Name: Expression de la cytokine exogène dans les xénogreffes dérivées par un patient par injection avec une lignée cellulaire Stromal transduites par une cytokine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Découvrez comment produire des cytokines humaines dans des xénogreffes dérivées de patient en injectant une lignée cellulaire stromale transduite. Cette méthode élimine le besoin de lignées transgéniques coûteuses et permet d'étudier l'hématopoïèse normale et maligne.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce manuscrit décrit une méthode simple, rapide et relativement rentable pour l&#39;ingénierie PDX pour exprimer des cytokines humaines exogènes. La stratégie décrite ici est basée sur des injections intrapéritonéales hebdomadaires d&#39;une lignée cellulaire stromale transduites pour exprimer la cytokine humaine, TSLP. Avant d&#39;exécuter les méthodes décrites ici, le stroma conçu pour exprimer des niveaux élevés de cytokine d&#39;intérêt (TSLP) et un stroma de contrôle de même ingénierie ont été générés. Dans les prot...

Les xénogreffes dérivées de patients (PDX) sont un puissant modèle in vivo pour étudier la production de cellules hématopoïétiques normales et malignes dans un environnement de mammifère &quot;natif&quot;. Le plus souvent, la PDX est produite par injection ou transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. La production de PDX à l&#39;aide de cellules souches hématopoïétiques humaines normales permet des études in vivo du sang humain normal et du développement de cellules immunitaires. La PDX produite à partir de leucémie ou d&#39;autres cellules cancéreuses permet d&#39;étudier les mécanismes oncogènes et d&#39;identifier des thérapies efficaces dans le contexte de la gamme des paysages génétiques et des mutations présentes dans la population humaine. 1 Par conséquent, PDX est l&#39;étalon-or actuel pour la recherche biomédicale translationnelle pour identifier les thérapies efficaces et un outil important pour comprendre les mécanismes de progression du cancer. Les modèles PDX sont un outil essentiel pour faciliter la recherche sur les disparités en matière de santé en raison de maladies spécifiques<html> Les lésions génétiques ou toute maladie dans laquelle les variations du paysage génétique d&#39;un patient peuvent contribuer de manière substantielle à l&#39;oncogenèse et aux résultats du traitement. Les modèles PDX souris-humains sont possibles car de nombreuses cytokines de souris imitent de manière adéquate leurs analogues humains dans l&#39;activation des récepteurs de cytokines des cellules humaines alors qu&#39;ils se trouvent à l&#39;intérieur de la souris. Par exemple, l&#39;interleukine-7 (IL-7) fournit un signal critique pour le développement des cellules B humaines. 2 Dans ce cas, l&#39;IL-7 de souris a une homologie suffisante avec l&#39;IL-7 humaine que la cytokine de souris stimule les voies de signalisation dans les précurseurs de cellules B humaines. 2 , 3 , 4 Cependant, ce n&#39;est pas le cas pour la lymphopoïétine stromale thymique (TSLP), 5 , 6 qui, parmi d&#39;autres cytokines (IL-3, facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF) ,La cytokine de souris et humaine présente une faible homologie, les cytokines de souris n&#39;activent pas leurs récepteurs respectifs sur les cellules humaines. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de stratégies ont été utilisées Pour englober l&#39;expression de cytokines humaines chez les souris PDX, notamment l&#39;injection de cytokines humaines recombinantes, l&#39;injection hydrodynamique de l&#39;ADN, l&#39;expression lentivirale, l&#39;expression transgénique et le remplacement du gène knockin. 7 Ce rapport décrit une méthode pour l&#39;ingénierie de PDX pour produire une cytokine humaine par médiation par le stromal Distribution de cytokines ( figure 1 ). Dans la méthode démontrée ici, les souris PDX sont conçues pour exprimer la cytokine humaine, la TSLP, ou pour servir de témoins négatifs à la cytokine. TSLP-exprimant PDX sont réalisés par des injections intrapéritonéales hebdomadaires de cellules stromales qui ont été transduites pour exprimer des niveaux élevés de TSLP humaine.Les souris &quot;contrôle&quot; PDX &quot;anti-cytokine négatives&quot; sont conçues de manière similaire; Bien que le stroma de contrôle soit transduit avec un vecteur témoin. Cette méthode atteint des taux physiologiques normaux de TSLP humaine chez des souris PDX injectées avec le stroma TSLP +. Aucune TSLP détectable n&#39;est observée chez les souris PDX recevant le stroma négatif des cytokines. Nous avons sélectionné la ligne cellulaire stromale humaine HS-27A pour nos études, car elle se développe de manière robuste en culture et affiche un très faible taux de production de cytokines qui ne supporte pas la prolifération de cellules progénitrices isolées dans les cultures de cultures. 8 Pour l&#39;expression TSLP humaine, le stroma a été transduit avec un vecteur lentiviral auto-inactif à génération avancée dérivé d&#39;un squelette décrit précédemment, 9 et comprend l&#39;élément cPPT / cts et l&#39;élément régulateur post-transcriptionnel hépatite de la marbrure (WPRE) pour augmenter l&#39;expression du transgène. Le gène TSLP humain a été construit dans ce vecteur sous le contrôle du facteur d&#39;allongement-1(EF-1) alpha pour obtenir une expression solide, constitutive et à long terme. L&#39;ingénierie de ce modèle PDX amélioré par les cytokines humaines se compose de 4 étapes majeures. Tout d&#39;abord, le stroma transduit est développé in vitro et évalué par dosage immunosorbant enzymatique (ELISA) pour une production stable et à haute teneur en cytokines. Deuxièmement, l&#39;activité de la cytokine humaine produite par les cellules stromales transduites (et le manque d&#39;activité de la cytokine à partir du stroma témoin) est vérifiée à l&#39;aide de la cytométrie à flux phosphore. Les lignées cellulaires connues pour réagir à la cytokine d&#39;intérêt (dans ce cas, TSLP) sont incubées avec un surnageant de cellules stromales et testées pour la phosphorylation induite par les cytokines. Troisièmement, les souris sont injectées avec un stroma humain transduit, puis le plasma de souris est évalué par ELISA pour des taux de cytokines humains sur une base hebdomadaire. Quatrièmement, les cellules hématopoïétiques humaines sont transplantées et les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine sont évalués sur une cible connue ( <em&gt; P.ex. Population cellulaire). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55384/55384fig1.jpg" /> Figure 1: Modèle PDX conçu pour produire des cytokines humaines exogènes chez les souris. ( 1A ) Expérience de conception et obtention de cellules stromales humaines transduites ( 1B ) Obtenir des cellules humaines (cellules souches hématopoïétiques, cellules de leucémie, etc. ) pour générer des souris PDX (xénogreffe dérivée du patient). ( 2A ) Injecter le stroma manipulé et ( 2B ) transplanter des cellules humaines dans des souris immunodéficientes selon le calendrier expérimental. ( 3A-B ) Surveiller les concentrations de cytokines dans le surnageant de stroma et le plasma de souris par ELISA. ( 4 ) Récolter des cellules humaines et évaluer les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine présente dans la PDX. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55384/55384fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici s&#39;il vous plait</a>Pour afficher une version plus grande de cette figure. La délivrance de cytokines humaines par l&#39;intermédiaire de cellules stromales offre à la fois des avantages et des inconvénients par rapport à d&#39;autres procédés de délivrance / production de cytokines humaines chez des souris PDX. 7 Par rapport à l&#39;injection de cytokine humaine recombinante, la délivrance à médiation par le stroma est généralement moins coûteuse (le coût de la culture de cellules stromales est inférieur au coût de la cytokine recombinante) et moins de travail intensif (une injection par semaine par injection multiple par semaine). La question de la demi-vie courte des cytokines est également atténuée puisque le stroma produit continuellement la cytokine exogène. La délivrance de cytokine par injection hydrodynamique d&#39;ADN peut être moins coûteuse que la délivrance par stroma. Cependant, il est également transitoire et peut nécessiter plus de compétences techniques que l&#39;injection intrapéritonéale hebdomadaire simple requise pour l&#39;administration par stimulation du stroma. L&#39;expression du gène lentiviral chez la souris peut fournir moins de traMéthode de distribution de cytokines; Cependant, dans nos mains, les niveaux de TSLP physiologiques n&#39;ont pas été atteints. En outre, cette méthode nécessite beaucoup de travail, nécessitant une production continue de vecteur lentiviral. Les souris transgéniques ou knock-in offrent une expression stable à long terme de la cytokine et peuvent être conçues pour une expression spécifique des tissus, ce qui peut être un avantage. D&#39;autre part, l&#39;expression transgénique du gène de la cytokine humaine sur le fond de souris immunodépendant requis pour les souris PDX nécessite un immense investissement de ressources avant que la valeur du modèle ne soit établie. En outre, les modèles transgéniques ne permettent généralement pas l&#39;option de modifier le moment de l&#39;initiation des cytokines ou le niveau de production de cytokines in vivo . Ceux-ci peuvent être atteints avec une distribution stimulée par le stroma en modifiant simplement le point de temps pour l&#39;initiation de l&#39;injection de cellules stromales ou la dose de cellules stromales injectées. La méthodologie de distribution de cytokines médiée par une cellule stromaleOd détaillé ici a été utilisé pour développer PDX pour évaluer le rôle du TSLP dans le développement normal des cellules B humaines 4 , 6 et la leucémie lymphoblastique aiguë des cellules B à haut risque. 6 Cette méthode fournit une méthode de distribution de cytokine alternative utilisée pour générer des modèles similaires avec des cytokines humaines autres que TSLP. Ce modèle peut également être utile pour générer des données préliminaires qui peuvent aider à déterminer si la valeur d&#39;un cytokine transgénique ou cytokine knock-in PDX modèle serait digne de l&#39;investissement en temps et en argent important.

<table><tbody><tr><td><réactifs de laboratoire humides>forts&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacité de 7 mL, surface de culture de 25 cm&sup2</td><td>Thermo Scientific / Fisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, capacité de 250 mL, surface de culture de 75 cm&sup2 et capuchon ventilé</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>T-150 Falcon Flacon traité pour la culture tissulaire, capacité de 600 ml, 150 cm&sup2 ; espace culturel & Pipettes</td> sérologiques <td>Corning Inc. / Fisher</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes coniques en polypropylène</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL, filetage externe</td><td>Corning Inc. / Fisher</td><td>4230659</td><td></td></tr><tr><td>pointes de pipette de 1 mL</td><td>Fisher</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; L pointes de pipette&nbsp ;</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; Pointes de pipette en L</td><td>Denville Scientific</td><td>P-1096-CP</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration stériles jetables avec membrane SFCA, Nalgene Rapid-Flow</td><td>Fisher</td><td>09-740-28D</td><td></td></tr><tr><td>2 NH2SO4&nbsp ; </td><td>BioLegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calicium ni magnésium, 1& fois ;</td><td>Corning cellgro/ Mediatech</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human TSLP ELISA Max Deluxe Set</td><td>BioLegend</td><td>434204</td><td></td></tr><tr><td>3 % d’acide acétique avec bleu de méthylène</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7060</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>25-900-CL</td><td></td></tr><tr><td>"Trypsine » 1x 0,25 % Trypsine 2,21 mM EDTA dans HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td> » R10" milieu de culture cellulaire, % du volume total (565 ml)</td><td>-</td><td>-</td><td>Lab Recipe</td></tr><tr><td>RPMI, 88,5 % (500 mL)&nbsp ;</td><td>Mediatech</td><td>10-040-CV&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>FBS, 9,9 % (56 mL)&nbsp ;</td><td>Mediatech</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 0,99 % (5,6 mL)&nbsp ;</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine, 0,50 % (2,8 mL)&nbsp ;</td><td>Mediatech</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoéthanol, 0,10 % (560 &micro ; L)&nbsp ;</td><td>MP</td><td>190242</td><td></td></tr><tr><td><fort>" R20 » milieu de culture cellulaire, % du volume total (pour une dose de 195 ml)</td><td>-</td><td>-<</td><td>strong>Lab Recipe</td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; RPMI, 76,84 % (150 mL)</td> <td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; FBS, 20,49 % (40 ml)</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 2 mM de L-glutamine, 1,02 % (2 mL)</td> <td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td>. &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 1 mM de Na pyruvate, 1,02 % (2 mL</td>) <td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Pénicilline-Streptomycine,&nbsp ; 0,51 % (1 ml)</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 2-Mercaptoéthanol, 0,10 % (0,1 M),&nbsp ; 0,10 % (200 et micro ; L)</td><td>voir ci-dessus</td><td>voir ci-dessus</td><td></td></tr><tr><td><fort>" Milieu de congélation », % du volume total</fort></td><td>-</td><td><fort>-</fort></td><td><fort>Recette de laboratoire</fort></td></tr><tr><td> » R10" moyen, 45</td><td> %voir « R10 »</td> <td>recipe-FBS</td><td></td></tr><tr><td>, 20</td><td> %voir ci-dessus</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 10</td> %<td>Corning</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>D(-)(+)-Tréhalose dihydraté, 5 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2687-100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catolog Number </td><td>Comments</td></tr><tr><td>Biologics&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>"HS-27 » HS-27A lignée de stroma humain</td><td>ATCC</td><td>CRL-2496</td><td></td></tr><tr><td>"CALL-4 » MHH-CALL-4 lignée cellulaire, leucémie précurseur de cellules B humaines</td><td>DSMZ</td><td>ACC 337</td><td></td></tr><tr><td> » Souris NSG" HOCHER. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mâle ou femelle, 6 ans &ndash ; 8 semaines</td><td>JAX Mice&nbsp ;</td><td># 005557</td><td></td></tr><tr><td>lignée cellulaire MUTZ-5, leucémie précurseur des lymphocytes B humains</td><td>DSMZ</td><td>ACC 490</td><td></td></tr><tr><td>Protéine TSLP humaine recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>1398-TS-010</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cytomère en flux (clone)*</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD45 FITC (30F11)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-778</td><td></td></tr><tr><td>CD127 PE (MB15-18C9) (l’autre nom est IL-7R&alpha ;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-094</td><td></td></tr><tr><td>CD34 APC (8G12)</td><td>BD Biosciences</td><td>340667</td><td></td></tr><tr><td>CD45 PE-Cy7&nbsp ; (HI30)</td><td>eBioscience</td><td>25-0459</td><td></td></tr><tr><td>"FVD » Colorant de viabilité fixable&nbsp ; eFluor 780&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865</td><td></td></tr><tr><td>Ig &kappa ; chaîne légère FITC&nbsp ; (G20-193)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555791</td> Ig &lambda<td></td></tr><tr><td> ; chaîne légère FITC (JDC-12)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561379</td><td></td></tr><tr><td>IgD PE (IA6-2)</td><td>BioLegend</td><td>348203</td><td></td></tr><tr><td>IgM PE-Cy5 (G20-127)</td><td>BD Biosciences</td><td>551079</td><td></td></tr><tr><td>pSTAT5 PE,&nbsp ; souris anti-STAT5 (pY694)</td><td>BD PhosphoFlow</td><td>612567</td><td></td></tr><tr><td>Nom </td><td>Company</td><td>Catolog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Autres matériaux et équipements&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Implantable Nano Transpondeur avec Canula</td><td>Trovan&nbsp ;</td><td>ID-100B(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>Crème anesthésique à la lidocaïne EMLA (obtenue par anticipation auprès d’un établissement de soins aux animaux)</td><td>prescription</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD &frac12 ; cc LO-DOSE U-100 Seringue à insuline 28G&frac12 ; &nbsp ;</td><td>BD</td><td>#329461</td><td></td></tr><tr><td>Tubes micro-récipients BD avec K2EDTA</td><td>BD&nbsp ;</td><td>#365974</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Alegra X-15R&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Tubes capillaires (héparinisés)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>Cage à tarte pour souris</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC-1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Tail Illuminator Restrainer</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MTI STD</td><td></td></tr><tr><td>Pistol Grip Implanter</td><td>Trovan&nbsp ;</td><td>IM-300(1.25)</td><td></td></tr><tr><td>&micro ; Quant&nbsp ;</td><td>Bio-Tek Instruments Inc.</td><td>MQX200</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse par cytométrie en flux FlowJo</td><td>, LLC</td><td>Version 10</td><td></td></tr><tr><td>*Tous les anticorps sont anti-humains, sauf indication contraire.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

expression de la cytokine exogène dans les xénogreffes dérivées par un patient par injection avec une lignée cellulaire stromal transduites par une cytokine

Expression of Exogenous Cytokine in Patient-derived Xenografts via Injection with a Cytokine-transduced Stromal Cell Line

Les souris dérivées de xénogreffe (PDX) sont produites par transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. Ces modèles sont un outil important pour étudier les mécanismes de l&#39;hématopoïèse normale et maligne et constituent l&#39;étalon-or pour l&#39;identification de chimiothérapies efficaces pour de nombreuses tumeurs malignes. Les modèles PDX sont possibles car beaucoup de cytokines de souris agissent également sur des cellules humaines. Cependant, ce n&#39;est pas le cas pour toutes les cytokines, y compris celles qui sont essentielles pour l&#39;étude de l&#39;hématopoïèse normale et maligne dans les cellules humaines. Les techniques qui engendrent des souris pour produire des cytokines humaines (modèles transgéniques et knock-in) nécessitent des dépenses importantes avant que l&#39;utilité du modèle ne soit démontrée. D&#39;autres techniques nécessitent beaucoup de travail (injection de cytokine recombinante ou lentivirus) et, dans certains cas, nécessitent des connaissances techniques élevées (injection hydrodynamique d&#39;ADN). Ce rapport décrit une méthode simple pour générer des souris PDX qui ont une cyan humaine exogèneTokine (TSLP, lymphopoïétine stromale thymique) par injection hebdomadaire intraperitoneale de stroma qui a été transduit pour surexprimer cette cytokine. L&#39;utilisation de cette méthode fournit une source in vivo de production continue de cytokines qui atteint des niveaux physiologiques de cytokine humaine circulante dans la souris. Les niveaux plasmatiques de cytokine humaine peuvent varier en fonction du nombre de cellules stromales injectées et la production de cytokines peut être initiée à n&#39;importe quel moment de l&#39;expérience. Cette méthode comprend également des souris témoins négatives pour les cytokines qui sont produites de manière similaire, mais par injection intraperitoneale de stroma transduit avec un vecteur témoin. Nous avons déjà démontré que les cellules de leucémie récoltées à partir de la PDX exprimant le TSLP, par rapport au PDX de contrôle, présentent un modèle d&#39;expression génique plus semblable à l&#39;échantillon original du patient. Ensemble, les souris PDX produisant des cytokines et des souris cytokines négatives produites par cette méthode fournissent un système modèle que nous avons utilisé avec succès pour étudier laRôle de TSLP dans l&#39;hématopoïèse normale et maligne.

Un aperçu du modèle est illustré à la figure 1 . Une fois que la production de cytokine (TSLP + stroma) et le stroma de contrôle ont été obtenus, ils sont développés en culture. Avant l&#39;injection de stroma chez la souris, le surnageant de cellules stromales est évalué par ELISA pour vérifier la production de cytokines ( Figure 2 ) et la cytométrie à flux phosphore (Protocole n ° 3) est utilisée pour vérifier l&#39;activité de la cytokine produite par...

On décrit ici un procédé pour produire une cytokine exogène chez des souris de xénogreffe (PDX) dérivées du patient par injection intrapéritonéale hebdomadaire d&#39;une lignée cellulaire stromale transduit par cytokine. Cette méthode élargit l&#39;utilité de PDX et fournit l&#39;option pour la distribution de cytokines exogènes transitoires ou prolongées dans une multitude de modèles PDX.

Expression de la cytokine exogène dans les xénogreffes dérivées par un patient par injection avec une lignée cellulaire Stromal transduites par une cytokine

Patient-derived xenograft (PDX) mice are produced by transplanting human cells into immune deficient mice. These models are an important tool for studying ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des souris xénogreffées avec des cytokines humaines circulantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines du cancer et de l'hématopoïèse, telles que : quel est le rôle d'une cytokine spécifique dans le développement des lymphocytes normaux et malignes ? Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent ajuster les concentrations circulantes de cytokine exogène chez leurs animaux xénogreffés selon les besoins de leur expérience.Cela élimine la nécessité de produire de nouvelles lignées de souris transgéniques coûteuses. Cette technique sera utile pour la recherche de nouvelles thérapies anticancéreuses, car ce modèle préclinique peut être utilisé pour tester des médicaments anticancéreux, de manière similaire à ce qui est utilisé en clinique. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'hématopoïèse normale, elle peut également être utilisée pour étudier des maladies spécifiques telles que la leucémie.J'ai d'abord développé cette idée lorsque nous avons eu besoin d'un modèle in vivo pour évaluer le rôle de la cytokine TSLP dans la production de cellules B humaines normales et malignes. Commencez par ensemencer des stromas transduits avec un vecteur vide contrôle, récemment décongelés, dans des cellules productrices de cytokines, dans cinq millilitres de milieu R-10, dans des flacons T25 individuels. Pour leur culture, à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5 % de CO2, pendant 24 à 48 heures.Lorsque les stromas sont confluentes, détacher les cellules à l’aide de trypsine dans l’EDTA pour les repiquer dans des flacons de culture T150 pendant trois à quatre jours. Lorsque les stromas atteignent la confluence dans les flacons T150, recueillir les surnageants et les congeler à 80 degrés Celsius pour une évaluation ultérieure de leur production de cytokines par ELISA. Ensuite, passer chaque culture de flacon T150 dans trois nouveaux flacons T150 pour les cultiver jusqu’à confluence.Pour conserver les cellules après le nombre approprié de passages, transférez les suspensions cellulaires récoltées dans un tube conique pour la centrifugation et remettez en suspension les culots dans un milieu de congélation. Ensuite, transférez des aliquots de 1,5E6 cellules dans des tubes de stockage à long terme pour leur conservation dans l'azote liquide. Pour valider le surnageant produit à partir du stroma génétiquement modifié, décongelez les échantillons de surnageant récoltés à partir du contrôle dans le stroma exprimant des cytokines, et ensemencez trois puits de lignées cellulaires de leucémie par condition dans un milieu Au-20 à une concentration de 2E5 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits.Incuber les cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius afin de permettre la perte de la phosphorylation issue de leur culture précédente. Ensuite, transférer les cellules de chaque puits dans des tubes individuels de quatre millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendre les culots dans 600 microlitres par condition expérimentale.Plaquez 200 microlitres de cellules par puits pour chaque condition en triplets. Incubez les cellules pendant la période appropriée selon le phosphoessai commercial spécifique. À la fin de l'incubation, récupérez les cellules par centrifugation.Marquez les cellules par coloration en cytométrie en flux phospho-spécifique selon le protocole du fabricant. Ensuite, analysez les cellules par cytométrie en flux en utilisant des protocoles standards d'analyse en cytométrie en flux afin de vérifier que la cytokine présente dans le surnageant du stroma phosphoryle les cellules leucémiques. Après un minimum de trois passages post-décongélation, transférez les suspensions de cellules stromales récoltées dans des tubes coniques individuels pour le comptage.Centrifuger les cellules pour former un culot, puis les resuspendre délicatement dans les volumes appropriés de PBS stérile destiné à l'injection. Conserver les cellules à quatre degrés Celsius jusqu'immédiatement avant l'injection, moment auquel la suspension doit être réchauffée à au moins la température ambiante. Lorsque les cellules sont prêtes, mélanger doucement le premier échantillon par retournement et prélever 200 microlitres de cellules dans une seringue tuberculinique.Ensuite, immobilisez le premier animal et injectez les cellules dans la cavité péritonéale en utilisant des techniques d'injection intrapéritonéale standard. Pour prélever un échantillon de sang périphérique, positionnez d'abord délicatement la souris dans un dispositif d'immobilisation pour petits animaux désinfecté et fixez le tube afin de minimiser les mouvements de l'animal. Ensuite, nettoyez la queue avec de l'alcool isopropylique frais, puis appliquez une crème anesthésique topique.À l’aide de ciseaux chirurgicaux très tranchants, sectionner environ 5 à 1 millimètre à partir de l’extrémité de la queue et recueillir environ 80 microlitres de sang périphérique dans des tubes capillaires héparinés. Utiliser une pipette munie d’un embout en caoutchouc pour transférer les échantillons de sang dans des tubes microtainers d’EDTA au potassium préalablement étiquetés, puis retourner le tube 20 fois afin d’éviter la coagulation. Après centrifugation des tubes de prélèvement sanguin conformément aux instructions du fabricant, prélever soigneusement la couche plasmatique, conserver les aliquotes à 20 degrés Celsius et fractionner le plasma pour un stockage à 20 degrés Celsius.Le jour de l'ELISA, décongeler les échantillons de plasma de souris congelés et diluer en série l'étalon d'ELISA en volumes de 120 microlitres. Placer maintenant 40 microlitres de chaque étalon en triple exemplaire dans les puits appropriés de la plaque d'ELISA, puis ajouter 40 microlitres de chaque échantillon de plasma de souris dans les puits appropriés. Terminer ensuite l'analyse par ELISA conformément aux instructions du fabricant.24 heures après avoir irradié les souris, préparez les cellules hématopoïétiques humaines pour la transplantation xénogreffe. Lorsque vous resuspendez les cellules hématopoïétiques dans du PBS stérile, il est conseillé de préparer environ 15 à 20 pour cent de cellules en excès, au cas où une perte se produirait pendant la transplantation. Conservez les cellules à quatre degrés Celsius jusqu’à la transplantation et transférez le premier animal receveur dans une cage chauffante pendant au moins cinq minutes afin de faciliter la dilatation de la veine caudale.Ramenez maintenant les cellules à température ambiante. Mélangez délicatement la suspension cellulaire et aspirez 200 microlitres dans une seringue tuberculinique. Placez la souris dans le dispositif de contention et désinfectez la queue avec de l'alcool isopropylique.Injecter les cellules dans une veine latérale de la queue. Ensuite, surveiller la souris pendant au moins cinq minutes afin de confirmer l'absence d'effets indésirables liés à la greffe. Les animaux xénogreffés à partir de prélèvements humains, ou animaux PDX, injectés avec un stroma témoin montrent systématiquement des concentrations de lymphopoïétine stromale thymique humaine, ou TSLP, dans le plasma murin inférieures au seuil de détection par ELISA.Les taux plasmatiques de TSLP humain chez les souris PDX injectées avec un stroma transduit pour la TSLP sont proportionnels à la quantité de cellules stromales exprimant la TSLP injectées au cours des une à deux semaines précédentes. Malgré une réalisation en simple exemplaire, cette évaluation hebdomadaire des concentrations plasmatiques de TSLP par ELISA modifié donne des résultats généralement cohérents dans le temps. On a montré que la TSLP augmente la production de précurseurs normaux de cellules B humaines.En effet, les cellules de lignage B sont significativement augmentées chez les souris TSLP-plus par rapport aux animaux PDX contrôles dès le stade de précurseur des cellules B, ce qui suggère que la TSLP humaine produite dans les animaux PDX TSLP-plus exerce les effets fonctionnels attendus in vivo sur les populations cellulaires cibles. Une fois optimisées, ces procédures peuvent produire des souris xénogreffées présentant des concentrations détectables de cytokines humaines en trois à quatre semaines. Il est important de surveiller la concentration en cytokines dans le surnageant des cellules stromales au fil du temps.Cela garantit que la production de cytokines est maintenue dans le stroma producteur de cytokines et absente dans le stroma témoin. Les souris PDX peuvent être utilisées pour des études précliniques afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : comment l'efficacité d'un médicament spécifique d'intérêt est-elle modifiée par la variation des niveaux physiologiques d'une cytokine expérimentale d'intérêt in vivo ? Ce modèle innovant offre une nouvelle approche aux chercheurs dans les domaines de l'hématologie et de l'oncologie pour étudier le rôle du TSLP dans le développement et la progression de la leucémie, ainsi que son rôle dans l'hématopoïèse normale.À condition que vous ayez accès à des lignées cellulaires transduites par des cytokines, vous pouvez utiliser les techniques démontrées dans cette vidéo pour administrer n'importe quelle cytokine exogène à des modèles de maladie de greffes hétérologues dérivées de patients, en utilisant un large éventail de souches de souris immunodéficientes. N'oubliez pas que le travail avec des cellules hématopoïétiques humaines peut présenter des risques. Vous devez toujours prendre des précautions pour éviter la transmission de pathogènes transmissibles par le sang lors de la manipulation de ces fluides et de ces cellules.

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