,5.
Actuellement, divers tissus ingénierie échafaudages ont été employés dans le développement de l’ingénierie tissulaire osseuse6,7. Pour induire la régénération et la réparation osseuse plus efficacement, biomatériaux machiné, combinée à des facteurs de croissance ont émergé et obtenu de bons résultats8,9. Malheureusement, la courte demi-vie, activité de facile-à-perdant et supra-physiologiques dosage des facteurs de croissance de l’efficacité thérapeutique de limiter leur application clinique10. Pour résoudre ces problèmes, la livraison des gènes du facteur de croissance plutôt que de facteurs de croissance a été démontrée comme une approche efficace pour maintenir l’activité biologique pour le traitement des défauts osseux et maladies11,12. Vecteurs viraux sont prometteurs de livraison des outils pour la régénération des tissus en raison de leur haute exprimant l’efficacité13.
Parmi les facteurs de croissance, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-BB) a été choisi dans cette étude, car il est non seulement un mitogène et facteur chimiotactique pour les cellules mésenchymateuses et ostéogéniques, mais aussi un stimulant pour l’angiogenèse14,15 . Des études précliniques et cliniques antérieures ont montré que le PDGF-BB pourrait promouvoir efficacement et en toute sécurité la réparation osseuse parodontale défauts osseux16,17. Des études récentes ont révélé que PDGF-BB stimule l’angiogenèse en motivant endothelial cell migration et prolifération en vivo18,19. En outre, PDGF-BB peut également rendre des cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de se différencier en cellules endothéliales20et ce d’autres points culminants le rôle potentiel de MSCs dans la néovascularisation. Par conséquent, induisant la formation de novo de vascularisation dans les échafaudages avec PDGF-BB est une étape importante pour la réparation des tissus cultivés dans les échafaudages en ingénierie tissulaire osseuse.
La guérison osseuse défaut est un processus morphogénétiques tissu dynamique qui exige une ostéogenèse coordonnée et angiogenèse à la réparation des postes21. Néoangiogenèse dans implanté échafaudages tissulaire est une condition préalable essentielle pour l’approvisionnement des cellules avec des nutriments et l’oxygène pour la croissance et de survie et pour l’élimination des déchets métaboliques. Couramment utilisé de méthodes d’imagerie, y compris les rayons x micro-calculé tomographie (microCT), l’imagerie par résonance magnétique (IRM), microscopie électronique à balayage (SEM), tomographie à cohérence optique (OCT) et laser confocal, microscopie à balayage, sont appliquées au lieu de examen histologique pour obtenir l’angiogenèse informations22,23. Cependant, ces méthodes font face à divers obstacles à visualiser et à mesurer les neovasculature en 3D échafaudages en ingénierie tissulaire osseuse. La microscopie multiphoton (MPM) est une technique de bio-imagerie relativement nouveau qui a l’avantage de simultanément la visualisation des cellules, matrice extracellulaire et entourant les réseaux vasculaires in vivo. Il possède une capacité d’imagerie tridimensionnelle inhérente pour la pénétration des tissus profonds et provoque le photovieillissement faible. Par conséquent, au cours de la dernière décennie, MPM a gagné beaucoup d’attention dans les études biomédicales24, y compris en neurosciences, immunologie et de dynamique des cellules souches. Toutefois, il est à peine utilisé dans la recherche orthopédique.

<table><tbody><tr><td>Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA)</td><td>Sigma</td><td>P1941</td><td>Rapport L/G 75:25, MW 66000-107000</td></tr><tr><td>Nanoparticules d’hydroxyapatite</td><td>Sigma</td><td>702153</td><td>Diamètre moyen < 200 nm</td></tr><tr><td>Sel de diphosphate de chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugué 250-kD</td><td>dextran Sigma</td><td>FD250S</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioxane</td><td>lingfeng, Filtres</td> Stericup <td>0,45 micron</td>de Shanghai <td></td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB Cdna</td><td>Sino Biological, Inc</td><td>MZ50801-G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDGF-BB anticorps polyclonal de souris</td><td>&nbsp ; BioVision, Inc</td><td>5489-30T</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB protéine</td><td></td> recombinante <td>4489-50</td><td></td></tr><tr><td>Solution de transfection calcium-phosphate</td><td>Promega Corporation</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>L-DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine, liquide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Transwell&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3422</td><td></td></tr><tr><td>Souris mâles BALB/c Centre</td><td>vétérinaire de laboratoire médical du Guangdong&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pentobarbital de sodium&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>1063180500</td><td></td></tr><tr><td>la microscopie</td><td></td><td></td> multiphotonique <td>A fabriquée à la maison dans les instituts de technologie avancée de Shenzhen pour détecter la fluorescence excitée à deux photons (TPEF) et le signal de génération de seconde harmonique (SHG).</td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Keyuan, Shandong</td><td>401750169</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline et éosine</td><td>Beyotime</td><td>C0105</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Leica& nbsp ;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse OPtima L-100XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Imprimante basse température&nbsp ;</td>Université <td></td><td>de Tsinghua</td> Un instrument LightCycler 480 <td>fait maison à l’université de Tsinghua</td></tr>.<tr><td></td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td></td></tr><tr><td>microCT</td><td>Bruker</td><td>1176</td><td></td></tr><tr><td>logiciel commercial</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de l’angiogenèse par microscopie multiphoton in vivo en échafaudage de 3d-plga/pnvs génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

La reconstruction des défauts osseux taille critique reste un problème clinique grave en raison de la mauvaise angiogenèse dans les échafaudages tissulaire lors de la réparation, ce qui donne lieu à un manque d’approvisionnement suffisant en sang et provoque des nécroses des tissus nouveaux. La vascularisation rapide est une condition sine qua non pour la survie de tissus nouveaux et l’intégration avec les tissus de l’hôte. La génération de novo du système vasculaire dans les échafaudages est l’une des étapes plus importantes dans la fabrication de la régénération osseuse plus efficace, permettant de réparer les tissus à se transformer en un échafaudage. Pour résoudre ce problème, la modification génétique d’un échafaudage de biomatériau est utilisée pour accélérer l’angiogenèse et l’ostéogenèse. Cependant, la visualisation et suivi en vivo formation de vaisseaux sanguins en temps réel et en trois dimensions (3D) échafaudages ou nouveau tissu osseux est toujours un obstacle pour l’ingénierie tissulaire osseuse. La microscopie multiphoton (MPM) est une nouvelle modalité de bio-imagerie qui peut acquérir des données volumétriques de structures biologiques de manière à haute résolution et mini-invasive. L’objectif de cette étude était de visualiser l’angiogenèse avec la microscopie multiphoton in vivo dans un échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifié pour la réparation de défauts de substance osseuse critique. PLGA/PNVS échafaudages ont été fonctionnalisés pour la prestation continue d’un gène de pdgf-b de facteur de croissance transportant des vecteurs LENTIVIRAUX (LV -pdgfb) afin de faciliter l’angiogenèse et à améliorer la régénération osseuse. Dans un OS critique substance implantés échafaudage défaut modèle murin, les zones de vaisseaux sanguins (BVAs) dans PHp échafaudages ont été significativement plus élevées que dans les échafaudages de PH. En outre, l’expression de pdgf-b et gènes liés à l’angiogenèse, vWF et VEGFR2, augmenté proportionnellement. Plus l’analyse a indiqué que la nouvelle formation osseuse dans le PHp group a grandement amélioré par rapport aux autres groupes. À notre connaissance, c’est la première fois la microscopie multiphoton fut utilisée en ingénierie tissulaire osseuse pour enquêter sur l’angiogenèse dans un échafaudage biodégradables 3D in vivo et en temps réel.

Cylindrique poreux PLGA/PNVS échafaudages 0,6 mm de hauteur et 4 mm de diamètre ont été fabriqués avec une imprimante 3D. Les morphologies des échafaudages ont été analysés par microscopie à balayage électronique et plus. Figure 1 a montre la photographie de l’échafaudage implanté. Gamme à balayage a révélé que plus de 85 % des pores ont des tailles allant de 200 à 400 µm (Figure 1 b). L’imagerie SEM a démontré que la surface de l’échafaud avait une micro...

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les vaisseaux sanguins formation in vivo et en temps réel en 3D échafaudages par microscopie multiphoton. L’angiogenèse dans les échafaudages génétiquement modifiés a été étudiée dans un modèle de défaut murine substance osseuse critique. Plus de nouveaux vaisseaux ont été détectés dans le groupe de traitement que chez les témoins.

Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

L'objectif général de cette expérience est de visualiser en temps réel la formation de vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels à l'aide de la microscopie multiphoton. Ces mesures répondent à une question clé dans le domaine de la régénération osseuse, notamment comment neutraliser et suivre en temps réel la formation de vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels. Un avantage de cette technique est qu'elle permet de neutraliser simultanément les CERES, les matrices extracellulaires et les réseaux moléculaires environnants in vivo.Pour commencer, préparez une solution homogène contenant 20 grammes de PLGA et 20 millilitres de 1,4-dioxane. Ajoutez ensuite deux grammes de nHAP en poudre à la solution. À l’aide d’un agitateur magnétique, mélangez vigoureusement la suspension à 1500 tr/min à température ambiante pendant 16 heures afin d’obtenir une pâte uniforme qui sera utilisée pour imprimer des échafaudages poreux de PLGA-nHAP.Une fois imprimées, lyophilisez les échafaudages pendant 48 heures afin d'éliminer complètement tout solvant. Puis, stérilisez-les dans de l'éthanol à 75 pour cent pendant une heure. Ensuite, lyophilisez-les à nouveau pour obtenir un matériau neutre et antiseptique.Ensuite, ajoutez 4,5 × 10⁵ particules lentivirales à chaque échafaudage et laissez les particules s'adsorber dans un incubateur humidifié maintenu à 37 °C pendant deux heures. Une fois que les particules lentivirales sont adsorbées sur les échafaudages, rincez les échafaudages deux fois avec 2 mL de PBS afin d'éliminer les résidus non liés. Congelez rapidement les échafaudages rincés dans l'azote liquide.Et après une nouvelle lyophilisation, les conserver à moins 80 degrés Celsius pour des études ultérieures. Transférer les supports tridimensionnels préalablement recouverts de 4,5 × 10⁵ particules lentivirales portant la protéine fluorescente verte dans des fioles cryogéniques de 2,0 mL remplies d’un millilitre de DMEM complet et les incuber à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq jours. Toutes les douze heures d'incubation, prélever un échantillon d’un millilitre du milieu contenant les particules lentivirales libérées par les supports, puis le remplacer par un millilitre de milieu frais.Pour transduire les cellules HEK293T, commencez par retirer le milieu des cellules HEK293T cultivées dans une plaque de 12 puits et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre du milieu préalablement collecté aux cellules HEK293T lavées et incubez la plaque pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Après 48 heures d'incubation, mesurez le nombre de cellules HEK293T positives pour GFB par cytométrie en flux afin de déterminer le nombre de particules lentivirales bioactives.Pour commencer, diviser aléatoirement des souris C57 black six en trois groupes de traitement : contrôle, PH et PHp, composés chacun de 14 animaux. Raser la peau sur la tête d'une souris anesthésiée et désinfecter la surface avec une teinture d'iode, puis avec une solution d'alcool à 75 pour cent. Placer la tête de la souris dans un instrument stéréotaxique et inciser la peau à l'aide d'un scalpel, puis, à l'aide de ciseaux, réaliser une incision linéaire d'un centimètre.À l’aide d’un coton-tige stérile, gratter le périoste sur l’os crânien afin d’en révéler la surface. Ensuite, du côté gauche du crâne, créer avec une fraise à trépan un défaut osseux critique de quatre millimètres de diamètre. Transplanter la matrice dans l’ouverture du défaut osseux.Utilisez une pince ophtalmique pour recouvrir délicatement le site chirurgical avec le périosté. Ensuite, fermez la plaie en appliquant trois points de suture par centimètre d'incision. Enfin, administrez l'analgésique buprénorphine pour contrôler la douleur postopératoire et maintenez l'animal sur un tapis chauffant afin de conserver sa température corporelle jusqu'à son réveil.Lorsque la souris reprend conscience, lui fournir de la nourriture et de l'eau et surveiller son activité quotidienne jusqu'à la fin de l'expérience. Après avoir assemblé le système de microscopie à plusieurs photons pour l'imagerie TPEF et SHG, régler le laser au titane-saphir femtoseconde à 860 nanomètres. Pour visualiser les nouveaux vaisseaux sanguins, injecter intraveineusement à la souris 200 microlitres d'une solution de dextran à 10 milligrammes par millilitre dans du sérum physiologique, puis, à l'aide de l'instrument stéréotaxique, immobiliser l'animal anesthésié sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius.Injecter la souris intrapéritonéalement avec 200 microlitres de solution saline afin de prévenir la déshydratation. Enfin, administrer à l'animal un mélange à trois pour cent d'isoflurane dans de l'oxygène à cent pour cent pour maintenir une anesthésie et une analgésie suffisantes pendant l'imagerie. Pour commencer l'imagerie, balayer une paire de miroirs galvanométriques afin de créer une zone d'échantillonnage de 512 par 512 micromètres.Ensuite, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 1,0 NA, focalisez le faisceau d’excitation sur l’échantillon et recueillez le signal rétrodiffusé de fluorescence à deux photons (TPEF) HSG. Réglez le champ de vision de manière à couvrir la zone osseuse normale et le bord du défaut dans le groupe témoin, mais uniquement l’échafaudage implanté lors de l’imagerie de l’animal des groupes PH ou PHp. Ensuite, balayez cinq sites différents du défaut.Acquérir des séries d'images toutes les 12 secondes pendant une période d'imagerie de deux heures. Voici une photographie du support préparé à l'aide de la technique d'impression 3D, accompagnée d'une image de micro-TDM montrant la porosité globale du matériau préparé. La structure microporeuse du support est illustrée par une image MEB obtenue à un grossissement de 5000 fois.Comme indiqué, les cellules HEK293T traitées avec un milieu contenant des particules lentivirales libérées à partir des supports ont exprimé efficacement la protéine fluorescente verte. Selon une estimation par cytométrie en flux, le nombre total de particules libérées a atteint environ 40 pour cent. L'effet de libération le plus marqué a été observé durant les premières 24 heures de l'étude, puis a diminué progressivement au fil du temps, confirmant que les particules lentivirales déposées sur les supports conservent leur activité biologique jusqu'à 96 heures.L'analyse in vivo des vaisseaux sanguins formés au sein d'un défaut osseux calvarial a montré que de nouveaux vaisseaux sanguins, bien qu'indétectables dans le groupe témoin de souris, étaient clairement visibles dans les deux groupes PH et PHp huit semaines après la transplantation de l'échafaudage. De plus, bien que de nombreux sites de dépôt de collagène aient été détectés dans les groupes PH et PHp, un nombre croissant de petits vaisseaux en croissance vers les échafaudages n'a pu être observé que dans le groupe PHp, et la surface totale des vaisseaux sanguins était significativement différente. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'immobiliser la tête de la souris afin de la maintenir immobile pendant le balayage et éviter ainsi tout artefact. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'imagerie photoacoustique peuvent être réalisées afin de fournir des données supplémentaires, comme des images de tissus profonds. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération osseuse pour étudier l'angiogenèse dans les greffes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser en temps réel la formation du plasma in vivo dans des échafaudages tridimensionnels, ainsi que la microscopie à microphotons.

visualizing-angiogenesis-multiphoton-microscopy-vivo-genetically

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Ce protocole décrit l'isolement de tissu adipeux dérivé des cellules stromales de lipoaspirate et la création d'une 4 mm de taille critique défaut crânienne pour évaluer la régénération osseuse.

Réparation d&#39;un modèle de critique des défauts de taille crânienne Utilisation adipeuses cellules stromales prélevés sur des Lipoaspirate

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

La vascularisation est la clé pour les approches en ingénierie tissulaire succès. Par conséquent, des technologies fiables sont nécessaires pour évaluer le développement des réseaux vasculaires dans les tissus-constructions. Nous présentons ici une méthode simple et efficace de visualiser et de quantifier la vascularisation in vivo.

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Implantation de greffons osseux autologues et allogéniques constituent accepté approches pour traiter importante perte osseuse cranio-facial. Pourtant, l'effet de la composition de greffe sur l'interaction entre la néovascularisation, la différenciation cellulaire et la formation osseuse est claire. Nous présentons un protocole d'imagerie multimodale visant à élucider l'interdépendance angiogenèse ostéogenèse à la proximité de la greffe.

Tomodensitométrie et l&#39;imagerie optique du couplage de l&#39;ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l&#39;intégration des crâniens autogreffes et allogreffes

Une méthode pour créer et diffuser différentes niches humanisées de moelle osseuse chez la souris est présentée. Sur la base de la niche de soutien créée par les cellules mésenchymateuses humaines, l'addition de cellules endothéliales humaines induit la formation de vaisseaux humains, tandis que l'addition de rhBMP-2 induit la formation de tissu osseux matriciel humain-souris chimère.

Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

Les volets d’ingénierie nécessitent un réseau vasculaire fonctionnel intégré. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de fabrication d’un lambeau de tissu imprimé en 3D contenant un réseau vasculaire hiérarchique et ses anastomoses microchirurgicales directes à l’artère fémorale du rat.

Fabrication de volets vasculaires artificiels à l’aide de technologies d’impression 3D

Un modèle in vitro de la niche vasculaire de la moelle osseuse est établi en ensemençant des cellules mésenchymateuses et endothéliales sur des hydrogels PEG 3D préfabriqués. Les réseaux endothéliaux, les composants ECM et l’activité ALP des niches varient en fonction du facteur de croissance utilisé. La plateforme peut être utilisée pour des modèles avancés de cancer.

Mise en place simple d’une niche de moelle osseuse ostéogénique vascularisée à l’aide d’hydrogels de poly(éthylène glycol) (PEG) préfabriqués dans une microplaque d’imagerie

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

La microscopie intravitale permet d’étudier des processus biologiques dynamiques tels que la régénération tissulaire et le développement tumorale. La moelle osseuse calvaire, un tissu très dynamique, offre des informations sur l’hématopoïèse et la fonction vasculaire. L’utilisation d’un implant de fixation de la tête biocompatible imprimé en 3D permet une imagerie longitudinale répétitive, améliorant ainsi notre compréhension de la dynamique des tissus et du microenvironnement tumoral.

Imagerie longitudinale intravitale de la dynamique vasculaire dans la moelle osseuse calvaire

L’angiogenèse germinative, fondamentale pour le développement et la maladie, implique des processus moléculaires et mécaniques complexes. Nous présentons un modèle 2,5D ex vivo polyvalent qui analyse la germination cellulaire des artères carotides porcines, révélant l’angiogenèse dépendante de la rigidité et la mécanique cellulaire distincte leader-follower. Ce modèle aide à faire progresser les stratégies d’ingénierie tissulaire et les approches de thérapie contre le cancer.

Modèle 2.5D pour la caractérisation mécanique ex vivo de l’angiogenèse germinative dans les tissus vivants

Découvrez la visualisation de l'angiogenèse par microscopie multiphoton in vivo dans des échafaudages 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés. Cette méthode permet d'observer en temps réel la formation vasculaire pour la réparation osseuse.

Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

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