Name: Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de lantigène pour lanalyse des Phénotype et fonction (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez à isoler et enrichir les rares cellules B spécifiques d'antigène du sang périphérique humain à l'aide de nanoparticules magnétiques. Cette technique permet leur analyse phénotypique et fonctionnelle en immunologie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de FRDJ (1-2008-994, 27-2012-450) et des National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 et F30OD021477).

1. Isolement de PBMC humaines <ol><li> Recueillir 30-50 ml de sang à l&#39;aide de tubes de collecte de sang héparinisés. NOTE: La quantité de sang utilisée dépend de la question expérimentale particulière et la fréquence dans le sang des cellules B spécifiques de l&#39;antigène d&#39;intérêt. sang héparinisé peut être traité immédiatement ou légèrement secoué pendant une nuit à la température ambiante pendant le traitement le jour suivant. Le retard dans le traitement a très peu d&#39;effet sur l&#39;efficacité de l&#39;enrichissement et est associée à une perte minimale de viabilité. </li><li> Mélanger le sang entier 1: 1 avec stérile, du magnésium à température ambiante et exempte de calcium du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS). </li><li> Dans un tube conique stérile de 50 ml, ajouter 10 ml d&#39;une solution à gradient de densité à la température ambiante. Conserver les bouteilles de gradient de densité ouverts dans l&#39;obscurité à 4 ° C, mais réchauffer à la température ambiante avant utilisation. </li><li> Si possible mis le pistolet de pipette pour le réglage lent et / ou d&#39;appliquer très peu, et pourtant cohérente pression de déclenchement lentementcouche de 30-35 ml de sang dilué sur le dessus du gradient de densité, en faisant attention de ne pas mélanger les deux. REMARQUE: Placer la pointe de la pipette contre le bord des 50 ml conique tout en ajoutant le sang dilué contribuera à assurer un flux constant cohérente. </li><li> Centrifuger à 400 g pendant 30 min à 20 ° C avec le frein désactivé. </li><li> Retirer la couche supérieure, qui contient le plasma et les plaquettes, en faisant attention à ne pas perturber la couche de cellules mononucléaires ci-dessous. </li><li> En utilisant une pipette stérile, recueillir la couche de cellules mononucléaires (buffy coat) et placer dans un 50 ml tube conique stérile séparé. </li><li> Ajouter du PBS à la suspension cellulaire à un volume de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec frein. </li><li> Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 10 ml de PBS. Compter les cellules et déterminer la viabilité en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé. </li><li> Resuspendre les cellules à 10 7 cellules / ml et placer sur la glace jusqu&#39;à ce prêt pour un traitement ultérieur.</li></ol> 2. coloration des cellules <ol><li> Retirer 1-2 x 10 6 cellules pour chaque compensation de fluorescence / contrôle FMO nécessaire, le cas échéant. reste centrifugeuse de cellules à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein. </li><li> Resuspendre les cellules dans un tampon stérile filtré à froid FACS (PBS + 1% de sérum albumine bovine (BSA) + azoture de sodium 0,01%) à 3-6 x 10 7 cellules / ml (remove dans un tube de 1,5 ml par centrifugation). Assurez-vous que le tampon FACS est froid et le garder sur la glace tout au long de la procédure de coloration. <ol><li> Diviser la population de cellules en quarts (AD) lors de l&#39;optimisation du dosage. Utilisez fraction A pour enrichir les cellules B spécifiques de l&#39;antigène d&#39;intérêt, l&#39;utilisation des fractions B et C pour déterminer la spécificité de l&#39;enrichissement / coloration (voir 2.5 et 2.6 ci-dessous), et l&#39;utilisation fraction D pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules spécifiques de l&#39;antigène dans la population unenriched pour permettre le calcul du rendement et pliez-enrichissement. </li></ol></li><li> Ajouter FcyR re bloquant humainagent fractions AD sur la glace pour empêcher la liaison des anticorps aux récepteurs Fc. REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour les conditions appropriées. </li><li> Ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome à la cellule des antigènes de surface d&#39;intérêt pour les fractions AD pendant 30 min sur de la glace dans l&#39;obscurité, en faisant attention de ne pas inclure fluorochromes qui peuvent traverser réagir avec les anticorps de colorant anti-rouge lointain fluorescents couplés à des nanoparticules magnétiques. NOTE: Ce sont des conjugués d&#39;anticorps à infrarouge proche colorant fluorescent, Cy5, Cy5.5 et Cy7. Les taches de viabilité qui sont ajoutées doivent être compatibles avec l&#39;utilisation d&#39;un fixateur. Si l&#39;on n&#39;a pas l&#39;intention d&#39;analyser les cellules en utilisant FACS, mais de déterminer la fréquence d&#39;anticorps sécrétant, par exemple, par ELISPOT, coloration de la surface avec des anticorps est inutile. </li><li> Pour tester la spécificité du test, incuber la fraction B avec une quantité suffisante d&#39;antigène non marqué pendant 30 minutes sur de la glace, de telle sorte que la majorité des récepteurs avec une affinité d&#39;au moins10 -6 M sont bloqués. NOTE: En règle générale, une bonne concentration de départ est un 50-100 fois supérieure à la quantité d&#39;antigène jugé suffisant en 2.6 ci - dessous (par exemple 50-100 uM). Cela devrait bloquer toutes les cellules B ayant une forte affinité pour l&#39;antigène non marqué se lier à l&#39;antigène biotinylé, qui est ajouté à l&#39;étape 2.6 ci-dessous, permettant ainsi la confirmation de la spécificité des cellules enrichies. Cette étape peut être réalisée en conjonction avec l&#39;étape 2.4 ci-dessus. </li><li> Ajouter antigène biotinylé à Fractions A, B et D. Incuber sur la glace pendant 30 min. REMARQUE: La concentration d&#39;antigène biotinylé doit être ajustée pour déterminer la quantité optimale requise pour assurer la détection et la séparation des cellules de liaison de cellules de voisinage non spécifique suffisante. Généralement, une bonne concentration de départ à l&#39;essai est de 1-5 uM. NOTE: Pour les fractions A et D, cette étape peut être réalisée simultanément avec l&#39;étape 2.4 ci-dessus. Pour la fraction B, cette étape doit être effectuée après l&#39;étape 2.5 (lavage à l&#39;entrétapes een est inutile). </li><li> Omettre antigène biotinylé de Fraction C afin de déterminer toute liaison des cellules B à d&#39;autres réactifs dans le protocole, comme colorant rouge lointain fluorescent streptavidine et les billes magnétiques. </li><li> Laver les cellules deux fois par la suspension de cellules dans 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifugation à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Après le lavage final, diluer la suspension concentrée de cellules dans 1 ml de 2% formaldéhyde par 5 x 10 7 cellules et laisser reposer dans l&#39; obscurité sur la glace pendant 5 min. REMARQUE: La fixation des cellules à ce stade, en sorte que l&#39;antigène biotinylé reste lié à la RCB pour le reste de la procédure. Pour les cellules viables - pour l&#39;analyse en aval, par exemple dans ELISPOT ou les transferts adoptives, omettre l&#39;étape de fixation. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans 1 ml FACS froid tampon par 5 x 107 cellules. </li><li> Ajouter le colorant 1-2 pg streptavidine-rouge lointain fluorescent / ml et incuber sur de la glace pendant 20 minutes dans l&#39;obscurité. Titrer la quantité de streptavidine pour chaque application. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. préparation Fraction D est terminée à ce moment car il ne sera pas soumis à l&#39;enrichissement en utilisant les billes magnétiques. Remarque: Cet exemple sera utilisé pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules B spécifiques de l&#39;antigène dans l&#39;échantillon. Il sera utilisé pour déterminer le rendement et plier l&#39;enrichissement obtenu par enrichissement. </li></ol> 3. Magnetic Enrichissement à base de nanoparticules <ol><li> Resuspendre les cellules à partir d&#39; échantillons AC dans 1 ml de tampon froid de séparation (PBS + 0,5% de BSA + EDTA 2 mM) par 5 x 10 7 cellules et de passer à travers un filtre de 40 um pour éliminer les grumeaux qui pourraient obstruer la colonne. </li><li> Ajouter Anti-Cy5 / nanoparticules de colorant anti-rouge lointain fluorescentes. for des résultats optimaux, la concentration des nanoparticules doit être adaptée à chaque utilisation, mais un bon point de départ est de 50 pi de suspension par 5 x 10 7 cellules / ml. Tourner dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Laver deux fois avec 1 ml de tampon de séparation à froid à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon froid de séparation par 5 x 10 7 cellules. </li></ol> 4. Enrichissement magnétique utilisant LS ou Colonnes LD <ol><li> Placez trois LS ou des colonnes de LD dans le champ magnétique d&#39;un séparateur magnétique et ajouter 3 ml de tampon de séparation pour mouiller les colonnes (voir description du produit pour déterminer quel type de colonne est le mieux adapté). Autoriser tous les 3 ml de passer à travers la colonne et jeter après la collecte. REMARQUE: Bien que la séparation des cellules marquées de nanoparticules magnétiques peut être réalisée en utilisant l&#39;une quelconque des dispositifs de séparation magnétiques qui sont disponibles dans le commerce, le laboratoire a eu le plus de succès avec l&#39;utilisation de colonnes LS, in terms de rendement, la pureté et l&#39;efficacité de l&#39;enrichissement. </li><li> Placer les tubes coniques de 15 ml trois étiquetés &quot;Fraction A / (B) / (C) négative&quot;, pour les cellules sélectionnées négativement, sous la colonne. Ajouter la particule magnétique de cellules marquées à leur colonne respective et permettre à tout le volume de passer à travers. </li><li> Ajouter 3 ml de tampon de séparation à froid sur le dessus, et laisser ce passage à travers la colonne et répétez avec 2 ml. Recueillir les cellules sélectionnées négativement et mettre de côté sur la glace. </li><li> Retirer la colonne du champ magnétique et placer sur le dessus d&#39;un tube de 15 ml conique étiqueté &quot;Fraction A / (B) / (C) positif&quot;, pour les cellules sélectionnées positivement. </li><li> Remplir la colonne vers le haut avec environ 6 ml de tampon de séparation et immédiatement plonger ce volume à travers la colonne pour recueillir des cellules qui avaient liés au champ magnétique utilisant le piston fourni. </li><li> Pour augmenter la pureté, les cellules sélectionnées positivement peuvent être enrichis en utilisant une deuxième colonne de nettoyage, en répétant le procedure. </li><li> Faire tourner les deux fractions sélectionnées négativement et positivement à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C et à mettre en suspension dans un volume final désiré. Procéder à l&#39;analyse en aval, tels que FACS, ELISPOT ou transfert adoptif. </li></ol>

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<li>Doucett, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li>
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<li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li>
<li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+%28MACS%29+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici un nouveau procédé pour réaliser l&#39;isolement et l&#39;enrichissement de cellules B de liaison d&#39;antigène provenant du sang périphérique humain. Le procédé est facilement applicable à des souris et à d&#39;autres tissus, tels que les ganglions lymphatiques et la rate, et est compatible avec une analyse post-enrichissement du phénotype et la fonction (manuscrit en préparation) cellulaire. L&#39;utilisateur doit être conscient d&#39;un certain nombre de variables qui ...

Dilution limitante analyse de la fréquence des précurseurs de cellules sécrétant des anticorps ont suggéré que les cellules B réactives à un antigène particulier se produit typiquement à une fréquence de 0,05 à 0,005% dans le répertoire normal, en fonction de l&#39;état de vaccination et de la taille / nombre d&#39;épitopes présents sur l&#39;antigène. La faible fréquence de ces cellules, il a été difficile d&#39;étudier l&#39;évolution de leur état au cours du développement de réponses immunitaires, telles que la vaccination ou après une exposition à un antigène étranger, ou au cours du développement de l&#39;auto-immunité. Tri 1, 2, 3, 4, 5, 6 cellules Auparavant, les chercheurs ont entrepris l&#39; isolement des lymphocytes B de l&#39; antigène réactif en utilisant des techniques allant de l&#39; antigène revêtu des plaques ou des adsorbants des colonnes, à des globules rouges remise à zéro de l&#39; antigène revêtu, à activé par fluorescence. though ces techniques ont réussi à identifier et isoler les cellules de l&#39;antigène réactif B, les résultats ont varié en termes de rendement, la pureté et l&#39;évolutivité. Récemment, nous avons développé une nouvelle méthode à la fois de détecter et d&#39;enrichir rares sous-populations de lymphocytes B en utilisant des nanoparticules magnétiques. Le procédé permet l&#39;enrichissement avec un rendement relativement élevé et la pureté des grandes populations de départ, et est compatible avec l&#39;analyse des réponses à l&#39;antigène. En enrichissant des populations de cellules en suspension, le procédé élimine les contraintes qui sont associées à la géométrie des plaques ou des colonnes recouvertes d&#39;antigène, ce qui limite le débit. Enfin, étant donné que les cellules enrichies restent associées à l&#39;antigène et d&#39;un rapporteur fluorescent, ils peuvent être en outre purifiés par tri FACS. Comme décrit ici, nous avons utilisé cette approche pour l&#39;étude des cellules périphériques du tétanos du sang anatoxine réactif B avant et après la vaccination des sujets humains, ainsi que les cellules de autoantigène réactif B des sujets avec différents autoitroubles mmune, y compris le diabète de type 1, la maladie de Graves, et la maladie de Hashimoto 7. Le procédé fonctionne aussi bien chez la souris et l&#39;homme, et il est compatible avec une analyse des cellules présentatrices d&#39;antigène réactif B à partir d&#39;une variété de tissus (manuscrit en préparation). Dans son format de base, les cellules mononucléaires du sang périphérique sont d&#39;abord mises en incubation avec un antigène biotinylé avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface cellule requis pour l&#39;analyse phénotypique. Cette étape de marquage est suivie par le lavage et la fixation, et l&#39; addition de streptavidine couplée à un colorant rouge lointain fluorescent pour la détection des cellules de liaison biotinylé antigène (figure 1). Des études antérieures ont permis d&#39; identifier des cellules B spécifiques de l&#39; antigène d&#39;une manière similaire , mais en utilisant directement les antigènes conjugués à un fluorochrome 8, 9, 10, 11. Bien que ce soit un digneapproche, l&#39; utilisation d&#39;antigènes biotinylés en conjonction avec la streptavidine permet une plus grande amplification du signal ( et donc une meilleure différenciation des cellules non contraignantes de liaison et), en particulier lorsque les antigènes sont de petite taille 12, 13, 14. Une autre considération est l&#39;utilisation de la streptavidine à la place de l&#39;avidine, car streptavidine est déglycosylée, ce qui diminue la liaison non spécifique. En outre, on utilise un colorant rouge lointain fluorescent comme fluorochrome en raison de sa photostabilité, le rendement quantique (luminosité) et de sa petite taille (~ 1,3 kDa). Fluorochromes de protéines tels que la phycoérythrine (~ 250 kD) et allophycocyanine (~ 105 kD) 15 ne sont pas optimales , car ils contiennent potentiellement de nombreux épitopes antigéniques. Utilisation d&#39;un petit colorant organique fluorescent composé d&#39;un seul épitope, tel que le colorant rouge lointain fluorescent, réduit la complexité de la population cellulaire isolée. Une fois que les cellules sont biotinylées-antigen et adsorbé de colorant streptavidine rouge lointain fluorescent, ils sont enrichis en utilisant des nanoparticules magnétiques colorant conjugué anti-rouge lointain fluorescentes. Nanoparticules uniques ne sont pas détectés par la plupart des cytomètres de flux et donc ne doivent pas être enlevés avant la purification par FACS de tri et les essais en aval 16. sélection magnétique pour des cellules spécifiques de l&#39;antigène B enrichit la population d&#39;intérêt, éliminant ainsi le temps et le coût du tri des événements rares en utilisant un cytomètre de flux. Ci-dessous, nous montrons des résultats représentatifs de l&#39;enrichissement des cellules spécifiques anatoxine tétanique B à partir d&#39;un sujet avant et sept jours après la vaccination de rappel antitétanique. Nous avons choisi cette application particulière , par exemple , afin de démontrer la capacité de cette méthode pour enrichir les cellules spécifiques de l&#39; antigène B suivantes aiguë dans la stimulation in vivo. Lorsqu&#39;il est couplé avec la cytométrie de flux, ce procédé est capable d&#39;enrichir et de différencier naïve mémoire spécifique à un antigène, etcellules et plasmablaste B permet au chercheur de suivre l&#39;évolution de leur fréquence au fil du temps. En outre, nous avons inclus un autre dosage en aval possible, par exemple , un essai ELISPOT, ce qui démontre que les cellules conservent l&#39;aptitude à sécréter un anticorps suivant l&#39; enrichissement. Une autre application de cette méthode pourrait impliquer le transfert adoptif de cellules enrichies dans un hôte. Nous avons précédemment montré les cellules conservent l&#39;aptitude à agir en tant que cellules présentant un antigène à des lymphocytes T spécifiques de l&#39;antigène ci-après isolement et de transfert (données non présentées). Par conséquent, il existe un certain nombre d&#39;essais possibles en aval pouvant être couplé à la méthode qui informe ainsi la compréhension de la réponse immunitaire spécifique d&#39;un antigène. Nous avons décrit la méthode ci-dessous, y compris les contrôles pour déterminer le rendement global, la pureté, la spécificité cellulaire, et pliez-enrichissement.

<table><tbody><tr><td>Antigène d’intérêt</td><td>variable</td><td>variable</td><td>Au moins 100 &mu ; g pour biotinyler facilement ; si vous utilisez des protéines, essayez d’utiliser des protéines qui ont été validées par ELISA. Il doit s’agir d’un transporteur. Sans protéines.</td></tr><tr><td>Biotine pour l’étiquetage ; par exemple EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotine</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>La biotine est disponible dans différentes formulations, telles que celles contenant des entretoises de différentes longueurs, de sorte que le type utilisé doit être déterminé par le chercheur</td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S21374</td><td>Peut obtenir d’autres fournisseurs.</td></tr><tr><td>Microbilles Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-395</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Séparateurs manuels MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>variable</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Diluer à 2 % avec PBS</td><td></td><td></td> ; facultatif si le test en aval nécessite des cellules</tr><tr><td>vivantes PBS sans calcium ni magnésium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Sang total en tubes</td><td></td><td></td><td></td>de prélèvement héparinés</tr><tr><td>Tampon FACS (PBS + 1 % BSA + 0,01 % d’azoture de sodium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de séparation (PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubes</td><td></td><td></td><td></td>coniques</tr><tr><td>15 ml Tubes</td><td></td> coniques<td></td><td></td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td><td>Eppendorf de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Anticorps réactifs marqueurs de surface, Fc Block, coloration discriminante vivante/morte, si nécessaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELISPOT fournit, si nécessaire</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection et enrichissement des rares cellules b spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des phénotype et fonction

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

<classe p = 'jove_content'> cellules B réactives avec un antigène spécifique se produisent généralement à une fréquence de <0,05 % des lymphocytes. Pendant des décennies, les chercheurs ont cherché des méthodes pour isoler et enrichir ces cellules rares pour étudier leur phénotype et leur biologie. Les approches sont inévitablement basées sur le principe que les lymphocytes B reconnaissent l’antigène natif en vertu de récepteurs de surface cellulaire représentatifs en spécificité des anticorps qui seront éventuellement sécrétés par leurs filles différenciées. L’approche la plus évidente du problème consiste peut-être à utiliser des antigènes conjugués au fluorochrome en conjonction avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Cependant, l’utilité de ces méthodes est limitée par la fréquence des cellules et le taux d’analyse et d’isolement réalisable par tri électronique. Une nouvelle méthode d’enrichissement de lymphocytes B rares spécifiques de l’antigène à l’aide de nanoparticules magnétiques qui permet un enrichissement à haut rendement des lymphocytes B réactifs à l’antigène à partir de grandes populations de cellules de départ est décrite. Cette méthode permet d’améliorer le suivi du phénotype et de la biologie des cellules réactives à l’antigène avant et après la rencontre in vivo de l’antigène, par exemple après l’immunisation ou pendant le développement de l’auto-immunité.

Analyse de la pureté, le rendement, et pliez-enrichissement par cytométrie de flux Les populations enrichies comme décrit ci-dessus contiennent inévitablement des cellules contaminantes qui ne sont pas liés colorant streptavidine rouge lointain fluorescent mais sont piégés dans la matrice. Ces impuretés peuvent être retirées de populations enrichies par tri FACS. Pour estimer la pureté des populations enrichies, porte sur des cel...

Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l&#39;analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l&#39;antigène pour l&#39;analyse des Phénotype et fonction

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Le but global de cette procédure simple mais efficace est d'isoler et d'enrichir des lymphocytes B rares liant l'antigène à partir du sang périphérique humain, en utilisant des nanoparticules magnétiques pour leur analyse phénotypique et fonctionnelle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie concernant le phénotype et la biologie des lymphocytes B rares liant l'antigène, tant avant qu'après la rencontre in vivo avec l'antigène. Le principal avantage de cette technique est qu'elle élimine les problèmes liés à la géométrie, notamment lorsqu'on utilise une plaque en styrène ou une grosse bille.Et cela élimine les problèmes liés au débit lorsqu'on isole des cellules par cytométrie en flux afin d'isoler des cellules rares au sein de populations cellulaires initiales assez importantes. Immédiatement après avoir prélevé 30 à 50 millilitres de sang total dans des tubes de prélèvement sanguin héparinés, mélanger le sang selon un ratio de 1:1 avec du PBS stérile, sans magnésium ni calcium, à température ambiante. Ensuite, déposer délicatement le mélange sanguin en couche supérieure sur 10 millilitres de solution de gradient de densité à température ambiante, dans un tube conique stérile de 50 millilitres, en utilisant une pression lente et constante sur la poire de pipetage.Séparer les cellules par centrifugation. Éliminer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes, puis utiliser une pipette stérile pour transférer le culot de cellules mononucléées, appelé couche de Défense, dans un nouveau tube stérile de 50 millilitres. Remplir le tube avec jusqu'à 50 millilitres de PBS afin de laver les cellules mononucléées par centrifugation.Ensuite, resuspendre le culot dans 10 millilitres de PBS frais pour le comptage et ajuster la concentration cellulaire à 1x10^7 cellules par millilitre dans du PBS frais sur glace. Pour marquer les cellules en vue de la liaison à des billes magnétiques, transférer d'abord des aliquotes de 1-2x10^6 cellules dans des tubes en polystyrène de 5 millilitres, pour chaque contrôle de compensation de fluorescence et de type Fluorescence Minus One, selon les besoins. Ensuite, récupérer le reste de l'échantillon cellulaire par centrifugation et resuspendre le culot à une concentration de 3-6x10^7 cellules par millilitre dans du tampon FACS stérile filtré et froid.Répartir équitablement la solution cellulaire dans quatre tubes FACS placés sur de la glace et ajouter le réactif de blocage du récepteur Fc gamma humain à ces quatre fractions d'échantillons expérimentaux. À la fin de l'incubation de blocage de la liaison non spécifique, ajouter les anticorps marqués par fluorescence appropriés pour la coloration de la surface cellulaire aux cellules des quatre fractions d'échantillons. Ensuite, ajouter l'antigène biotinylé approprié aux fractions A et D, puis ajouter un volume suffisant d'antigène non marqué à la fraction B de manière à bloquer la majorité des récepteurs ayant une affinité d'au moins 1x10^6 molaire.Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes sur de la glace, puis effectuer une incubation de 30 minutes de la fraction B avec l'antigène biotinylé approprié. À la fin des incubations, laver les cellules deux fois dans un millilitre de tampon FACS froid par 5x10^7 cellules. Resuspendre ensuite les culots dans un millilitre de formaldéhyde à 2 % par 5x10^7 cellules pendant cinq minutes à l'abri de la lumière sur de la glace.Après la fixation, laver les cellules deux fois supplémentaires comme vient d'être démontré. Resuspendre ensuite les culots dans un millilitre de tampon FACS frais et glacé par 5x10^7 cellules. Incuber ensuite les cellules avec un à deux microgrammes d'anticorps secondaire conjugué à la streptavidine approprié pendant 20 minutes à l'abri de la lumière sur glace, puis laver les cellules deux fois supplémentaires.Pour l'enrichissement à base de nanoparticules magnétiques, resuspendre les fractions cellulaires A, B et C dans un millilitre de tampon de séparation froid par 5x10^7 cellules et filtrer les cellules à travers des filtres individuels de 40 microlitres afin d'éliminer tous les agrégats. Ensuite, ajouter les nanoparticules marquées avec le colorant fluorescent à la concentration appropriée pendant 10 minutes à l'obscurité à quatre degrés Celsius avec agitation rotative, puis laver les échantillons deux fois dans un millilitre de tampon de séparation froid. Resuspendre les culots dans un millilitre de tampon de séparation froid par 5x10^7 cellules.Ensuite, équilibrez trois colonnes magnétiques sur leurs aimants de taille appropriée avec trois millilitres de tampon de séparation chacune, en laissant l'ensemble du volume de tampon de séparation traverser chaque colonne et s'écouler dans un récipient de déchets. Placez maintenant un tube conique de 15 millilitres étiqueté sous chaque colonne et ajoutez les cellules marquées par des particules magnétiques sur leurs colonnes respectives. Lorsque l'ensemble du volume de chaque fraction cellulaire a traversé chaque colonne, ajoutez trois millilitres de tampon de séparation frais glacé au sommet de chaque colonne, en récupérant les effluents dans les tubes étiquetés.Une fois que le deuxième lavage a complètement traversé les colonnes, placez les tubes contenant les cellules sélectionnées négativement de chaque fraction sur de la glace et transférez les colonnes dans de nouveaux tubes de 15 millilitres pour chaque fraction. Remplissez chaque colonne avec environ six millilitres de tampon de séparation frais et faites immédiatement passer le tampon à travers les colonnes afin de récupérer les cellules liées magnétiquement. Ensuite, récupérez les deux fractions cellulaires, positive et négative, par centrifugation et remettez en suspension les culots dans la solution appropriée pour l'analyse en aval prévue.Dans ces graphiques, la fréquence des cellules B réactives au toxoïde tétanique provenant d’un individu ayant reçu son dernier vaccin contre le tétanos il y a plus de dix ans illustre la capacité de cette méthode à enrichir environ sept fois les cellules se liant au toxoïde tétanique, avec une pureté d’environ 4 %. L’ajout d’un excès de 50 fois de toxoïde tétanique non marqué aux cellules provenant d’un sujet vacciné environ trois ans avant le prélèvement sanguin, avant l’ajout de l’antigène biotinylé, réduit la liaison au toxoïde tétanique de 83 %, démontrant ainsi la spécificité de la liaison de l’antigène. Lorsque l’antigène biotinylé est omis lors de la procédure, seulement 0,2 % des cellules B se lient encore, reflétant vraisemblablement la liaison de certains antigènes non tétaniques dans l’adsorbant.Ces graphiques montrent comment la fréquence des cellules B naïves spécifiques de l'anatoxine tétanique, provenant d'un échantillon sanguin prélevé sept jours après la vaccination de rappel d'un sujet sain, diminue de 84 % à 64 % après le rappel. Parallèlement, le pourcentage des populations de cellules B mémoires et de plasmablastes augmente respectivement de 16 % à 36 % et de zéro à 40 %. De plus, des données représentatives de test ELISPOT provenant d'un échantillon de sang périphérique obtenu sept jours après le rappel chez un sujet sain illustrent l'enrichissement par un facteur quatre de la fréquence des cellules sécrétant des anticorps anti-anatoxine tétanique, observé dans les cellules B liant l'anatoxine tétanique isolées.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures environ, en incluant toutes les contrôles appropriés. La méthode peut être combinée à des tests secondaires, par exemple, le transfert de cellules dans des receveurs adoptifs pour des études ultérieures du destin et de la fonction cellulaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et enrichir des cellules B rares liant un antigène à partir du sang périphérique humain en utilisant les contrôles adéquats.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette procédure décrit la détection et l'isolement des leucocytes TH17 souris qui sécrètent activement l'IL-17 après stimulation.

Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices

Ce protocole décrit l'utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d'épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l'étude directe des populations de cellules T endogènes d'intérêt...

Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

Cette vidéo montre l’utilisation du test ELISpot pour évaluer la fonction des lymphocytes B sécrétant des anticorps, les ASC. Les anticorps sécrétés par les ASC interagissent avec les fragments d’anticorps polyclonaux liés à la membrane, qui sont détectés par les anticorps IgG ou IgM conjugués aux enzymes. La tache colorée produite dans chaque puits indique la présence de l'isotype spécifique de l'anticorps, qui est en corrélation avec l'activité sécrétoire des lymphocytes B.

Évaluation fonctionnelle des lymphocytes B sécrétant des anticorps à l’aide du dosage ELISpot

Sang total L’immunophénotypage est indispensable pour surveiller le système immunitaire humain. Cependant, le nombre de réactifs nécessaires et l’instabilité de fluorochromes spécifiques dans les cocktails prémélangés nécessitent une préparation quotidienne des réactifs. Nous montrons ici que la préparation semi-automatisée d’un cocktail d’anticorps de coloration permet d’établir un immunophénotypage fiable en minimisant la variabilité de la distribution des réactifs.

Une approche semi-automatique pour la préparation des anticorps Cocktails pour immunophénotypique Analyse de sang périphérique humain

Le sang périphérique humain est couramment utilisé pour l’évaluation de la réponse immunitaire humorale. Ici, les méthodes permettant d’isoler les lymphocytes B humains du sang périphérique, de différencier les lymphocytes B humains en cellules B sécrétant des anticorps (AB) en culture et d’énumérer les ASC IgM et IgG totales via un test ELISpot sont décrites.

L&#39;isolement, la différenciation, et la quantification des anticorps humain sécrétant des cellules B du sang: ELISpot comme indicateur fonctionnel de humorale Immunité

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Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Nous décrivons ici une approche protéomique unicellulaires Evaluer immunitaire phénotypique et fonctionnelle (induction de cytokines intracellulaires) des altérations dans les échantillons de sang périphérique, analysés par cytométrie en masse.

Analyse unicellulaires lymphoblastiques et Production de cytokines dans le sang périphérique par cytométrie de flux massique

Lymphocytes T antigène-spécifiques sont difficiles à caractériser ou utiliser dans les thérapies en raison de leur fréquence extrêmement basse. Ici, nous fournissons un protocole visant à développer une particule magnétique qui peut lier aux cellules T spécifiques de l’antigène à enrichir ces cellules, puis d’en faire plusieurs techniques pour la caractérisation et le traitement.

Enrichir et élargir les cellules rares T antigène-spécifiques avec des nanoparticules magnétiques

La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

Méthode de dépistage à cellule unique pour la sélection et la récupération d'anticorps ayant les spécificités souhaitées des populations enrichies de cellules de la mémoire humaine B

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Apprenez à isoler et enrichir les rares cellules B spécifiques d'antigène du sang périphérique humain à l'aide de nanoparticules magnétiques. Cette technique permet leur analyse phénotypique et fonctionnelle en immunologie.

Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l'antigène pour l'analyse des Phénotype et fonction

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