Name: Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de Clostridium difficile En réponse au traitement antibiotique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie microbiologique combinant microscopie électronique à balayage et culture cellulaire in vitro pour observer les effets morphologiques des antibiotiques sur Clostridium difficile. Cette technique améliore la compréhension de l'action pharmacologique.

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Ces expériences ont été soutenues par des subventions de recherche de Merck and Co. et de Summit, PLC.

1. Isoler C. difficile à partir de différentes sources environnementales ou cliniques <ol><li> Isolats environnementaux: À l&#39;aide d&#39;une jauge de coton pré-stérilisée (légèrement mouillée avec NaCl à 0,85%), tamponnez la surface de toute zone d&#39;intérêt (plancher, porte, poignée, étagère, etc. ). 8 Assurez-vous de porter des gants stériles et placez l&#39;écouvillon dans un tube stérilisé après avoir terminé. </li><li> Isolats cliniques (selles): Planter 10 à 100 mg d&#39;échantillons cliniques de selles sur agar de céfoxitine-cyclosérine-fructose (CCFA) en utilisant une boucle d&#39;inoculation et incuber dans des conditions anaérobies strictes pendant 48 à 72 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures. 7 , 9 , 10 </li><li> Enrichir les échantillons d&#39;écouvillons environnementaux dans le bouillon de perfusion cardiaque (BHI) avec 0,05% de taurocholate de sodium et placer dans une chambre anaérobie à 37 ° Cpendant 5 jours. Centrifuger 1 mL de la culture à 10 000 xg et remettre en suspension le culot dans 100 μl d&#39;éthanol. </li><li> Placer les cellules remises en suspension (50 μL) sur des plaques d&#39;agarose de cycloserincéfoxitine-fructose (CCFA) et incuber dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 40 à 48 h. Conserver les colonies isolées de C. difficile dans des cryogénies à -80 ° C pour des analyses ultérieures. </li><li> Testez les colonies soupçonnées de C. difficile en utilisant le réactif d&#39;agglutination au latex ou la PCR. </li></ol> 2. Cultures de C. difficile et Killing Kinetic Procedures <ol><li> Cultiver des souches environnementales ou cliniques de C. difficile purifiées sur des plaques d&#39;agar de sang dans une chambre anaérobie à 37 ° C pendant 48 h. </li><li> Prendre une colonie isolée avec une boucle d&#39;inoculation, la transférer dans 5 mL de milieu BHI dans un tube de 15 mL, et faire pousser pendant 24 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C. </li><li> Diluer les pré-cultures 1: 100 à environ 10 6 unités de formation de coloniesS (CFU) / ml dans du nouveau BHIS pré-réduit (BHI plus 5 g / L d&#39;extrait de levure et 1% de L-cystéine) complété par 0,1% de taurocholate de sodium et la concentration appropriée d&#39;antibiotique (T0). </li><li> Recueillir un échantillon de 1 mL avec une pipette à chaque point de temps (T0, T6, T24, T48) et déposer une petite aliquote (100 μL dans les dilutions en série) sur une plaque d&#39;agar de sang. Laissez les cellules pousser sur la plaque d&#39;agar de sang pendant 48 h dans une chambre anaérobie à 37 ° C et comptez le nombre de colonies qui en résulte pour déterminer l&#39;UFC. </li></ol> 3. Préparation d&#39;échantillons pour la microscopie électronique à balayage <ol><li> Recueillir 1 mL de cellules de chaque point de temps dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min. Jeter le surnageant et laver les cellules dans le PBS. </li><li> Centrifuger les échantillons à 10 000 xg pendant 10 min à nouveau et jeter le surnageant. Ré-diluer les cellules dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% et incuber pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Centrifuger les échantillons à nouveau pendant 10 min à 10,000 xg et jeter le surnageant. Laver les cellules deux fois avec de l&#39;eau distillée et rediluer dans 100 μl d&#39;eau distillée. Régler le volume en fonction de la turbidité de la solution. REMARQUE: la réalisation de plusieurs dilutions en série est une bonne idée. </li><li> Relancez les lamelles et ajoutez 40 μL de l&#39;échantillon. Incuber pendant 15 minutes dans un capot d&#39;écoulement pour évaporer le liquide et permettre aux cellules d&#39;adhérer à la lamelle. Si le liquide est encore présent, utilisez un ventilateur pour enlever le liquide. </li><li> Placez des lamelles étiquetées avec des cellules dans une machine de pulvérisation de bureau et de ruban adhésif. Assurer l&#39;or pur dans la machine à pulvériser. Mettre la machine sous tension et commencer la pulvérisation à basse pression (50 mTorr). Couvrir les cellules pendant 30 s à 80 mA, ce qui se traduit par 20 nm de revêtement doré. </li><li> Transférer les cellules revêtues au microscope électronique à balayage. </li></ol> 4. Imagerie des cellules C. difficile sur un microscope électronique à balayage <ol><li> Vent le microscope électronique à balayage (SEM) correctement par prEn utilisant le bouton de ventilation du logiciel. </li><li> En utilisant du ruban adhésif en carbone, fixez les lamelles couchées sur le plateau métallique. Une fois que le SEM est ventilé, la porte devrait s&#39;ouvrir facilement. Verrouillez la platine métallique dans la chambre SEM en la vissant. </li><li> Cliquez sur le bouton POMPE du logiciel. Le SEM sera utilisable lorsque le système lit &quot;Vac OK&quot;. </li><li> Cliquez sur le détecteur SE sous l&#39;onglet des détecteurs. Allumez le faisceau en cliquant sur le bouton qui affiche la tension. Démarrez l&#39;imagerie à une tension inférieure (5 kV) avant d&#39;augmenter la tension (jusqu&#39;à 15 kV). Une image apparaît après la mise sous tension du faisceau. </li><li> En utilisant la fonction de suivi, trouvez une zone sur les lamelles couchées sur l&#39;image. Zoomer dans la région et trouver des structures en forme de tige; Ce sont clostridium difficile . </li><li> Ajustez et concentrez l&#39;image pour étalonner le système. Cela devrait se faire à plusieurs distances de travail: 15, 9 et 5 mm. Image à une distance de travail de 5 mm. </li><li> Allume toiLtra haute résolution et commence à se concentrer et à optimiser l&#39;astigmatisme. </li><li> Commencez à vous concentrer à un haut grossissement. Utilisez les touches grossières et fines pour cela. Ajustez l&#39;astigmatisme aussi bien pour obtenir une image plus claire. <ol><li> Ajuster l&#39;astigmatisme à un haut grossissement. Pour ce faire, ajustez les bascules d&#39;astigmatisme (elles ressemblent aux bascules de mise au point fine / grossière) et vérifiez l&#39;image pour plus de clarté en zoomant numériquement sur le logiciel. </li></ol></li><li> Se la fonction de balayage lent pour collecter une image de haute qualité. Enregistrez l&#39;image collectée en tant que fichier .TIFF, qui sera utilisé pour l&#39;analyse. Assurez-vous que la barre de données est sélectionnée si des mesures seront effectuées lors de l&#39;analyse. </li><li> Collectez des images à différents angles (jusqu&#39;à 52 ° en tournant manuellement l&#39;angle directement sur le SEM. Les images en angle tendent à révéler des informations plus approfondies. </li><li> Modifiez la tension du faisceau en fonction des cellules en cours d&#39;image. Conservez ceci principalement entre 5 à 15 kV pour toutes les expériences. </li&gt; <li> Une fois l&#39;image terminée, éteignez le faisceau et augmentez la distance de travail à 20 mm. La chambre peut ensuite être évacuée et la scène peut être retirée. Copiez toutes les images sur un lecteur pour une analyse plus approfondie. </li></ol> 5. Traitement et analyse d&#39;images <ol><li> Téléchargez et installez le logiciel librement disponible, FIJI (http://fiji.sc), sur l&#39;ordinateur. </li><li> Ouvrez le fichier image dans FIJI. </li><li> En utilisant la fonction de ligne, tracez précisément la barre d&#39;échelle. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet Analyser dans le programme FIJI et enfin sélectionnez la fonction Sélectionner l&#39;échelle. Une fenêtre apparaîtra qui nécessitera le réglage de la distance connue en fonction de la barre d&#39;échelle. Modifiez également l&#39;unité de longueur et cliquez sur OK. </li><li> Maintenant que le programme est calibré pour la distance, utilisez la fonction de ligne pour mesurer la longueur de la cellule. Pour obtenir la longueur, utilisez la fonction de ligne pour retrouver la totalité de la cellule. Sélectionnez l&#39;onglet Analyser à nouveau, puis cliquez sur Mesurer. L&#39;application doit être longueOreille dans les unités indiquées précédemment. </li></ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
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<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

KWG a reçu le soutien passé et actuel de Merck & Co. et de Summit, PLC.

L&#39;objectif de l&#39;étude actuelle était de créer une méthode à haut débit pour isoler C. difficile et tester la sensibilité aux antibiotiques à l&#39;aide d&#39;une microscopie électronique à balayage (SEM) comme moyen pour une caractérisation plus approfondie de l&#39;action pharmacologique de l&#39;antibiotique. En utilisant les protocoles décrits ici, nous avons démontré que l&#39;imagerie de la réponse phénotypique de la cellule au traitement antibiotique peut révéler un aperçu de l&#39;action pharmaco...

Clostridium difficile est une bactérie bactérienne positive aux grammes, qui provoque environ 500 000 infections chaque année aux États-Unis et est considéré comme un agent pathogène urgent pour les niveaux de menace par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC), le plus haut niveau de risque. 1 La dernière décennie a connu un développement considérable de médicaments chez les antimicrobiens ayant une activité contre C. difficile . 2 , 3 Les études in vitro sont une composante nécessaire du processus de développement de médicaments. 4 Traditionnellement, les études de susceptibilité et de mortalité in vitro sont utilisées pour valider les futures études animales et autres études in vivo . Bien que ces méthodes jouent un rôle important pour évaluer les actions de destruction, elles ne captent pas la réponse phénotypique des cellules au traitement pharmacologique. En incorporant la microscopie électronique à balayage (SEM) avec standarEn cas d&#39;études cinétiques, une caractérisation plus complète des effets directs des antibiotiques est possible. 5 , 6 , 7 Ici, nous présentons une méthode où la SEM est utilisée comme moyen de profiler l&#39;efficacité du traitement antibiotique.

<table><tbody><tr><td>gaze de coton&nbsp ;</td><td>Caring</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Cerveau-Cœur (BHI)&nbsp ;</td><td>Critère</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>Critère</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>taurocholate de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18346</td><td></td></tr><tr><td>chambre anaérobie</td><td>Coy</td><td></td><td>chambre anaérobie vinyle</td></tr><tr><td>cyclosérinecéfoxitine gélose au fructose (CCFA) plaques</td><td>Anaérobie</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>plaques de gélose sanguine</td><td>Hardy diagnostics</td><td>A-10</td><td></td></tr><tr><td>réactif d’agglutination au latex</td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. diff kit de test</td></tr> tubes <tr><td>de microcentrifugation Eppendorf</td><td></td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td>lames de microscope</td><td>J. Melvin affranchi marque</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>hotte d’écoulement</td><td>Labconco</td><td>Classe II type A2&nbsp ;</td><td>enceinte de biosécurité</td></tr><tr><td>machine à pulvériser pour bureau</td><td>Denton Vacuum</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>tape Plastic Core</td><td>05072-AB</td><td>SPI Double Face Adhesive Carbon Tape</td></tr><tr><td>gold</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375" Diamètre x .002" Microscope électronique à balayage à feuille d’or épaisse</td></tr><tr><td></td><td>FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; clostridium difficile</em&gt; en réponse au traitement antibiotique

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

L&#39;évaluation de l&#39;action antibiotique avec un nouveau développement de médicament dirigé contre la bactérie anaérobie est difficile et techniquement exigeante. Pour obtenir un aperçu du MOA possible, les changements morphologiques associés à l&#39;exposition aux antibiotiques peuvent être visualisés à l&#39;aide d&#39;une microscopie électronique à balayage (SEM). L&#39;intégration de l&#39;imagerie SEM avec des courbes de destruction traditionnelles peut améliorer notre vision de l&#39;action antidrogue et favoriser le processus de développement de médicaments. Pour tester cette prémisse, les courbes de tuer et les études SEM ont été menées en utilisant des médicaments connus mais différents MOA (vancomycine et métronidazole). Les cellules de C. difficile (R20291) ont été cultivées avec ou sans antibiotiques pendant jusqu&#39;à 48 h. Tout au long de l&#39;intervalle de 48 h, les cellules ont été recueillies à plusieurs moments pour déterminer l&#39;efficacité des antibiotiques et pour l&#39;imagerie sur la SEM. Conformément aux rapports précédents, la vancomycine et le métronidazole ont eu une activité bactéricide significative après 24 heures de traitement, tel que mesuré par un pays de l&#39;unité de colonisation (CFU)Ting. En utilisant l&#39;imagerie SEM, nous avons déterminé que le métronidazole avait des effets significatifs sur la longueur de la cellule (&gt; réduction de 50% de la longueur de la cellule pour chaque antibiotique, P &lt;0,05) par rapport aux témoins et à la vancomycine. Alors que la réponse phénotypique au traitement médicamenteux n&#39;a pas été documentée précédemment de cette manière, elles sont compatibles avec le MOA du médicament démontrant la polyvalence et la fiabilité de l&#39;imagerie et des mesures et l&#39;application de cette technique pour d&#39;autres composés expérimentaux.

Clostridium difficile est une bactérie formant des spores et il est donc essentiel de déterminer les différences de morphologie entre les cellules végétatives et les spores avant toute analyse fonctionnelle. La figure 1 illustre les images représentatives des cellules végétatives qui ont été capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance et des cellules de spores. Comme représenté, les cellules végétatives sont longues, lisses, en forme de t...

L’efficacité des antibiotiques est le plus souvent déterminée en effectuant des études cinétiques de destruction et en mesurant les unités formant colonies (UFC). En intégrant la microscopie électronique à balayage (MEB) à ces méthodes standard, nous pouvons distinguer les effets pharmacologiques du traitement entre différents antibiotiques.

Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En réponse au traitement antibiotique

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

L'objectif général de cette méthode d'imagerie microbiologique est de fournir un moyen plus descriptif de distinguer les effets phénotypiques d'un traitement pharmacologique. Cette méthode peut donc vraiment aider dans le domaine des maladies infectieuses, en particulier en étudiant les effets morphologiques de certains antibiotiques et la manière dont ils tuent le C.Difficile.Le principal avantage de cette technique est qu'elle combine l'imagerie à haute résolution avec des techniques de culture cellulaire in vitro afin de fournir une vue détaillée de l'action bactéricide des produits pharmaceutiques. L'application de cette technique pourrait s'étendre au traitement de l'infection à Clostridium difficile, ou CDI en abrégé. La raison en est que cette technique pourrait offrir un moyen d'identifier comment un antibiotique peut être bénéfique pour traiter la CDI.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'action pharmacologique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les modèles de culture mixte ou les études animales in vivo. En général, les chercheurs éprouvent des difficultés avec cette nouvelle méthode car la culture de C.difficile et l'utilisation d'un microscope électronique à balayage sont complexes. Nous avons eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous essayions de distinguer entre les modes d'action de différents antibiotiques.J'aimerais vous présenter l'équipe de recherche que vous allez rencontrer aujourd'hui. Jahangir Alam est professeur et microbiologiste. Il coordonne toutes les activités de laboratoire que vous verrez aujourd'hui.Tasnuva Rashid est étudiante diplômante dans le laboratoire. Elle effectue une grande partie de la microbiologie au quotidien. Eugenie Bassere est chercheuse postdoctorale.Elle a vraiment enseigné à Tasnuva bon nombre de compétences et aide également au laboratoire. Brad Endres est un autre postdoctorant du laboratoire. Il effectuera de nombreuses analyses en microscopie avec l'aide de Long Chang.Pour préparer des isolats environnementaux tout en portant des gants stériles, utilisez un tampon en coton pré-stérilisé pour prélever la surface de toute zone d'intérêt, telle qu'un sol, une porte, une poignée ou une étagère. Ensuite, placez le tampon dans un tube stérilisé. Changez de gants entre chaque échantillon.Pour préparer les isolats cliniques, utilisez un anneau d'inoculation pour ensemencer de 10 à 100 milligrammes d'échantillons fécaux cliniques sur un milieu gélosé au cefoxitin cyclosérine fructose, ou CCFA, et incuber les échantillons dans des conditions strictement anaérobies pendant 48 à 72 heures. Conservez les colonies isolées du stock de C. Difficile dans des tubes cryogéniques à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures. Enrichissez les échantillons prélevés par écouvillonnage environnemental dans un bouillon infusion cerveau-cœur, ou BHI, contenant 0,5 % de taurocholate de sodium, puis placez les échantillons dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant cinq jours.Centrifuger un millilitre de la culture à 10 000 ×g et utiliser 100 microlitres d'éthanol pour resuspendre le culot. Déposer 50 microlitres des cellules resuspendues sur des boîtes de gélose CCFA et incuber les cultures dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures. Conserver les colonies isolées de la souche de C. difficile dans des tubes cryogéniques à moins 80 degrés Celsius pour des analyses ultérieures.Utilisez le réactif d'agglutination au latex ou la PCR pour tester les colonies suspectées de C.difficile. Faites croître des souches purifiées de C.difficile d'origine environnementale ou clinique sur des géloses au sang dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Utilisez une anse d'inoculation pour prélever une colonie isolée et transférez-la dans cinq millilitres de milieu BHI dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, faire croître la culture dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Utiliser du BHIS frais, pré-réduit, supplémenté en taurocholate de sodium et en concentration appropriée d'antibiotique, pour diluer les pré-cultures d'un facteur 1 à 100 jusqu'à environ 10 puissance six UFC par millilitre. À l'aide d'une pipette, prélever un échantillon d'un millilitre à chaque point temporel et ensemencer ou étaler une petite aliquote sur une gélose au sang.Incuber la plaque pendant 48 heures dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius et compter le nombre de colonies obtenu pour déterminer les UFC. Prélever un millilitre de cellules à chaque point temporel dans des tubes de microcentrifugation et centrifuger à 10 000 × g pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et laver les cellules avec du PBS.Faire une nouvelle centrifugation des échantillons et éliminer le surnageant. Ensuite, utiliser un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % pour rediluer les cellules et incuber les tubes à température ambiante pendant une heure. Après une nouvelle centrifugation des échantillons et l’élimination du surnageant, laver les cellules deux fois avec de l’eau distillée avant de les rediluer dans 100 microlitres d’eau distillée.Ajustez le volume en fonction de la turbidité de la solution. Après avoir étiqueté les lamelles, ajoutez 40 microlitres de l'échantillon dessus. Dans une hotte à flux laminaire, incubez les lamelles pendant 15 minutes afin d'évaporer le liquide et permettre aux cellules d'adhérer au verre.Si du liquide est encore présent, utilisez un souffleur pour l'éliminer. Placez les lamelles dans une machine à pulvérisation cathodique de bureau et fixez-les avec du ruban adhésif. Fixez de l'or pur dans la machine à pulvérisation cathodique.Ensuite, allumez la machine et commencez le pulvérisation sous basse pression. Recouvrez les cellules pendant 30 secondes à 80 microampères, ce qui correspond à un dépôt de 20 nanomètres d'or. Pour commencer l'observation, purgez d'abord correctement le MEB dans le logiciel informatique en appuyant sur le bouton Vent.Après avoir recouvert les cellules, transférez-les au microscope électronique à balayage, ou MEB. À l’aide du ruban de carbone, fixez les lamelles recouvertes sur la platine métallique. Une fois que le MEB est mis sous pression ambiante, la porte doit s’ouvrir facilement.Fixez la platine métallique dans la chambre du MEB en la vissant. Ensuite, cliquez sur le bouton Pomper dans le logiciel. Lorsque le système indique que tout est en ordre, le MEB sera prêt à l'emploi.Sous l'onglet Détecteur, cliquez sur le détecteur SE. Activez le faisceau en cliquant sur le bouton qui affiche la tension. Commencez l'acquisition d'images à une tension plus faible avant d'augmenter la tension.Une image apparaîtra une fois le faisceau activé. À l’aide de la fonction de suivi, repérez une zone sur les lamelles recouvertes à imager. Zoomez sur la région et identifiez des structures en forme de bâtonnets, qui représentent Clostridium difficile.Pour étalonner le système, zoomez, faites un réglage grossier de la mise au point de l'image, puis liez Z à la distance de travail libre. Cette opération doit être effectuée à plusieurs distances de travail, par exemple à 15, 9 et 5 millimètres. Ensuite, passez en mode d'imagerie ultrarésolue.Utilisez les commandes de réglage grossier et fin pour commencer à focaliser à fort grossissement. Ajustez les commandes d'astigmatisme pour obtenir une image plus nette, et vérifiez la netteté de l'image à l'aide du logiciel informatique en effectuant un zoom numérique sur l'image. Utilisez la numérisation lente pour acquérir une image de haute qualité.Enregistrez l'image collectée au format fichier tiff pour une analyse ultérieure, en veillant à sélectionner la barre de données si des mesures doivent être effectuées lors de l'analyse. Acquérez des images sous différents angles afin de révéler davantage d'informations sur la profondeur en inclinant le plateau du MEB. Optimisez la mise au point et l'astigmatisme avant d'acquérir une image en balayage lent.Une fois l'acquisition d'images terminée, éteignez le faisceau et augmentez la distance de travail à 20 millimètres. Ensuite, ventilez la chambre et retirez la platine. Traitez les images, puis ouvrez les fichiers d'image dans Fiji.À l'aide de la fonction ligne, tracer précisément la barre d'échelle. Cliquer sur l'onglet Analyser, puis choisir la fonction Sélectionner l'échelle. Une fenêtre apparaîtra et demandera de définir la distance connue en fonction de la barre d'échelle.Modifiez également l'unité de longueur, puis cliquez sur OK. Enfin, pour mesurer la longueur de la cellule, utilisez la fonction ligne pour tracer la cellule dans toute sa longueur. Sélectionnez à nouveau l'onglet Analyser, puis cliquez sur mesurer.La longueur doit apparaître dans les unités indiquées précédemment. Ces images montrent des cellules végétatives de C.difficile capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance, ainsi que des cellules spores. Les cellules végétatives sont de longues structures lisses en forme de bâtonnets ; en revanche, les spores sont de petites structures ovales possédant une surface extérieure rugueuse.Comme le montre cette figure, les cellules témoins croissent et atteignent un plateau ; en revanche, les cellules traitées avec les antibiotiques vancomycine et métronidazole voient leur nombre total de UFC diminuer jusqu'à la limite de détection, indiquant un effet bactéricide. Comme démontré, la vancomycine et le métronidazole sont efficaces pour tuer C.difficile à des concentrations supérieures à la CMI. Afin de démontrer l'utilité de la microscopie électronique à balayage (MEB) pour l'imagerie de C.difficile, les cellules ont été observées avant et après traitement médicamenteux afin de déterminer les modifications morphologiques induites.Dans le cas de la vancomycine, certaines parois des cellules ont été affectées et certaines cellules traitées à la métronidazole étaient plus petites en taille. Afin de tester si la taille des cellules était modifiée, la longueur des cellules a été analysée à l’aide du programme Fiji. Comme le montre cette image, la taille des cellules végétatives peut varier légèrement dans le cas témoin ; mais la plupart mesurent environ 6 micromètres de longueur.Cependant, comme le montre ce graphique, la longueur des cellules a été affectée dans les cellules traitées au métronidazole, mais pas dans celles traitées à la vancomycine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux jours. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que votre échantillon doit être fixé et parfaitement sec avant le revêtement et l'observation.Après avoir suivi cette procédure, nous pouvons effectuer des méthodes supplémentaires afin de répondre à d'autres questions, comme la manière dont les bactéries réagiront aux traitements antibiotiques ; cela peut nous offrir une compréhension plus approfondie des mécanismes d'action des antibiotiques, par exemple. Cette technique possède un potentiel considérable et pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer davantage la physiologie et la pharmacologie de Clostridium difficile. J'espère que vous avez apprécié la vision de cette vidéo aujourd'hui.J'espère que vous avez tiré de ceci comment cultiver et caractériser les cellules de C. difficile, comment analyser la cinétique d'élimination des antibiotiques contre C. difficile, puis comment évaluer les changements morphologiques associés à ces profils d'élimination à l'aide d'une microscopie de haut niveau. Étant donné que nous travaillons avec Clostridium difficile, nous devons prendre des précautions supplémentaires et utiliser toutes les protections

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Clostridium difficile est une bactérie pathogène qui est une bactérie anaérobie stricte et provoque la diarrhée associée aux antibiotiques (DAA). Ici, des méthodes d'isolement, la culture et le maintien C. des cellules et des spores végétatives difficile sont décrits. Ces techniques nécessitent une chambre anaérobie, qui nécessite un entretien régulier pour assurer des conditions adéquates pour optimale C. culture difficile.

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Une analyse de Microarray de protéine pour détermination sérologique de l’Infection à Clostridium difficile anticorps réponses suivantes spécifiques à l’antigène

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