Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

L'objectif général de cette expérience est de visualiser en temps réel la formation de vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels à l'aide de la microscopie multiphoton. Ces mesures répondent à une question clé dans le domaine de la régénération osseuse, notamment comment neutraliser et suivre en temps réel la formation de vaisseaux sanguins in vivo dans des échafaudages tridimensionnels. Un avantage de cette technique est qu'elle permet de neutraliser simultanément les CERES, les matrices extracellulaires et les réseaux moléculaires environnants in vivo.

Pour commencer, préparez une solution homogène contenant 20 grammes de PLGA et 20 millilitres de 1,4-dioxane. Ajoutez ensuite deux grammes de nHAP en poudre à la solution. À l’aide d’un agitateur magnétique, mélangez vigoureusement la suspension à 1500 tr/min à température ambiante pendant 16 heures afin d’obtenir une pâte uniforme qui sera utilisée pour imprimer des échafaudages poreux de PLGA-nHAP.

Une fois imprimées, lyophilisez les échafaudages pendant 48 heures afin d'éliminer complètement tout solvant. Puis, stérilisez-les dans de l'éthanol à 75 pour cent pendant une heure. Ensuite, lyophilisez-les à nouveau pour obtenir un matériau neutre et antiseptique.

Ensuite, ajoutez 4,5 × 10⁵ particules lentivirales à chaque échafaudage et laissez les particules s'adsorber dans un incubateur humidifié maintenu à 37 °C pendant deux heures. Une fois que les particules lentivirales sont adsorbées sur les échafaudages, rincez les échafaudages deux fois avec 2 mL de PBS afin d'éliminer les résidus non liés. Congelez rapidement les échafaudages rincés dans l'azote liquide.

Et après une nouvelle lyophilisation, les conserver à moins 80 degrés Celsius pour des études ultérieures. Transférer les supports tridimensionnels préalablement recouverts de 4,5 × 10⁵ particules lentivirales portant la protéine fluorescente verte dans des fioles cryogéniques de 2,0 mL remplies d’un millilitre de DMEM complet et les incuber à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq jours. Toutes les douze heures d'incubation, prélever un échantillon d’un millilitre du milieu contenant les particules lentivirales libérées par les supports, puis le remplacer par un millilitre de milieu frais.

Pour transduire les cellules HEK293T, commencez par retirer le milieu des cellules HEK293T cultivées dans une plaque de 12 puits et lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez un millilitre du milieu préalablement collecté aux cellules HEK293T lavées et incubez la plaque pendant 48 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Après 48 heures d'incubation, mesurez le nombre de cellules HEK293T positives pour GFB par cytométrie en flux afin de déterminer le nombre de particules lentivirales bioactives.

Pour commencer, diviser aléatoirement des souris C57 black six en trois groupes de traitement : contrôle, PH et PHp, composés chacun de 14 animaux. Raser la peau sur la tête d'une souris anesthésiée et désinfecter la surface avec une teinture d'iode, puis avec une solution d'alcool à 75 pour cent. Placer la tête de la souris dans un instrument stéréotaxique et inciser la peau à l'aide d'un scalpel, puis, à l'aide de ciseaux, réaliser une incision linéaire d'un centimètre.

À l’aide d’un coton-tige stérile, gratter le périoste sur l’os crânien afin d’en révéler la surface. Ensuite, du côté gauche du crâne, créer avec une fraise à trépan un défaut osseux critique de quatre millimètres de diamètre. Transplanter la matrice dans l’ouverture du défaut osseux.

Utilisez une pince ophtalmique pour recouvrir délicatement le site chirurgical avec le périosté. Ensuite, fermez la plaie en appliquant trois points de suture par centimètre d'incision. Enfin, administrez l'analgésique buprénorphine pour contrôler la douleur postopératoire et maintenez l'animal sur un tapis chauffant afin de conserver sa température corporelle jusqu'à son réveil.

Lorsque la souris reprend conscience, lui fournir de la nourriture et de l'eau et surveiller son activité quotidienne jusqu'à la fin de l'expérience. Après avoir assemblé le système de microscopie à plusieurs photons pour l'imagerie TPEF et SHG, régler le laser au titane-saphir femtoseconde à 860 nanomètres. Pour visualiser les nouveaux vaisseaux sanguins, injecter intraveineusement à la souris 200 microlitres d'une solution de dextran à 10 milligrammes par millilitre dans du sérum physiologique, puis, à l'aide de l'instrument stéréotaxique, immobiliser l'animal anesthésié sur une plaque chauffante afin de maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius.

Injecter la souris intrapéritonéalement avec 200 microlitres de solution saline afin de prévenir la déshydratation. Enfin, administrer à l'animal un mélange à trois pour cent d'isoflurane dans de l'oxygène à cent pour cent pour maintenir une anesthésie et une analgésie suffisantes pendant l'imagerie. Pour commencer l'imagerie, balayer une paire de miroirs galvanométriques afin de créer une zone d'échantillonnage de 512 par 512 micromètres.

Ensuite, à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau de 1,0 NA, focalisez le faisceau d’excitation sur l’échantillon et recueillez le signal rétrodiffusé de fluorescence à deux photons (TPEF) HSG. Réglez le champ de vision de manière à couvrir la zone osseuse normale et le bord du défaut dans le groupe témoin, mais uniquement l’échafaudage implanté lors de l’imagerie de l’animal des groupes PH ou PHp. Ensuite, balayez cinq sites différents du défaut.

Acquérir des séries d'images toutes les 12 secondes pendant une période d'imagerie de deux heures. Voici une photographie du support préparé à l'aide de la technique d'impression 3D, accompagnée d'une image de micro-TDM montrant la porosité globale du matériau préparé. La structure microporeuse du support est illustrée par une image MEB obtenue à un grossissement de 5000 fois.

Comme indiqué, les cellules HEK293T traitées avec un milieu contenant des particules lentivirales libérées à partir des supports ont exprimé efficacement la protéine fluorescente verte. Selon une estimation par cytométrie en flux, le nombre total de particules libérées a atteint environ 40 pour cent. L'effet de libération le plus marqué a été observé durant les premières 24 heures de l'étude, puis a diminué progressivement au fil du temps, confirmant que les particules lentivirales déposées sur les supports conservent leur activité biologique jusqu'à 96 heures.

L'analyse in vivo des vaisseaux sanguins formés au sein d'un défaut osseux calvarial a montré que de nouveaux vaisseaux sanguins, bien qu'indétectables dans le groupe témoin de souris, étaient clairement visibles dans les deux groupes PH et PHp huit semaines après la transplantation de l'échafaudage. De plus, bien que de nombreux sites de dépôt de collagène aient été détectés dans les groupes PH et PHp, un nombre croissant de petits vaisseaux en croissance vers les échafaudages n'a pu être observé que dans le groupe PHp, et la surface totale des vaisseaux sanguins était significativement différente. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'immobiliser la tête de la souris afin de la maintenir immobile pendant le balayage et éviter ainsi tout artefact. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'imagerie photoacoustique peuvent être réalisées afin de fournir des données supplémentaires, comme des images de tissus profonds. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération osseuse pour étudier l'angiogenèse dans les greffes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment visualiser en temps réel la formation du plasma in vivo dans des échafaudages tridimensionnels, ainsi que la microscopie à microphotons.