Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de Clostridium difficile En réponse au traitement antibiotique

L’objectif global de cette méthode d’imagerie microbiologique est de fournir un moyen plus descriptif de distinguer les effets phénotypiques du traitement pharmacologique. Cette méthode peut donc vraiment aider dans le domaine des maladies infectieuses. Plus précisément, il s’agit d’examiner les effets morphologiques de certains antibiotiques et la façon dont ils tuent C. Difficile.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine l’imagerie à haute résolution avec des techniques de culture cellulaire in vitro pour fournir un aperçu détaillé de l’action de destruction pharmaceutique. L’implication de cette technique peut s’étendre au traitement de l’infection à Clostridium difficile, ou ICD en abrégé. La raison en est que cette technique peut fournir un moyen d’identifier comment un antibiotique peut être bénéfique dans le traitement de l’ICD.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’action pharmacologique, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que des modèles de culture mixte ou des études animales in vivo. En général, les gens ont de la difficulté à utiliser cette nouvelle méthode, car il est difficile de cultiver C. difficile et d’utiliser un microscope électronique à balayage. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé de distinguer les différents modes d’action des antibiotiques.

J’aimerais vous présenter l’équipe de recherche que vous rencontrerez aujourd’hui. Jahangir Alam est professeur et microbiologiste. Il coordonne toutes les activités de laboratoire que vous verrez aujourd’hui.

Tasnuva Rashid est une étudiante diplômée du laboratoire. Elle fait beaucoup de microbiologie au jour le jour. Eugénie Bassere est post-doc

Elle a vraiment enseigné à Tasnuva de nombreuses compétences et l’aide également en laboratoire. Brad Endres est un autre post-doctorant dans le laboratoire. Il fera beaucoup de microscopie avec l’aide de Long Chang.

Pour préparer des isolats environnementaux tout en portant des gants stériles, utilisez une gaze de coton pré-stérilisée pour tamponner la surface de toute zone d’intérêt, comme un sol, une porte, une poignée ou une étagère. Placez ensuite l’écouvillon dans un tube stérilisé. Changez de gants entre les échantillons.

Pour préparer des isolats cliniques, utilisez une boucle d’inoculation pour plaquer 10 à 100 milligrammes d’échantillons de selles cliniques sur une gélose à la céfoxitine cyclosérine fructose, ou CCFA, et intubez les échantillons dans des conditions anaérobies strictes pendant 48 à 72 heures. Conservez les colonies isolées du stock de C. difficile dans des flacons cryogéniques à moins 80 degrés Celsius pour des analyses plus approfondies. Enrichissez les échantillons d’écouvillons environnementaux dans une perfusion cerveau-cœur, ou bouillon BHI, avec 05 % de taurocholate de sodium et placez les échantillons dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant cinq jours.

Centrifugez un millilitre de la culture à 10 000 fois G et utilisez 100 microlitres d’éthanol pour remettre la pastille en suspension. Placez 50 microlitres de cellules remises en suspension sur des plaques CCFA et incubez les cultures dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 40 à 48 heures. Conservez les colonies isolées de stock de C. difficile dans des flacons cryogéniques à moins 80 degrés Celsius pour des analyses plus approfondies.

Utilisez le réactif d’agglutination au latex, ou PCR, pour tester les colonies suspectées de C. difficile. Cultivez des souches de C. difficile purifiées, environnementales ou cliniques sur des plaques de gélose au sang dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. À l’aide d’une boucle d’inoculation, prélevez une colonie isolée et transférez-la dans cinq millilitres de milieu BHI dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, cultivez la culture dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Utilisation de BHIS frais, pré-réduit, complété par du taurocholate de sodium et la concentration appropriée d’antibiotique pour diluer les pré-cultures de 1 à 100 à environ 10 à la sixième UFC par millilitre. À l’aide d’une pipette, prélever un échantillon d’un millilitre à chaque point de temps et à chaque plaque ou étaler une petite aliquote sur une plaque de gélose au sang.

Incuber la plaque pendant 48 heures dans une chambre anaérobie à 37 degrés Celsius et compter le nombre de colonies résultantes pour déterminer les UFC. Prélevez un millilitre de cellules à chaque point temporel dans des tubes de microcentrifugation et centrifugez à 10 000 fois G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et utilisez du PBS pour laver les cellules.

Faites tourner à nouveau les échantillons et jetez le surnageant. Utilisez ensuite un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % pour diluer à nouveau les cellules et incubez les tubes à température ambiante pendant une heure. Après avoir fait tourner à nouveau les échantillons et jeté le surnageant, utilisez de l’eau distillée pour laver les cellules deux fois avant de les diluer à nouveau dans 100 microlitres d’eau distillée.

Ajustez le volume en fonction de la turbidité de la solution. Après avoir étiqueté les lamelles, ajoutez-y 40 microlitres de l’échantillon. Sous une hotte à flux, incubez les lamelles pendant 15 minutes pour évaporer le liquide et permettre aux cellules d’adhérer au verre.

S’il y a encore du liquide, utilisez un souffleur pour l’éliminer. Placez les lamelles dans une machine à pulvérisation cathodique de bureau et collez-les. Fixez l’or pur dans la machine à pulvériser.

Allumez ensuite la machine et commencez à pulvériser à basse pression. Enduisez les cellules pendant 30 secondes à 80 microampères, ce qui se traduit par 20 nanomètres de revêtement d’or. Pour commencer l’imagerie, ventilez d’abord correctement le MEB dans le logiciel de l’ordinateur en appuyant sur le bouton Vent.

Après avoir recouvert les cellules, transférez-les au microscope électronique à balayage, ou MEB. À l’aide du ruban de carbone, fixez les glissières de recouvrement revêtues sur la platine métallique. Une fois le MEB ventilé, la porte doit s’ouvrir facilement.

Verrouillez la platine métallique dans la chambre MEB en la vissant dedans. Ensuite, cliquez sur le bouton Pompe dans le logiciel. Lorsque le système relit correctement, le SEM sera prêt à l’emploi.

Sous l’onglet Détecteur, cliquez sur le détecteur SE. Allumez le faisceau en cliquant sur le bouton qui affiche la tension. Commencez l’imagerie à une tension plus basse avant d’augmenter la tension.

Une image s’affiche une fois le faisceau allumé. À l’aide de la fonction de suivi, trouvez une zone sur les lamelles revêtues à imager. Zoomez sur la région et trouvez des structures en forme de bâtonnet, qui représentent Clostridium difficile.

Pour calibrer le système, zoomez, faites la mise au point grossièrement de l’image et associez Z à la distance de travail libre. Cela doit être fait à plusieurs distances de travail, par exemple à 15, 9 et 5 millimètres. Passez ensuite en mode d’imagerie ultra-haute résolution.

Utilisez les bascules de mise au point grossière et fine pour commencer à faire la mise au point à fort grossissement. Ajustez les boutons d’astigmatisme pour une image plus claire et vérifiez la clarté de l’image en utilisant le logiciel informatique pour zoomer numériquement sur l’image. Utilisez le balayage lent pour collecter une image de haute qualité.

Enregistrez l’image collectée sous forme de fichier tiff pour une analyse ultérieure, en vous assurant que la barre de données est sélectionnée si des mesures doivent être effectuées pendant l’analyse. Collectez des images sous différents angles pour révéler plus d’informations de profondeur en inclinant la platine sur le MEB. Optimisez la mise au point et l’astigmatisme avant de collecter une image à balayage lent.

Une fois l’imagerie terminée, éteignez le faisceau et augmentez la distance de travail à 20 millimètres. Ensuite, aérez la chambre et retirez la scène. Traitez les images, ouvrez les fichiers d’image aux Fidji.

À l’aide de la fonction ligne, tracez précisément la barre d’échelle. Cliquez sur l’onglet Analyser ; puis choisissez la fonction Sélectionner l’échelle. Une fenêtre apparaîtra qui nécessitera le réglage de la distance connue en fonction de la barre d’échelle.

Modifiez également l’unité de longueur, puis cliquez sur OK. Enfin, pour mesurer la longueur d’une cellule, utilisez la fonction line pour tracer la cellule dans son intégralité. Sélectionnez à nouveau l’onglet Analyser, puis cliquez sur mesurer.

La longueur doit apparaître dans les unités indiquées précédemment. Ces images montrent des cellules végétatives de C. difficile qui ont été capturées pendant la phase exponentielle de la courbe de croissance, ainsi que des cellules de spores. Les cellules végétatives sont de longues structures lisses en forme de bâtonnet ; Alors que les spores sont de petites structures ovales qui ont un extérieur rugueux.

Comme le montre cette figure, les cellules de contrôle se développent et atteignent un plateau ; tandis que les cellules traitées avec les antibiotiques vancomycine et métronidazole diminuent les UFC totales jusqu’à la limite de détection, indiquant un effet bactéricide. Comme nous l’avons démontré, la vancomycine et le métronidazole sont efficaces pour tuer C. difficile à des concentrations de super CMI. Pour démontrer l’utilité de l’utilisation de la MEB pour l’imagerie de C. difficile, les cellules ont été imagées avant et après le traitement médicamenteux afin de déterminer comment la morphologie changeait.

Dans le cas de la vancomycine, certaines parois cellulaires étaient affectées et certaines cellules traitées au métronidazole étaient de plus petite taille. Pour vérifier si la taille des cellules a été affectée, la longueur des cellules a été analysée à l’aide du programme Fidji. Comme le montre cette image, la taille des cellules végétatives peut varier quelque peu dans le cas témoin ; Mais la plupart mesurent environ 6 micromètres de long.

Cependant, comme le montre ce graphique, la longueur des cellules a été affectée dans les cellules traitées au métronidazole, mais pas dans les cellules traitées à la vancomycine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que votre échantillon est fixé et complètement sec avant le revêtement et l’imagerie.

À la suite de cette procédure, nous pouvons effectuer des méthodes supplémentaires pour répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont les bactéries réagiront aux traitements antibiotiques ; Et cela peut nous donner un aperçu supplémentaire de la compréhension de la mécanique d’action des antibiotiques, par exemple. Cette technique a un immense potentiel et pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer davantage la physiologie et la pharmacologie de Clostridium difficile. J’espère que vous avez aimé regarder cette vidéo aujourd’hui.

J’espère que ce que vous en avez retiré, c’est comment cultiver et caractériser les cellules de C. difficile, comment examiner la cinétique de destruction des antibiotiques contre C. difficile, puis comment évaluer les changements morphologiques associés à ces modèles de destruction à l’aide de la microscopie de haut niveau. Pendant que nous travaillons avec Clostridium difficile, nous devons prendre des précautions supplémentaires et utiliser tous les