Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

L’objectif global de cette expérience est de visualiser la formation des vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels en temps réel par microscopie multiphotonique. Ces mesures sont des questions clés dans le domaine de la génération osseuse, telles que la façon de neutraliser et de tromper la formation de vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels en temps réel. L’avantage de cette technique est qu’elle permet de neutraliser simultanément CERES, les métriques extracellulaires et les réseaux moléculaires environnants in vivo.

Pour commencer, préparez une solution homogène contenant 20 grammes de PLGA et 20 millilitres de 1,4 dioxane. Ensuite, ajoutez deux grammes de nHAP en poudre à la solution. À l’aide d’un agitateur magnétique, mélangez vigoureusement la suspension à 1500 tr/min à température ambiante pendant 16 heures pour former une pâte uniforme qui sera utilisée pour l’impression d’échafaudages poreux PLGA NHAP.

Une fois imprimés, lyophilisez les échafaudages pendant 48 heures pour éliminer complètement tout solvant. Et puis stérilisez-les dans de l’éthanol à 75 % pendant une heure. Ensuite, lifalysez-les une fois de plus pour obtenir un matériau neutre et antiseptique.

Ensuite, ajoutez quatre virgule cinq fois 10 à un cinquième de particules lentivirales dans chaque échafaudage et laissez les particules absorber dans un incubateur humidifié en maintenant 37 degrés Celsius pendant deux heures. Maintenant que les particules lentivirales sont absorbées sur les échafaudages, lavez les échafaudages deux fois avec deux millilitres de PBS pour éliminer tous les résidus non liés. Congelez en un clin d’œil les échafaudages lavés dans de l’azote liquide.

Et après avoir lifalysé une fois de plus, conservez-les à moins 80 degrés Celsius pour des études ultérieures. Transférez des échafaudages 3D préalablement recouverts de quatre virgule cinq fois dix aux cinquièmes particules lentivirales transportant des protéines fluorescentes vertes dans des flacons cryogéniques à deux virgule zéro millilitre remplis d’un millilitre de DMEM complet et incubez-les à 37 degrés Celsius en les secouant pendant cinq jours. Toutes les douze heures d’incubation, prélever un millilitre d’échantillons de milieux contenant des particules lentivirales libérées des échafaudages et les remplacer par un millilitre de milieux frais.

Pour transduire HEK293T cellules, retirez d’abord le milieu des cellules HEK293T cultivées dans une plaque à 12 puits et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre du milieu précédemment collecté dans les cellules de HEK293T lavées et incubez la plaque pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Après 48 heures d’incubation, mesurer le nombre de cellules HEK293T positives au GFB par cytométrie en flux pour déterminer le nombre de particules lentivirales bioactives.

Pour commencer, divisez au hasard six souris noires C57 en trois groupes de traitement : contrôle, PH et PHp de 14 animaux chacun. Rasez la peau de la tête d’une souris anesthésiée et désinfectez la surface avec une teinture d’iode, puis une solution d’alcool à 75 %. Placez la tête de la souris dans un instrument stéréotaxique et mesurez la peau avec un scalpel, puis à l’aide de ciseaux, faites une coupe linéaire d’un centimètre.

À l’aide d’un coton-tige stérile, grattez le périoste de l’os crânien pour révéler sa surface. Ensuite, sur le côté gauche du crâne, créez avec une fraise de trépan un défaut de taille critique de quatre millimètres de diamètre. Transplantez l’échafaudage sur le côté du défaut osseux.

Utilisez une pince ophtalmique pour couvrir doucement le site chirurgical avec le périoste. Ensuite, fermez la plaie en appliquant trois points de suture pour chaque centimètre d’incision. Enfin, administrez l’analgésique buprénorphine pour contrôler la douleur postopératoire et maintenez l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle jusqu’à ce qu’il se réveille.

Lorsque la souris reprend conscience, donnez-lui de la nourriture et de l’eau et surveillez son activité quotidienne jusqu’à la fin de l’expérience. Après avoir assemblé le système de microscopie multiphotonique pour l’imagerie TPEF et SHG, réglez le laser saphir de titane femtoseconde à 860 nanomètres. Pour visualiser les vaisseaux sanguins nouvellement formés, injectez à la souris par voie intraveineuse 200 microlitres d’une solution de dextran de 10 milligrammes par millilitre dans une solution saline, puis, à l’aide de l’instrument stéréotaxique, immobilisez l’animal anesthésié sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius.

Injectez à la souris 200 microlitres de solution saline par voie intrapéritonéale pour prévenir la déshydratation. Enfin, fournissez à l’animal un mélange de trois pour cent d’isoflurane dans 100 % d’oxygène pour maintenir une anesthésie et une analgésie suffisantes pendant l’imagerie. Pour commencer l’imagerie, balayez une paire de miroirs galvo pour créer une zone d’échantillonnage de 512 par 512 micromètres.

Ensuite, à l’aide d’une lentille d’objectif d’immersion dans l’eau NA à un point O, focalisez le faisceau d’excitation sur l’échantillon et collectez le signal TPEF HSG rétrodiffusé. Réglez le champ de vision de manière à ce qu’il couvre la zone osseuse normale et le bord du défaut dans le groupe témoin, mais uniquement l’échafaudage implanté lors de l’imagerie de l’animal à partir du groupe PH ou PHp. Ensuite, scannez cinq sites différents du défaut.

Acquérez des piles d’images toutes les 12 secondes sur une période d’imagerie de deux heures. Voici une photographie de l’échafaudage préparé avec la technique d’impression 3D, ainsi qu’une image micro-CT montrant la porosité globale du matériau préparé. La structure microporeuse de l’échafaudage est montrée dans une image MEB acquise à un grossissement de 5000 fois.

Comme on le voit, HEK293T cellules traitées avec des milieux contenant des particules lentivirales libérées par les échafaudages expriment efficacement la protéine fluorescente verte. Selon les estimations de la cytométrie en flux, le nombre total de particules libérées a atteint environ 40 %. L’effet de libération le plus robuste a été observé dans les 24 premières heures de l’étude et a progressivement diminué au fil du temps, confirmant que les particules lentivirales recouvertes sur les échafaudages maintiennent leur activité biologique jusqu’à 96 heures.

L’analyse in vivo des vaisseaux sanguins formés dans un défaut osseux calvaire a montré que les nouveaux vaisseaux sanguins, bien qu’indétectables dans le groupe témoin de souris, étaient clairement visibles dans les groupes PH et PHp huit semaines après la transplantation d’échafaudage. De plus, alors que dans les groupes PH et PHp, de nombreux sites de dépôt de collagène ont été détectés, ce n’est que dans le groupe PHp qu’un nombre croissant de petits vaisseaux se transformant en échafaudages a pu être observé et que la surface globale des vaisseaux sanguins était significativement différente. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’immobiliser la tête de la souris pour la maintenir immobile pendant le balayage afin d’éviter tout artefact. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie photoacoustique peuvent être effectuées afin de fournir des données supplémentaires telles que des images de tissus profonds. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération osseuse pour étudier l’angiogenèse dans les greffes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser la formation de plasma in vivo dans des échafaudages 3D en temps réel, et la microscopie à microphotons.