Name: La quantification absolue de Aß 1-42 Dans le LCR aide dune référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Apprenez la quantification absolue de Aβ1-42 dans le LCR humain par extraction en phase solide et spectrométrie de masse en tandem. Cette méthode validée standardise les dosages pour la recherche sur la maladie d'Alzheimer.

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Ce travail a été réalisé pour le compte du groupe de travail de la Fédération internationale de chimie clinique sur les protéines de LCR, dont la composition est la suivante : Kaj Blennow (président) et Henrik Zetterberg, Université de Göteborg, Suède ; Les Shaw et Magdalena Korecka, Université de Philadelphie, Pennsylvanie, États-Unis ; Ingrid Zegers, Institut des matériaux et mesures de référence, Geel, Belgique ; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Allemagne ; et Rand Jenkins, Laboratoire bioanalytique PPD, Richmond, Virginie, États-Unis ; Randall Bateman, Université de Washington, MO, États-Unis ; et H. Vanderstichele, Innogenetics NV, Gand, Belgique. Ce travail a également fait partie du groupe de travail sur les méthodes de référence du CSF du Consortium mondial pour la normalisation des biomarqueurs, dirigé par Maria C. Carrillo, Ph.D., directrice principale, Relations médicales et scientifiques, Alzheimer’s Association. L’étude a été soutenue par le Conseil suédois de la recherche (subventions #14002, #521-2011-4709 et #2013-2546) ; la Fondation Knut et Alice Wallenberg ; Demensförbundet ; et les fondations d’Emil et Wera Cornell, d’Aina Wallström et Mary-Ann Sjöblom, de Gun et Bertil Stohne, de Magnus Bergvall et de Gamla Tjänarinnor.

NOTE: Ce protocole exige des aliquotes d&#39;au moins 50 ul, avec une concentration de 50 pg / ml pour chaque peptide Aß, en tant que matériau de départ. Les peptides Aß doivent être dissous dans 20% d&#39;acétonitrile (ACN) et une solution à 4% d&#39;ammoniac concentrée dans de l&#39;eau déminéralisée (v / v) et stockées à 80 ° C. Attention: Voir le tableau 1 pour les informations de sécurité. 1. Préparation des solutions <ol><li> Préparer 100 ml de 20% d&#39;ACN et de 4% d&#39;une solution concentrée d&#39;ammoniaque dans de l&#39;eau déminéralisée (v / v) en diluant 20 ml d&#39;ACN et 4 ml d&#39;ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l&#39;eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 100 mL avec de l&#39;eau déminéralisée. Faire frais tous les jours. </li><li> Préparer 50 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate par dissolution de 26,08 g de chlorhydrate de guanidine dans de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à un volume final de 50 ml. Conserver à 20 ° C et de faire mensuelle frais. </li><li> Préparer 200 ml de 4% d&#39;acide phosphorique dans de l&#39;eau déminéralisée (v /v) en diluant 9,4 ml d&#39;acide phosphorique concentré (~ 85%) dans de l&#39;eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 200 mL avec de l&#39;eau déminéralisée. Conserver au réfrigérateur et de faire chaque semaine. </li><li> Préparer 50 ml de 75% d&#39;ACN et 10% de solution d&#39;ammoniaque concentrée (v / v) dans de l&#39;eau déminéralisée en diluant 37,5 ml d&#39;ACN et 5 ml d&#39;ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l&#39;eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 50 ml avec de l&#39;eau déminéralisée. Faire frais tous les jours. </li><li> Décongeler au moins 2,5 mL de CSF humain pour les étalons, obtenus à partir de dépersonnalisées échantillons restants de l&#39;analyse clinique de routine. </li><li> Préparer CSF artificiel contenant 150 mM de Na, K 3,0 mM, 1,4 mM de Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM de P et 155 mM de Cl dans de l&#39;eau déminéralisée et on ajoute de l&#39;albumine de sérum bovin à une concentration finale de 4 mg / ml. Seulement 1 mL est nécessaire par analyse, mais préparer un grand volume, aliquote, et magasin pour une utilisation future. </li></ol> 2. Préparation des calibrateurs <ol><li> Préparer 0,5 ml de 4 pg / mL 15 NAβ peptide 1-42 par addition de 40 ul de 50 ug / ml 15 NAβ 142 à 0,46 ml de 20% d&#39; ACN et de 4% d&#39; ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Préparer 2 mL de 100 ng / ml 15 NAβ peptide 1-42 par addition de 50 ul de la 4 pg / ml 15 NAβ 142 à 1,95 ml de 20% d&#39; ACN et de 4% d&#39; ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Préparer six solutions d&#39;étalonnage (AF) en mélangeant des volumes de chacune des solutions indiquées dans le tableau 2. Utiliser 0,5, 1,5 et 2 ml microtubes. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Préparer les calibrateurs finales (en double), en ml tubes 0,5 à centrifuger en ajoutant les solutions d&#39;étalonnage correspondantes et CSF humain selon le Tableau 3. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li></ol> 3. Préparation de l&#39;étalon interne <ol><li> Préparer 0,8 ml de 2 pg / ml de peptide 13 CAβ 1-42 par addition de 32 pi de 50 pg / ml 13 CAβ 142 à 1,968 ml de 20% d&#39; ACN et de 4% d&#39; ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Préparer 5 ml de 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 peptide en ajoutant 0,1 mL de 0,8 pg / ml à 4,9 ml de 20% d&#39; ACN et 4% d&#39; ammoniac concentré dans un tube 5 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li></ol> 4. Préparation de l&#39;échantillon facteur de réponse NOTE: Le facteur de réponse (RF) , la détermination est effectuée pour déterminer la concentration du peptide marqué utilisé pour le calibrage (15 NAβ 1-42). Cela exige que la concentration du peptide natif Aß 1-42 a été déterminée par analyse des acides aminés (AAA). Ainsi, le volume et la concentration des fractions aliquotes de peptide Aß 1-42 nativesdoivent satisfaire aux exigences de l&#39;AAA. <ol><li> Préparer 0,5 ml de 4 ug / ml natif (sans étiquette) Aß 1-42 par addition de 40 pi de 50 pg / ml natif Aß 1-42 à 0,46 ml de 20% d&#39; ACN et de 4% d&#39; ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Préparer un 2-ml 40 ng / ml de mélange natif et 15 NAβ 1-42 en ajoutant 20 pi de 4 pg / mL natif Aß 1-42 et 20 pi de 4 pg / mL 15 NAβ 1-42 à 1,96 mL de 20% ACN et 4% concentrés ammoniac dans un tube 2 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li><li> Ajouter 20 ul de 40 ng / mL mélange à 0,38 ml de CSF artificiel dans un ml tube de 0,5 à centrifuger. Préparer les doublons et mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min. </li></ol> Préparation 5. Sample NOTE: Décongeler les échantillons à mesurer à la température ambiante sur un rouleau. <ol><li>Ajouter 0,18 ml de chaque calibrateur, facteur de réponse et échantillon inconnu (y compris le contrôle de la qualité [QC] échantillons, le cas échéant) à un 1 ml de protéine plaque de 96 puits profonds, selon la figure 1 ( en supposant une assiette pleine est utilisée). Assurez-vous d&#39;ajouter les échantillons, ou à proximité, le fond des puits. </li><li> Ajouter 20 pi de standard interne à chaque puits (c. -à- calibrateurs, les facteurs de réponse, Qcs et inconnues); il est essentiel de libérer la goutte sur le côté du puits à proximité de la surface de l&#39;échantillon, sans l&#39;immerger la pointe de la pipette. </li><li> Ajouter 0,2 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate à chaque puits. </li><li> Placer la plaque d&#39;échantillon sur un agitateur de microplaque et mélanger les échantillons pendant 45 min à 1100 rpm. La fréquence optimale peut varier en fonction de l&#39;instrumentation. Régler la fréquence et l&#39;amplitude du mélangeur, de sorte que les solutions sont soigneusement mélangés, et des gouttes de l&#39;étalon interne ou le LCR sont laissées sans mélange sur le côté du puits. </li><li> Ajouter 0,2 ml de 4% d&#39;acide phosphoriquechaque puits. Vortex mélanger brièvement. </li></ol> 6. extraction en phase solide NOTE: Dans tous les laver, le chargement, et les étapes d&#39;élution, appliquer le vide le plus bas possible après l&#39;ajout de la solution et d&#39;augmenter graduellement au besoin pour charger ou éluer la solution. Désactivez le vide entre chaque chargement et l&#39;étape d&#39;élution. <ol><li> Mettez un plateau de réservoir pour les déchets sous un mode mixte, d&#39;échange de cations, 96 puits d&#39;extraction en phase solide (SPE) plaque dans la chambre de collecteur de plaque d&#39;extraction. </li><li> Conditionner le sorbant SPE en ajoutant 0,2 ml de methanol à chaque puits. </li><li> Équilibrer le sorbant en y ajoutant 0,2 ml de 4% d&#39;acide phosphorique à chaque puits. </li><li> Transférer tous les échantillons (environ 0,62 ml dans chaque puits) de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE. Utiliser une pipette à huit canaux lors du transfert des échantillons de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE; il est essentiel de transférer les volumes entiers ou égaux de tous les échantillons, car les échantillons contiennent un stagiairenorme al qui compenser les variations. </li><li> Laver le sorbant après que les échantillons ont traversé en y ajoutant 0,2 ml de 4% d&#39;acide phosphorique à chaque puits. </li><li> Après que le solvant de lavage est élue du sorbant, remplacer le plateau de réservoir d&#39;une plaque ou les tubes collection. </li><li> Éluer l&#39;échantillon à partir du sorbant par deux fois en ajoutant 50 ul de 75% d&#39;ACN / 10% d&#39;ammoniaque concentrée et notez que cette solution nécessite une dépression très faible pour passer à travers le sorbant. Rappelez-vous de désactiver le vide entre chaque addition. <ol><li> OPTION: Sceller la plaque ou les tubes de collecte et de les congeler à -80 ° C. Retirez le joint de la plaque ou les tubes collection avant de passer à l&#39;étape 6.8.2. </li><li> Sécher les éluats en utilisant la centrifugation à vide (sans appliquer de la chaleur); cela peut prendre une à plusieurs heures, en fonction de la centrifugeuse sous vide. </li><li> Sceller les récipients et les congeler à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Liquid Chromatophie <ol><li> Préparer la phase mobile A (5% ACN et 0,3% d&#39; ammoniac concentré dans de l&#39; eau déminéralisée [v / v]), B (4% d&#39; eau déminéralisée et 0,1% d&#39; ammoniac concentré dans ACN [v / v]), et lavage de l&#39; aiguille (50% ACN et 4% ammoniac concentré dans de l&#39; eau déminéralisée [v / v]). <ol><li> Pour 500 ml de phase mobile A, ajouter 25 ml d&#39;ACN et 1,5 ml d&#39;ammoniaque concentrée à l&#39;eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 500 mL avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Pour 500 ml de phase mobile B, ajouter 500 ul d&#39;ammoniaque concentrée et 25 ml d&#39;eau déminéralisée à ACN. Ajuster le volume final à 500 ml avec ACN. </li><li> Préparer 250 ml de lavage de l&#39;aiguille en y ajoutant 120 ml d&#39;ACN et 10 ml d&#39;ammoniaque concentré à de l&#39;eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 250 mL avec de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Mettez la phase mobile A et B et de lavage de l&#39;aiguille des bouteilles ouvertes dans un bain de sonication pendant 20 minutes avant de l&#39;utiliser avec le système de LC </li></ol></li><li> Dissoudre chaque échantillon avec 25 ul de 20% d&#39;ACN et 4% concentrasolution d&#39;ammoniaque ted et les placer sur un agitateur pendant 20 min. Centrifuger bas les échantillons et les placer dans l&#39;échantillonneur automatique (garder à 7 ° C). </li><li> Injecter 20 ul d&#39;échantillon à raison de 1 x 250 mm 2 polystyrènedivinylbenzène (phase inverse) de la colonne monolithique maintenue à 50 ° C. <ol><li> Utiliser le gradient LC indiqué dans le Tableau 4 avec un débit de 0,3 mL / min. Détourner les deux premiers et les cinq dernières minutes à perdre (post-colonne) en utilisant une vanne de dérivation pour réduire la contamination du spectromètre de masse. </li></ol></li></ol> Analyse 8. spectrométrie de masse REMARQUE: Ces paramètres ont été utilisés pour un spectromètre de masse hybride quadripolaire-Orbitrap équipé avec une source d&#39;ionisation électrospray aheated. <ol><li> Définir les paramètres de la source d&#39;ions conformément au tableau 5. </li><li> Réglez l&#39;instrument MS pour isoler les 4+ états de charge de Aß natif 1-42 (1,129.48 masse-rapport [m / z] à charge), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), et 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) dans la masse quadripolaire analyseur avec une largeur d&#39;isolement de 2,5 m / z. </li><li> Fragment les peptides isolés dans la cellule de collision avec une énergie de collision normalisée (NCE) de 17,0. Cela pourrait avoir besoin d&#39;être réglé pour chaque instrument, même du même type (et en particulier en cas d&#39;utilisation d&#39;autres types d&#39;instruments, comme un triple quadripôle MS). </li><li> Enregistrer les spectres de fragments avec une résolution de 17.500, avec une cible de commande automatique de gain de 2 x 10 5 charges et une durée d&#39;injection maximale de 250 ms. </li></ol> 9. Traitement des données <ol><li> Utilisez la somme des ions produits (avec une tolérance de masse de ± 250 unités de masse milli [mmu]) dans le tableau 6 pour calculer les zones chromatographiques pour chaque peptide. Notez que les types et le nombre d&#39;ions ne sont indiqués que pour Aß natif <sub&gt; ions 1-42 de produits, car ils sont les mêmes pour les 15 NAβ 1-42 et 13 CAβ 1-42. </li><li> Déterminer le facteur de réponse moyen des deux échantillons de facteur de réponse en divisant la surface sous la courbe (pic chromatographique) de 15 NAβ 1-42 avec la zone sous la courbe de natif Aß 1-42. </li><li> Ajuster la concentration du 15 NAβ 1-42 utilisée pour l&#39; étalonnage en le multipliant par le facteur de réponse calculé à l&#39; étape 9.2. </li><li> Construire une courbe d&#39;étalonnage en traçant les rapports de surface de 15 NAβ 1-42 à 13 CAβ 1-42 des deux ensembles de calibrateurs contre la concentration. </li><li> Calculer la pente et l&#39;ordonnée à l&#39;origine de la courbe d&#39;étalonnage en utilisant une régression linéaire. </li><li> Calculer le rapport de surface de Aß natif 1-42 à l&#39;étalon interne (13 CAβ 1-42) pour nondes échantillons connus. </li><li> Extrapoler la concentration des échantillons inconnus à partir de la courbe d&#39;étalonnage en utilisant la pente et l&#39;ordonnée à l&#39;origine obtenue à l&#39;étape 9.5. </li></ol>

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JP et EP ne font état d’aucune divulgation. HZ a siégé aux conseils consultatifs de Roche Diagnostics, d’Eli Lilly et de Pharmasum Therapeutics. KB a été consultant ou membre des conseils consultatifs de Fujirebio Europe, IBL International et Roche Diagnostics. HZ et KB sont cofondateurs de Brain Biomarker Solutions à Göteborg, en Alberta, une société de plateforme basée sur GU Venture à l’Université de Göteborg.

Pour le procédé décrit, au lieu d&#39;utiliser une matrice de substitution, on a utilisé la méthode de remplacement de l&#39; analyte 13, 14, 15, 16, ce qui permet un calibrage dans le LCR humain. L&#39;approche de l&#39;analyte de substitution implique deux normes marqués par des isotopes différents. L&#39; une (15 NAβ 142) est utilisé pour générer la courbe d&#39;étalon...

La maladie d&#39;Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence et affecte environ 35 millions de personnes à travers le monde 1. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie largement soupçonné d&#39;être au cœur de la pathogenèse de la MA sont des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires de protéine tau hyperphosphorylée 2 et plaques extracellulaires composées de agrégées bêta-amyloïde (Aß) peptides 3. Conformément à cela, l&#39;évaluation de la plaque pathologie in vivo par des biomarqueurs a récemment été inclus dans les critères diagnostiques de recherche pour AD 4. Pour les mesures de LCR de Aß 1-42, plusieurs analyses immunologiques sont disponibles et sont utilisés dans de nombreux laboratoires cliniques 5. La concentration de Aß 1-42 dans le LCR est d&#39; environ 50% plus faible chez les patients AD que chez les sujets âgés normaux sur le plan cognitif, ce qui reflète le dépôt du peptide dans les plaques dans le brain 6, 7. Ces biomarqueurs sont principalement analysés en utilisant des immunoessais (ie, les techniques à base d&#39; anticorps), mais ces essais peuvent être influencés par les effets de matrice 8. L&#39;utilisation d&#39;immunoessais sur différentes plates - formes technologiques et le manque de dosage normalisation 9, 10 permet l&#39;introduction de concentrations de coupure mondiales difficiles 11, 12. Un RMP analytiquement validé permettrait l&#39;étalonnage uniforme des différentes plates-formes de dosage, idéalement résultant en une meilleure comparabilité entre les plates-formes d&#39;analyse et un meilleur contrôle des facteurs qui contribuent à la variabilité globale de mesure. La quantification absolue de Aß 1-42 en utilisant la méthode LC-MS / MS développé surmonte un grand nombre des problèmes associés à la techn à base d&#39; anticorpsiques. La méthode, répertorié comme un PGR par le Comité commun pour la traçabilité en médecine de laboratoire (JCTLM base de données le numéro d&#39; identification de C11RMP9), sera utilisé pour déterminer la concentration absolue de Aß 1-42 dans un matériau de référence certifié (CRM) pour harmoniser CSF Aß 1 mesures -42 à travers des techniques et des plates - formes analytiques. Le workflow décrit devrait être de l&#39;intérêt pour le développement de méthodes de référence des candidats pour des peptides et des protéines dans d&#39;autres domaines de la médecine.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Microtubes à centrifuger, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0,75 mL Tubes en polypropylène, à fond en V</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Tubes utilisés pour collecter l’éluat SPE, mais d’autres dispositifs de collecte peuvent être utilisés tels que des plaques à 96 puits.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster pour tubes de 96 pouces</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Capuchons pour tubes Micronic.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 blanc avec couvercle haut code-barres</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>support pour tubes Micronic.</td></tr><tr><td>Embouts Biohit Optifit 1,2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Utilisé pour atteindre jusqu’au fond des plaques de puits profonds LoBind (96 puits). D’autres pointes étroites pourraient également fonctionner.</td></tr><tr><td>Eaux Oasis MCX 96-puits & micro ; Plaque d’élution</td><td>des eaux</td><td>186001830BA&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de collecteur à plaques</td><td>Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters Collecteur à plaques d’extraction pour Oasis à 96 puits Plaques</td> Waters <td>186001831</td><td></td>solution <td>d’hydroxyde</td></tr><tr><td>d’ammonium, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25 % base NH3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>Acide ortho-phosphorique 85 %, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidine, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Spectromètre de masse</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>Avec Dionex Ultimate 3000 LC et échantillonneur automatique fournis.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Colonne monolithique (1,0 x 250 mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, poudre lyophilisée, convient pour (pour la biologie moléculaire),</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td>non acétylé</tr><tr><td>Bêta-amyloïde (1-42), Ultra Pure, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Bêta-amyloïde (1-42), Uniformément étiqueté</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Bêta-amyloïde (1-42),</td><td>Agitateur de microplaques rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td>uniformément marqué,</tr><tr><td>TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml ; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

la quantification absolue de aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; dans le lcr aide d&#39;une référence procédure de mesure de spectrométrie de masse

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente chez les personnes âgées et représente 60 à 80 % de tous les cas de démence. Actuellement, le diagnostic de la MA est basé sur des tests cognitifs et des examens de l’état mental, mais le peptide bêta-amyloïde (Aβ) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) est de plus en plus utilisé dans les essais cliniques et les contextes. Comme pour la plupart des biomarqueurs protéiques et peptidiques, la quantification est effectuée à l’aide de techniques basées sur les anticorps, telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA). Cependant, la variabilité intra et inter-laboratoire de ces tests entrave son utilisation comme marqueur diagnostique dans la routine clinique.
Une procédure de mesure de référence (RMP) indépendante des anticorps a été développée sur la base de l’extraction en phase solide (SPE) et de la chromatographie liquide (LC)-spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), où des peptides Aβ stables et marqués par isotope ont été utilisés comme étalons internes, permettant une quantification absolue. Un instrument hybride quadripôle-orbite à haute résolution a été utilisé pour les mesures. La méthode permet de quantifier le LCR Aβ1-42 entre 150 et 4 000 pg/mL.

La configuration de la plaque à la figure 1 est utilisé pour une assiette pleine d&#39;échantillons. Si moins d&#39;échantillons inconnus sont à analyser, la deuxième calibrateur, RF, et QC ensembles doit être placé après la première moitié des échantillons inconnus. Comme on le voit sur la figure 2, les calibrateurs sont proches de la ligne de régression, avec de faibles écarts - types. Cette...

Une procédure de mesure de référence pour la quantification absolue de Aβ1-42 dans le LCR humain basée sur l’extraction en phase solide et la chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse en tandem est décrite.

La quantification absolue de Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; Dans le LCR aide d&#39;une référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

L'objectif général de cette procédure de mesure de référence est d'harmoniser les mesures d'un bêta dans le LCR humain. Cette méthode peut aider à normaliser les tests de dosage du bêta 42 du LCR, qui constitue un biomarqueur de la pathologie amyloïde centrale et un critère neuropathologique caractéristique de la maladie d'Alzheimer. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est entièrement validée et qu'elle n'utilise pas d'anticorps pour la quantification de l'AVR 142.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie de la maladie d'Alzheimer, car elle permettrait d'harmoniser les dosages et de faciliter l'introduction de seuils généraux dans les essais cliniques. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la pathologie amyloïde chez l'humain, elle peut également être appliquée à d'autres organismes vivants, tels que les souris transgéniques et les primates non humains, afin de développer de nouveaux médicaments. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'AVR 142 est très hydrophobe et peut facilement adhérer à des surfaces telles que les embouts de pipette et les tubes.Tout d'abord, ajoutez 40 microlitres de peptide bêta N15 à 0,46 millilitre d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Mélangez la solution peptidique à l’aide d’un vortex pendant une minute. Ajoutez ensuite 50 microlitres de la solution peptidique à 1,95 millilitre d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.Mélangez la solution de peptide dans un vortex pendant une minute. Ensuite, préparez six solutions étalons en mélangeant les volumes appropriés de chaque solution dans des tubes de microcentrifugation. Après avoir mélangé les solutions étalons, préparez les étalons finaux en double en mélangeant les volumes appropriés des solutions étalons correspondantes et de LCS humain dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 millilitre.Mélanger chaque solution dans un vortex pendant une minute. Pour préparer l'étalon interne, ajouter d'abord 32 microlitres du peptide 13C a beta à 1,968 millilitre d'acétonitrile à 20 % et d'ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de deux millilitres. Mélanger la solution peptidique dans un vortex pendant une minute.Ensuite, ajoutez 0,1 millilitre de la solution de peptide à 4,9 millilitres d'acétonitrile à 20 % et d'ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de cinq millilitres. Mélangez la solution de peptide dans un vortex pendant une minute. Pour préparer l'échantillon du facteur de réponse, ajoutez 40 microlitres de peptide bêta natif à 0,46 millilitre d'acétonitrile à 20 % et d'ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre.Après mélange, ajouter 20 microlitres de la solution de peptide et 20 microlitres de quatre microgrammes par millilitre de peptide 15N a bêta à 1,96 millilitre d’acétonitrile à 20 % et d’ammoniaque concentrée à 4 % dans un tube microcentrifuge de deux millilitres. Mélanger la solution de peptide au vortex pendant une minute. Ensuite, ajouter 20 microlitres de la solution de peptide à 0,38 millilitre de LCR artificiel dans un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre.Après avoir préparé les duplicatas, mélanger chaque solution dans un vortex pendant une minute. Après décongélation des échantillons sur un rouleau agitateur, ajouter 0,18 millilitre de chaque calibrateur, facteur de réponse et échantillon inconnu dans une plaque 96 puits profonds pour protéines d'un millilitre, en veillant à déposer les échantillons au fond ou à proximité du fond des puits. Ajouter ensuite 20 microlitres d'étalon interne dans chaque puits en libérant une goutte de l'étalon sur la paroi du puits, près de la surface de l'échantillon, sans immerger la pointe de la pipette.Ensuite, ajouter 0,2 millilitre de chlorure de guanidine à cinq molaire dans chaque puits. Placer la plaque d'échantillons sur un agitateur pour microplaque et mélanger les échantillons pendant 45 minutes à 1100 tr/min. Après le mélange, ajouter 0,2 millilitre d'acide phosphorique à 4 % dans chaque puits.Ensuite, placez la plaque d'échantillons sur l'agitateurs de microplaque et mélangez brièvement à 1000 tr/min. Placez un plateau réservoir pour les déchets sous une plaque d'extraction en phase solide (SPE) mixte à échange cationique de 96 puits, dans la chambre du support de plaque d'extraction. Ensuite, conditionnez le sorbant SPE en ajoutant 0,2 millilitre de méthanol dans chaque puits.Ensuite, équilibrer le sorbant en ajoutant 0,2 millilitre d'acide phosphorique à 4 % dans chaque puits. À l’aide d’une pipette à huit canaux, transférer tous les échantillons de la plaque à puits profonds vers la plaque SPE. Après cela, laver le sorbant deux fois après le passage des échantillons en ajoutant 0,2 millilitre d’acide phosphorique à 4 % dans chaque puits.Une fois que le solvant de lavage a été élué du sorbant, remplacez le plateau de réservoir par des tubes. Éluéz ensuite l'échantillon du sorbant en ajoutant deux aliquotes de 50 microlitres de 75 % d'acétonitrile et de 10 % d'ammoniaque concentrée, en notant que cette solution nécessite un vide très faible pour traverser le sorbant. Sèchez les éluats par centrifugation sous vide sans appliquer de chaleur.Enfin, sceller les tubes et les congeler à 80 degrés Celsius jusqu'à l'analyse. Les étalons se situent près de la droite de régression avec des écarts types faibles. Si l'étalonnage est non linéaire, la série doit être rejetée ; la déviation est très probablement due à des techniques de pipetage incorrectes et/ou à des erreurs lors de la dilution des étalons.Le coefficient de variation des réplicats devrait de préférence être inférieur à 10 %. Les isotopes naturels 15N et 13C d'une bêta sortent simultanément de la colonne de chromatographie liquide avec des pics quasi symétriques et sans traînage significatif. Au moins 10 mesures doivent être effectuées pour chaque pic et peuvent être ajustées à l'aide d'un temps d'injection maximal dans la méthode. Les peptides peuvent être mesurés simultanément pendant l'analyse en spectrométrie de masse, sauf si la sensibilité de la méthode est sous-optimale, auquel cas seuls les peptides d'intérêt doivent être mesurés pour chaque injection.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de toujours saturer les embouts de pipette avant de transférer la solution de peptide. Il est également essentiel d'utiliser des tubes ayant un volume mort aussi faible que possible.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la maladie d'Alzheimer pour explorer la concordance avec d'autres méthodes, telles que l'imagerie TEP amyloïde. Elle a également été utilisée pour attribuer des concentrations de bêta 142 à des matériaux de référence basés sur le LCR. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des étalons dans du LCR humain et de l'utilisation de l'extraction en phase solide avant l'analyse par LC-MS afin de mesurer la concentration absolue de bêta 142 dans des échantillons.N'oubliez pas que le travail avec le LCR humain peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants, de lunettes de protection et d'autres mesures de sécurité doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Source : Samuels, D. J., et al. Une approche basée sur la chromatographie liquide en tandem et la spectrométrie de masse pour l’analyse des métabolites de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’utilisation de la chromatographie liquide-spectrométrie de masse pour identifier et quantifier les métabolites intracellulaires de S. aureus. Il décrit les étapes impliquées dans l’extraction des métabolites, la normalisation des peptides, la chromatographie liquide et l’analyse...

Une approche basée sur la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse pour analyser les métabolites de S. aureus

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La quantification absolue de Aß

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