Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l'antigène pour l'analyse des Phénotype et fonction

L’objectif global de cette procédure simple mais efficace est d’isoler et d’enrichir des lymphocytes B rares se liant à l’antigène à partir du sang périphérique humain en utilisant des nanoparticules magnétiques pour leur analyse phénotypique et fonctionnelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie concernant le phénotype et la biologie des lymphocytes B rares se liant à l’antigène avant et après la rencontre in-vivo de l’antigène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’éviter les problèmes liés à la géométrie, en particulier lorsqu’il s’agit d’utiliser une plaque de styrène ou un gros bill.

Et cela évite les problèmes associés au débit lorsque l’on isole des cellules par cytométrie en flux pour isoler des cellules rares dans des populations de cellules de départ assez importantes. Immédiatement après avoir prélevé 30 à 50 millilitres de sang total dans des tubes de prélèvement de sang héparinisés, mélangez le sang dans un rapport de 1:1 avec du magnésium stérile à température ambiante et du PBS sans calcium. Ensuite, superposez le mélange sanguin sur 10 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante dans un tube conique stérile de 50 millilitres en utilisant une pression de déclenchement lente et constante de la pipette.

Séparez les cellules par centrifugation. Jetez la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes et utilisez une pipette stérile pour transférer la couche leucocytaire du récipient de cellules mononucléées dans un nouveau tube stérile de 50 millilitres. Remplissez le tube avec jusqu’à 50 millilitres de PBS pour le lavage des cellules mononucléées par centrifugation.

Ensuite, remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de PBS frais pour le comptage et remettez les cellules en suspension à une concentration de 1x10^7 cellules par millilitre dans du PBS frais sur de la glace. Pour colorer les cellules pour la liaison aux billes magnétiques, transférez d’abord des aliquotes de cellules 1-2x10^6 dans des tubes en polystyrène de cinq millilitres pour chaque compensation de fluorescence et contrôle de fluorescence moins un le cas échéant. Ensuite, prélevez le reste de l’échantillon cellulaire par centrifugation et remettez la pastille en suspension à une concentration de 3-6x10^7 cellules par millilitre dans un tampon FACS froid filtré stérile.

Divisez la solution cellulaire en quatre tubes FACS sur de la glace et ajoutez le réagant bloquant du récepteur Fcgamma humain à ces quatre fractions d’échantillons expérimentaux. À la fin de l’incubation de blocage de liaison non spécifique, ajoutez les anticorps de coloration de surface cellulaire conjugués à la fluorescence appropriés aux cellules des quatre fractions d’échantillon. Ensuite, ajoutez l’antigène biotinylé approprié aux fractions A et D, suivi de l’ajout d’un volume suffisant d’antigène non marqué à la fraction B de sorte que la majorité des récepteurs ayant une affinité d’au moins 1x10^6 molaires soient bloqués.

Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace, suivis d’une incubation de 30 minutes de la fraction B avec l’antigène biotinylé approprié. À la fin des incubations, laver les cellules deux fois dans un millilitre de tampon FACS glacé par 5x10^7 cellules. Et remettez les granulés en suspension dans un millilitre de formaldéhyde à 2 % par 5 x 10^7 cellules pendant cinq minutes dans l’obscurité sur de la glace.

Après la fixation, lavez les cellules deux fois de plus comme nous venons de le démontrer. Et remettez les granulés en suspension dans un millilitre de tampon FACS frais et glacé par 5x10^7 cellules. Ensuite, étiquetez les cellules avec un à deux microgrammes de l’anticorps secondaire conjugué à la streptavidine approprié pendant 20 minutes dans l’obscurité sur de la glace et lavez les cellules deux fois de plus.

Pour l’enrichissement à base de nanoparticules magnétiques, remettez en suspension les fractions de cellules A, B et C dans un millilitre de tampon de séparation à froid par 5x10^7 cellules et filtrez les cellules à travers des passoires individuelles de 40 microlitres pour éliminer tout grumeau Ensuite, ajoutez les nanoparticules de colorant fluorescent à la concentration appropriée pendant 10 minutes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius avec rotation et lavez les échantillons deux fois dans un millilitre de tampon de séparation froid. Remettez les granulés en suspension dans un millilitre de tampon de séparation à froid par 5x10^7 cellules.

Ensuite, équilibrez trois colonnes magnétiques sur leurs aimants de taille appropriée avec trois millilitres de tampon de séparation chacune, permettant à tout le volume de tampon de séparation de traverser chaque colonne dans un conteneur à déchets. Placez maintenant un tube conique de 15 millilitres étiqueté sous chaque colonne et ajoutez les cellules marquées aux particules magnétiques dans leurs colonnes respectives. Lorsque tout le volume de chaque fraction cellulaire a traversé chaque colonne, ajoutez trois millilitres de tampon de séparation glacé frais au sommet de chaque colonne, en recueillant les effluents dans les tubes étiquetés.

Une fois que le deuxième lavage s’est complètement écoulé à travers les colonnes, placez les tubes de cellules sélectionnées négativement de chaque fraction sur de la glace et transférez les colonnes dans de nouveaux tubes de 15 millilitres pour chaque fraction. Remplissez chaque colonne avec environ six millilitres de tampon de séparation frais et plongez immédiatement le tampon à travers les colonnes pour recueillir les cellules liées magnétiquement. Ensuite, collectez les fractions cellulaires positives et négatives par centrifugation et mettez les granulés en suspension dans la solution appropriée pour l’analyse en aval prévue.

Dans ces graphiques, la fréquence des lymphocytes B réactifs à l’anatoxine tétanique chez une personne qui a été vaccinée pour la dernière fois contre le tétanos il y a plus d’une décennie démontre la capacité de cette méthode à être utilisée pour enrichir les cellules de liaison à l’anatoxine tétanique environ sept fois avec une pureté d’environ 4 %. Avant l’ajout de l’antigène biotinylé, la liaison de l’anatoxine tétanique est diminuée de 83 %, ce qui démontre la spécificité de la liaison de l’antigène. Lorsque l’antigène biotinylé est omis de la procédure, seulement 0,2 % des lymphocytes B se lient encore, probablement en raison de la liaison d’un antigène non tétanique dans l’absorbant.

Ces graphiques montrent comment la fréquence des lymphocytes B naïfs spécifiques de l’anatoxine tétanique à partir d’un échantillon de sang prélevé sept jours après la vaccination de rappel d’un sujet sain, passe de 84 % à 64 % après la dose de rappel. Alors que le pourcentage de populations de mémoire et de plasmablastes augmente de 16 % à 36 % et de zéro à 40 % respectivement. De plus, les données représentatives d’ELISPOT provenant d’un échantillon de sang périphérique prélevé sept jours après la dose de rappel chez un sujet sain illustrent le quadruplement de l’enrichissement de la fréquence des cellules sécrétant des anticorps anti-anatoxine tétanique observé dans les cellules B isolées se liant à l’anatoxine tétanique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en trois à quatre heures environ avec tous les contrôles appropriés. La méthode peut être combinée avec des tests secondaires, par exemple, le transfert de cellules dans des receveurs adoptés pour des études ultérieures du devenir et de la fonction cellulaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’enrichir des lymphocytes B rares se liant à l’antigène à partir du sang périphérique humain en utilisant les contrôles appropriés.