La quantification absolue de Aß _1-42 Dans le LCR aide d'une référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse

L’objectif global de cette procédure de mesure de référence est d’harmoniser les mesures d’un bêta dans le LCR humain. Cette méthode peut aider à normaliser les tests pour la mesure du LCR, un bêta 42, qui est un biomarqueur de la pathologie amyloïde centrale et une caractéristique neuropathologique de la maladie d’Alzheimer. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est soigneusement validée et qu’elle n’utilise pas d’anticorps pour la quantification de l’AVR 142.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la maladie d’Alzheimer car elle serait utilisée pour harmoniser les tests et faciliter l’introduction de seuils généraux dans les essais cliniques. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la pathologie amyloïde chez l’homme, elle peut également être appliquée à d’autres organismes mortels tels que les souris transgéniques et les primates non humains pour invénérer de nouveaux médicaments. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’AVR 142 est très hydrophobe et peut facilement coller à des surfaces telles que les pointes de pipette et les tubes.

Tout d’abord, ajoutez 40 microlitres de N15, un peptide bêta, à 0,46 millilitre d’acétonitrile à 20 % et à 4 % d’ammoniac concentré dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Mélangez la solution peptidique sur un mélangeur vortex pendant une minute. Ajoutez 50 microlitres de la solution peptidique à 1,95 millilitre d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniac concentré à 4 % dans un tube à centrifuger de deux millilitres.

Mélangez la solution peptidique sur un mélangeur vortex pendant une minute. Ensuite, préparez six solutions de calibrateur en mélangeant les volumes appropriés de chaque solution dans des tubes de microcentrifugation. Après avoir mélangé les solutions d’étalonnage, préparez les calibrateurs finaux en double exemplaire en mélangeant les volumes appropriés des solutions d’étalonnage correspondantes et du LCR humain dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 millilitre.

Mélangez chaque solution sur un mélangeur vortex pendant une minute. Pour préparer l’étalon interne, ajoutez d’abord 32 microlitres de 13C, un peptide bêta, à 1,968 millilitre de 20 % d’acétonitrile et 4 % d’ammoniac concentré dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Mélangez la solution peptidique sur un mélangeur vortex pendant une minute.

Ensuite, ajoutez 0,1 millilitre de la solution peptidique à 4,9 millilitres d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniac concentré à 4 % dans un tube de microcentrifugation de cinq millilitres. Mélangez la solution peptidique sur un mélangeur vortex pendant une minute. Pour préparer l’échantillon de facteur de réponse, ajoutez 40 microlitres de peptide bêta natif à 0,46 millilitre d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniac concentré à 4 % dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre.

Après le mélange, ajoutez 20 microlitres de la solution peptidique et 20 microlitres de quatre microgrammes par millilitre, 15N un peptide bêta à 1,96 millilitres de 20 % d’acétonitrile et 4 % d’ammoniac concentré dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Mélangez la solution peptidique sur un mélangeur vortex pendant une minute. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution peptidique à 0,38 millilitre de LCR artificiel dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre.

Après avoir préparé les duplicatas, mélangez chaque solution sur un mélangeur vortex pendant une minute. Après avoir décongelé les échantillons sur un rouleau, ajoutez 0,18 millilitre de chaque calibrateur, facteur de réponse et échantillon inconnu à une plaque à puits profond d’un millilitre de protéine 96, en veillant à ajouter les échantillons dans ou près du fond des puits. Maintenant, ajoutez 20 microlitres d’étalon interne dans chaque puits en libérant une goutte de l’étalon sur le côté du puits près de la surface de l’échantillon sans immerger la pointe de la pipette.

Ensuite, ajoutez 0,2 millilitre de chlorhydrate de guanadine à cinq molaires dans chaque puits. Placez la plaque d’échantillon sur un agitateur de microplaques et mélangez les échantillons pendant 45 minutes à 1100 tr/min. Après avoir mélangé, ajoutez 0,2 millilitre d’acide phosphorique à 4 % dans chaque puits.

Ensuite, placez la plaque d’échantillon sur le shaker à microplaques et mélangez brièvement à 1000 tr/min. Placez un plateau réservoir pour les déchets sous une plaque d’extraction en phase solide à 96 puits d’échange cationique en mode mixte, ou SPE dans la chambre du collecteur de plaque d’extraction. Ensuite, conditionnez le sorbant SPE en ajoutant 0,2 millilitre de méthanol dans chaque puits.

Ensuite, équilibrez le sorbant en ajoutant 0,2 millilitre d’acide phosphorique à 4 % dans chaque puits. À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférez tous les échantillons de la plaque du puits profond vers la plaque SPE. Ensuite, lavez le sorbant deux fois après le passage des échantillons en ajoutant 0,2 millilitre d’acide phosphorique à 4 % dans chaque puits.

Une fois que le solvant de lavage s’est échappé du sorbant, remplacez le plateau du réservoir par des tubes. Maintenant, éluez l’échantillon du sorbant en ajoutant deux aloquats de 50 microlitres d’acétonitrile à 75 % et d’ammoniac concentré à 10 %, en notant que cette solution nécessite un vide très faible pour passer à travers le sorbant. Séchez les éluats en utilisant la centrifugation sous vide sans appliquer de chaleur.

Enfin, scellez les tubes et congelez-les à 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Les calibrateurs sont proches de la ligne de régression avec de faibles écarts-types. Si l’étalonnage n’est pas linéaire, le cycle doit être éliminé et l’écart est probablement dû à des techniques de pipetage incorrectes et/ou à des erreurs dans la dilution des calibrateurs.

Le coefficient de variation des répétitions doit de préférence être inférieur à 10 %Les 15N et 13C natifs ont élué bêta de la colonne LC simultanément avec des pics proches de la symétrie et sans traînée significative. Au moins 10 mesures doivent être effectuées pour chaque pic et peuvent être ajustées avec un temps d’injection maximal dans la méthode. Les peptides peuvent être mesurés simultanément pendant l’analyse MS, sauf si la sensibilité de la méthode n’est pas optimale, dans laquelle seuls les peptides d’intérêt doivent être mesurés pour chaque injection.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours saturer les pointes des pipettes avant de transférer la solution peptidique. Il est également important d’utiliser des tubes avec le moins de volume de vide possible.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la maladie d’Alzheimer pour explorer la concordance avec d’autres méthodes, telles que l’imagerie TEP amyloïde. Il a également été utilisé pour attribuer des concentrations bêta 142 à des matériaux de référence à base de LCR. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des calibrateurs dans le LCR humain et de l’utilisation de l’extraction en phase solide avant l’analyse LCMS pour mesurer la concentration absolue d’un bêta-142 dans les échantillons.

N’oubliez pas que travailler avec du LCR humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants, des lunettes de protection et d’autres mesures de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.