Name: Lincubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Apprenez une méthode d'incubation prolongée de tissus neuronaux aigus pour électrophysiologie et imagerie calcique sur plus de 24 heures. Cette technique réduit le nombre d'animaux nécessaires et maximise la collecte de données.

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Nous remercions Colin Symons et James Wright pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par une subvention de financement de démarrage (WSU) à Y.B. et au bureau de l’innovation de l’Université Western Sydney. M.C. est soutenu par la bourse ARC (DECRA).

Le protocole suivant décrit la préparation de C57BL / 6 et C3H / He (retinally dégénéré) un tissu neuronal de la souris, mais des techniques similaires peuvent être appliquées à d&#39;autres espèces. Tous les animaux étaient en bonne santé et manipulé avec les conditions normales de température, d&#39;humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, l&#39;accès libre à la nourriture et de l&#39;eau, et sans stimuli de stress destinés. Toutes les expériences ont été approuvées et effectuées en conformité avec comité de l&#39;Université Western Sydney Animal Care et de l&#39;éthique et selon l&#39;utilisation des animaux et des lignes directrices de soins (Animal Research Authority # A9452, # A10396 et # A8967). 1. Cerveau Slice Préparation <ol><li> Anesthésier l&#39;animal par inhalation d&#39;isoflurane (5%) et en utilisant une guillotine décapite des rongeurs. Retirer rapidement le cerveau, comme décrit précédemment 9 et le placer dans une solution physiologique glacée (aCSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 25NaHCO 3, 25 dextrose, et une solution saturée de carbogène (95% O 2/5% CO 2 du mélange; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Couper des tranches de cerveau dans la région d&#39;intérêt, de 300 um d&#39;épaisseur avec un microtome vibrant. </li><li> Transférer les tranches à un système d&#39;incubation intégré personnalisé qui surveille et contrôle les niveaux de pH (pH 7,2 à 7,4), le flux de carbogène et température comme décrit précédemment 10, 11. </li><li> Régler la température de la chambre initiale à 35 ° C pendant 15 - 30 min, puis réduire lentement à 15 - 16 ° C , comme le montre la figure 1C. Puis incuber des tranches dans le système d&#39;incubation jusqu&#39;à ce que nécessaire, que ce soit pour l&#39;électrophysiologie ou d&#39;imagerie. NOTE: Si les tranches doivent être utilisés pour le calcium-imagerie, suivez les étapes ci-dessous avant le tissu de refroidissement ci-dessous RT. </li></ol> 2. Retinal Wholemount Préparation et intérieure Limitation Membrane Removal <ol><li> Préparer des échantillons entiers rétiniens sous soit normalelaboratoire des conditions d&#39;éclairage ou rouge lumière infrarouge / dim. </li><li> Euthanasier animaux par dislocation cervicale et les yeux immédiatement énucléer. Faire une petite incision le long de la ora serrata, et le lieu dans les deux médias Ames, ou LCRa contenant (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, et sature avec du carbogène (95% O 2/5% CO 2 du mélange; ~ 300 mOsm; pH 7,4) à température ambiante. </li><li> Retirer immédiatement la cornée, le cristallin et vitreux en coupant le long de l&#39;ora serrata avec de petits ciseaux et retirer la lentille et le vitré avec une pince. Placer le tissu dans le système d&#39;incubation à la température ambiante. REMARQUE: le tissu rétinien peut être maintenue dans l&#39;œilleton, après réduction lente de la température à 15 - 16 ° C, pendant&gt; 24 h dans le système d&#39;incubation jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Pour supprimer l&#39;ILM, transférer l&#39;œil-tasse contenant la rétine à un petit pot de verre contenant de la papaïne 30 U / ml, 1 mM de L-cystine, EDTA 0,5 mM et 0,005% DNase dans Earl&#39;s-Une solution saline équilibrée (BSS) à 37 ° C pendant 20 min. Appliquer 95% O 2/5% de CO 2 à la solution à travers le couvercle mais ne pas bulle. En cas d&#39;utilisation de tissus de jeunes animaux (&lt;6 semaines), diluer la solution à demi-force. <ol><li> Arrêter la digestion enzymatique, en plaçant le tissu dans un ovomucoïde (10 mg / ml) et BSA (10 mg / ml), la solution pendant 10 min dans le BSS Earl. Laver soigneusement les tissus avec LCRa avant le transfert vers le système d&#39;incubation et de réduire la température à 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Maintenir le tissu rétinien dans l&#39;œil-tasse jusqu&#39;à ce que nécessaire. Pour le transfert au microscope, isoler la rétine de l&#39;œil-tasse et coupé en 4 morceaux avec une lame de rasoir. Si la rétine entière est nécessaire, faire quatre petites coupures dans la périphérie de la rétine pour lui permettre de reposer à plat. NOTE: Pour les expériences d&#39;imagerie, la charge avec le calcium-colorants avant le transfert vers le système d&#39;incubation, voir ci-dessous. </li></ol> 3. Le maintien de tissus dans l&#39;incubateur <ol><li&gt; Placez le tissu dans la chambre principale contenant des sondes pour pH et de la température (Figure 1A, B). </li><li> Circulez LCRa à travers une deuxième chambre (chambre UVC, construit comme décrit précédemment 12) isolé de la chambre principale et exposée à 1,1 W lumière UVC (254 nm, lampe UV 5W / 2P stérilisateur) pour irradier bactéries flottant dans la solution (Figure 1A). synchronisation de la lumière de contrôle UVC via une minuterie programmable à l&#39;aide d&#39;une fonction aléatoire qui est activée à des moments variant entre 15 et 26 min toutes les 15 - 30 min pour éviter un échauffement excessif de la LCRa. </li><li> Réglez le débit dans la chambre UVC à 12 mL / min comme indiqué précédemment 12. Couvrir la chambre UVC avec une feuille d&#39;aluminium pour empêcher l&#39;éclairage UVC en dehors de la chambre, ce qui peut endommager le tissu neuronal. NOTE: Pour le tissu rétinien adapté à l&#39;obscurité, appliquer une couverture sur mesure à la chambre principale pour exclure la lumière. </li><li> Utilisez une pompe péristaltique à Circulate la solution (LCRa) à travers les deux chambres et une plaque froide thermoélectrique Peltier glacière pour refroidir ou chauffer la chambre principale pour les températures souhaitées dans la plage de 0 - 50 ° C. Pour incubation optimale des tissus, utiliser 15 - 16 ° C pour la viabilité à long terme. </li></ol> 4. Calcium Dye Loading <ol><li> Sélectionnez les colorants de calcium en fonction de la préférence du chercheur individuel. Ici, nous utilisons Fura-2 heures, Fluo-huit heures ou Fluo-quatre heures. Cependant, cette méthode peut être appliquée à d&#39; autres colorants, ainsi: dissoudre les colorants de calcium dans le DMSO à une solution de 1 mM et 1% de copolymères séquencés (par exemple, l&#39; acide-127 Pluronic) jusqu&#39;à un volume final de 50 ul et de traitement par ultrasons pendant 10 min. </li><li> Ajouter une solution à LCRa à une concentration finale de 10 uM, les copolymères séquencés 0,01% pour des tranches de cerveau, et 20 uM (rétine), les copolymères séquencés 0,02% pour la rétine. Dans les rétines (papaïne traitées) et des tranches de cerveau de jeunes animaux, de la charge dans le bain pendant 45 minutes à 37 ° C (Fura-2 AM) ou à la température ambiante (Fluo-quatre heures; Fluo-8 AM). <ol><li> Pour les animaux adultes, (&gt; 12 semaines) pipeter les colorants (50 pi) directement sur les tranches de cerveau, et maintenir pendant 75 minutes pour permettre une meilleure pénétration du colorant dans les couches profondes. </li><li> Afin d&#39;assurer une oxygénation adéquate de la tranche immergée pendant colorant incubation, préparer une chambre de chargement de verre avec un couvercle fermé (pot circulaire de diamètre 2,5 cm, 3,5 cm de hauteur) avec des colorants de calcium dilué dans 2,5 ml de LCRa. Oxygéner en continu avec 95% O 2/5% CO 2. Ne pas bulle. </li></ol></li><li> Après charge de colorant, lavez le tissu avec LCRa et transfert vers le système d&#39;incubation, réduire lentement la température à 15 - 16 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;utilisation expérimentale. </li></ol> 5. électrophysiologique Recordings et imagerie <ol><li> Placer le tissu dans une chambre d&#39;enregistrement immergée sous un microscope, et perfuser avec oxygénées LCRa à un débit de 4 d&#39;écoulement - 5 ml / min, soit à température ambiante (~ 22 ° C) ou de la température physiologique (35 ° C). Hold le tissu en place à l&#39;aide d&#39;un rendu &#39;&#39; harpe &#39;&#39;, en nylon ou en or fils tendus et collés sur une pièce en forme de U de fil d&#39;or ou de platine. </li><li> Pour électrophysiologie: <ol><li> Préparer les pipettes d&#39;enregistrement de 1,5 mm (1,19 mm de diamètre) en verre borosilicate à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette pour obtenir une résistance finale de 5-6 MQ. </li><li> Remplir la pipette avec 3 - 4 pi de solution interne comme décrit précédemment 13 et visualiser les cellules sous infrarouge contraste d&#39; interférence différentiel (IR-DIC) à l&#39; aide d&#39; une caméra CCD. La solution intracellulaire doit être soigneusement adaptée à chaque expérience pour obtenir des résultats expérimentaux. </li><li> Position de la pipette, tout en maintenant une pression positive appliquée à travers un orifice d&#39;aspiration sur le porte-pipette sur la membrane d&#39;une cellule à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur. Étant donné que le GIP a été retiré de la rétine, sans grattage de la membrane préalable est nécessaire. Une fois que la pipette est sur la cellule, appliquer négative doucela pression à la pipette pour obtenir un joint d&#39;étanchéité gigaohm. Ensuite, la rupture de la membrane cellulaire par une brève quantité de pression négative. </li><li> Faire la cellule entière enregistrements ou opérations courantes voltage-clamp en utilisant des techniques standard, le cas échéant. </li></ol></li><li> Calcium-imagerie: <ol><li> Pour l&#39;imagerie ratiométrique de Fura-2, utiliser une longueur d&#39;onde de commutation de vitesse ultra-élevée pour fournir des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 340 nm, et 380 nm. Passez la lumière émise à partir de cellules individuelles à travers un filtre d&#39;émission de 510 ± 20 nm, et de capturer avec une haute sensibilité, un appareil photo numérique à haute vitesse. </li><li> Pour une seule longueur d&#39;onde d&#39;excitation de Fluo-4, la lumière filtre d&#39;excitation à travers un 460 - bande de filtre 490 nm de passage et la lumière émise par un 515 - 550 filtre passe-bande nm. Pour l&#39;enregistrement le plus rapide et le plus sensible utiliser un appareil photo numérique à haute vitesse tels. Acquérir les images selon les besoins. </li><li> Mesurer les modifications de fluorescence en fonction du temps, soit à une seule longueur d&#39;onde (Fluo-4) ou en utilisant le rapport de la longueur d&#39;ondeProcédé (Fura-2), tel que décrit ci- dessus 8, 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).</li>
<li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch10.pdf">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li>
<li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+photobiol+sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li>
<li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396(2014).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588(2015).</li>
<li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li>
<li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li>
<li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braincubator%3A+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen. London, UK. (1959).</li>
</ol>

Yossi Buskila et Paul Breen déclarent qu’ils sont copropriétaires de PAYO Scientific Pty Ltd, une société spécialisée dans la construction de systèmes d’incubation de tissus neuronaux aigus. Tous les autres auteurs ne signalent aucun intérêt financier ou conflit d’intérêts potentiel lié à l’étude actuelle.

Cet article décrit une méthode d&#39;incubation pour prolonger la viabilité du tissu neuronal aigu pour les expériences d&#39;imagerie et électrophysiologiques, réduisant ainsi le nombre d&#39;animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux. Deux processus principaux régissent la détérioration du tissu neuronal au fil du temps: i) l&#39; augmentation des niveaux de bactéries, et l&#39;augmentation d&#39; accompagnement dans l&#39; endotoxine bactérienne libérée, et ii) excitotoxicité qui suit la procédu...

Électrophysiologie et d&#39;imagerie fonctionnelle (calcium, tension colorants sensibles) sont deux des techniques expérimentales les plus couramment utilisés dans les neurosciences. Casse des préparations de tranche et wholemount rétinienne, qui sera examiné ici, fournissent un moyen d&#39;examiner les propriétés électrophysiologiques et la connectivité synaptique sans contamination par des anesthésiques ou des relaxants musculaires. Des tranches de cerveau et de la rétine wholemount conservent leur intégrité structurelle, à la différence des cultures ou des homogénats cellulaires, permettant l&#39;étude des circuits spécifiques et des réseaux cérébraux 1. Les enregistrements de tissu isolé présentent des avantages par rapport aux enregistrements in vivo que les mouvements associés au rythme cardiaque et la respiration sont éliminés. De plus, la visualisation directe permet à des classes spécifiques de cellules à cibler, et l&#39; application locale d&#39;outils pharmacologiques 2, 3. enregistrements de patch-clamp et calcium colorant chargement dans wholemount rétinienne est compliquée par l&#39;existence de l&#39;Inner Limitation de la membrane (ILM), qui couvre la couche rétinienne Ganglion cellulaire (RGC) et empêche l&#39;accès direct aux cellules. Typiquement, cette membrane est gratté avec une pipette en verre pour permettre une application directe d&#39;une pipette de patch et la formation d&#39;un joint d&#39;étanchéité gigaohm sur une seule cellule. En outre, les colorants de calcium bain appliquée ne traversent pas la ILM et doivent soit être injectés sous cette membrane 4, rétrogressivement transporté après l&#39; injection au niveau du nerf optique 5 ou électroporation à travers le tissu 6. En outre, lorsqu&#39;on utilise un modèle de rongeur de la rétinite pigmentaire, le rd / rd souris, la MLI est plus épaisse et plus impénétrable. Ici, nous utilisons une technique pour éliminer l&#39;ILM à la digestion enzymatique 7, pour permettre à la fois du calcium omniprésent colorant chargement, et un accès direct à des cellules ganglionnaires de la rétine pour patch-clamp recordings 8. enregistrements réussis provenant soit des tranches de cerveau ou wholemount rétinienne dépendent de la dissection et l&#39;incubation du tissu neuronal viable. Typiquement, le tissu est extrait le matin de l&#39;expérience et mis en incubation dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit utilisé pour l&#39;enregistrement. En général, le tissu reste viable pour les 6 - 8 h, à une dégradation importante qui suit cette fenêtre temporelle. Cependant, les deux tranches de cerveau et les préparations de rétines wholemount produisent habituellement plus de tissu que peuvent être enregistrées à partir de cette courte période de temps. Par conséquent, le tissu est souvent mis au rebut à la fin de la journée et de la dissection est achevée à nouveau les jours suivants. Cela signifie un autre animal est utilisé et ~ 2 h de la configuration et la dissection / coloration répétée. Le protocole suivant décrit une méthode pour prolonger la vie de tissu neuronal pendant plus de 24 h, ce qui signifie moins d&#39;animaux sont utilisés, et le temps plus expérimental est disponible. Tissue viabilité wcomme évalué par l&#39;enregistrement des propriétés électrophysiologiques et la dynamique de calcium, et ces propriétés ne se distinguaient pas entre &lt;4 h et&gt; 24 h postdissection. Ces résultats indiquent que non seulement les propriétés des cellules individuelles intactes et fonctionnelles après une incubation prolongée, mais l&#39;activité du réseau, tel qu&#39;évalué par imagerie du calcium et des enregistrements électrophysiologiques, est inchangé&gt; 24 h postdissection. En outre, nous montrons que les colorants de calcium dans les cellules peuvent rester pendant des périodes prolongées sans provoquer d&#39;effets secondaires nuisibles. L&#39;application de ce protocole démontre que l&#39;activité fonctionnelle des neurones dans le tissu neuronal aiguë peut être maintenue pendant de longues périodes, une fois que l&#39;environnement extérieur est très réglementé. En outre, comme la viabilité des tissus varie grandement entre les laboratoires en raison de protocoles d&#39;incubation différents, cette méthode établit une norme d&#39;or pour les paramètres idéaux qui devraient être appliqués pour réduire la variabilité de la santé de neu aiguëtissus ronal.

<table><tbody><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-méthyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington&nbsp ;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimethyl sulfoxyde anhydre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Faible absorbance UV*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>Solution à 20 % dans DMSO&nbsp ;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Microtome à lame vibrante&nbsp ;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>équipé de Leica' s Vibrocheck&trade ; appareil de mesure&nbsp ;</td></tr><tr><td>Table antivibratoire</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp ;</td><td>Vibraplane 9100/9200&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit à platine fixe</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Objectif de microscope</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp ;</td></tr><tr><td>Objectif microscope</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>Commutateur de longueur d’onde haute vitesse</td><td>Instrument</td><td>Sutter Lambda DG-4&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur patch clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg ; Système</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Extracteur de micropipettes de type flamant/brun</td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement/de perfusion</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath</td></tr><tr><td>Chambers Logiciel</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie de cellules vivantes Andor Andor</td><td></td><td>iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Refroidisseur de plaque froide thermoélectrique Peltier,</td><td>technologie TE CP-121</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>régulateur de température</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25, RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;incubation prolongée de aiguë neuronal tissus pour électrophysiologie et calcium-imagerie

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Aiguë des préparations de tissus neuronaux, des tranches de cerveau et wholemount rétinienne, ne peuvent généralement être conservés pendant 6-8 heures après dissection. Cela limite la durée de l&#39;essai, et augmente le nombre d&#39;animaux qui sont utilisés pour l&#39;étude. Cette limitation spécifiquement les impacts des protocoles tels que l&#39;imagerie calcique qui nécessitent une pré-incubation prolongée avec des colorants de bain appliqués. la croissance bactérienne exponentielle dans les 3 - 4 h après le découpage en tranches est étroitement corrélée avec une diminution de la santé des tissus. Cette étude décrit un procédé pour limiter la prolifération des bactéries dans les préparations aiguës pour maintenir le tissu neuronal viables pendant des périodes de temps prolongées (&gt; 24 h) sans avoir recours à des antibiotiques, des procédures stériles ou milieux de culture tissulaire contenant des facteurs de croissance. Par un cycle du fluide extracellulaire par irradiation UV et de maintenir le tissu dans une chambre de maintien de la commande à 15 - 16 ° C, le tissu ne montre aucune différence dans les propriétés électrophysiologiques, ou si de calciumgnaling par des colorants de calcium intracellulaire à&gt; 24 h postdissection. Ces méthodes ne seront pas seulement prolonger le temps expérimental pour ceux qui utilisent le tissu neuronal aigu, mais permettra de réduire le nombre d&#39;animaux nécessaires à la réalisation des objectifs expérimentaux, et établira une norme d&#39;or pour l&#39;incubation de tissu neuronal aiguë.

une régulation stricte de la charge bactérienne et la température du LCRa pendant l&#39;incubation est essentiel pour maintenir la viabilité des tissus neuronaux. Ceci peut être optimisée par l&#39; irradiation avec de la lumière UV - C et en maintenant la température du LCRa à 15 - 16 ° C (figure 1). En outre, le LCRa paramètres timbre (APS; Figure 1C) fournit l&#39;expérimentateur avec un enregistrement des conditions environnementales (pH et la tempér...

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d&#39;incubation unique, qui surveille de près et régule l&#39;environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour&gt; 24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

L'objectif général de cette technique est de maintenir le tissu neuronal pendant de longues périodes sans dégradation tissulaire significative. Grâce à cette méthode, des enregistrements électrophysiologiques et des imageries calciques peuvent être réalisés plus de 24 heures après l'extraction du tissu. Cette méthode augmentera considérablement la viabilité du tissu neuronal fraîchement extrait et permettra de maintenir sa viabilité pendant plus de 24 heures, établissant ainsi une nouvelle norme de référence pour l'incubation de tissus aigus.Le principal avantage de cette technique est que le temps expérimental pendant lequel le tissu peut être utilisé est considérablement augmenté. Cela réduit le nombre d'animaux nécessaires et maximise la quantité de données pouvant être obtenues à partir de chaque expérience. Le Braincubator est un système automatisé qui maintient la température du tissu et empêche la prolifération bactérienne dans le liquide extracellulaire.Ceci fournit un environnement strictement contrôlé pour le tissu. Cette procédure sera démontrée par Orsolya Kekesi et Alba Bellot-Saez, étudiantes au doctorat de mon laboratoire. Pour la préparation des tranches de cerveau, préparez des tranches de cerveau de 300 micromètres d'épaisseur contenant la région d'intérêt à l'aide d'un vibratome.Ensuite, transférez les tranches dans un système d'incubation sur mesure avec un flux de carbogène, un pH et une température régulés. Réglez la température initiale de la chambre à 35 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes, puis réduisez-la lentement à 15 degrés Celsius. Incubez ensuite les tranches dans le système d'incubation jusqu'à l'enregistrement en électrophysiologie ou l'imagerie.Pour la préparation de montages complets de rétine, énucléer immédiatement les yeux d'un animal euthanasié. Effectuer une petite incision le long de l'ora serrata et placer les yeux dans du milieu Ames ou du aCSF, avec un apport de carbogène, à température ambiante. Ensuite, retirer immédiatement la cornée, le cristallin et le vitré en coupant le long de l'ora serrata avec de petites ciseaux, puis les extraire à l'aide de pinces.Placer le tissu dans le système d'incubation à température ambiante. Pour éliminer la membrane limitante interne, transférer la cupule oculaire contenant la rétine dans un petit bocal en verre contenant de la papaine, de la L-cystéine, du EDTA et de la DNase à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Appliquer du carbogène à la solution à travers le couvercle, mais ne pas faire barboter.Arrêter la digestion enzymatique en plaçant le tissu dans une solution d'ovomucoïde et de BSA pendant 10 minutes dans du BSS d'Earle. Laver ensuite soigneusement le tissu avec du aCSF. Transférer par la suite le tissu vers le système d'incubation et abaisser la température à environ 15 à 16 degrés Celsius.Ensuite, transférez le tissu rétinien vers le microscope. Isolez la rétine de la cupule oculaire et coupez-la en quatre morceaux à l’aide d’un scalpel. Si l’ensemble de la rétine est nécessaire, effectuez quatre petites incisions en périphérie de la rétine afin de permettre son aplatissement.Ce tissu peut désormais être transféré vers le microscope pour l'électrophysiologie ou maintenu dans le Braincubator. Le tissu est conservé dans la chambre principale contenant les sondes de mesure du pH et de la température. Une seconde chambre est isolée de la chambre principale et est exposée à une lumière UVC de 1,1 watt afin d'irradier les bactéries en suspension dans la solution.Utilisez une pompe péristaltique pour faire circuler le LCRa à travers les deux chambres, et une plaque froide thermoélectrique Peltier pour refroidir ou chauffer la chambre principale. Dans cette procédure, dissolvez le colorant calcique dans le DMSO afin d'obtenir une solution d'un millimolaire. Ajoutez de l'acide pluronic F-127 à 1 % au mélange pour atteindre un volume final de 50 microlitres.Ensuite, soumettez-le à une sonication pendant 10 minutes. Préparez une chambre de chargement en verre avec un colorant calcique dilué dans 2,5 millilitres de aCSF afin d'obtenir une concentration finale de 10 micromolaire pour les tranches de cerveau et de 20 micromolaire pour la rétine. Pour les tranches de rétine et de cerveau provenant d'animaux jeunes, incubez l'échantillon dans le bain pendant 45 minutes.Pour les animaux adultes, déposer 25 microlitres de colorant directement sur la tranche de cerveau et laisser agir pendant 75 minutes afin de permettre une meilleure pénétration du colorant dans les couches profondes. Pour assurer une oxygénation adéquate du tissu immergé pendant l'incubation avec le colorant, oxygéner en continu avec du carbogène à travers le couvercle, sans toutefois faire barboter. Après le chargement du colorant, rincer le tissu avec du LCRa et le transférer vers le système d'incubation.Réduisez lentement la température jusqu'à environ 15 à 16 degrés Celsius avant utilisation. Pour l'enregistrement, placez le tissu dans une chambre d'enregistrement submergée sous un microscope et perfusez-le avec du aCSF oxygéné à un débit de quatre à cinq millilitres par minute. Maintenez le tissu en place à l’aide d’un harp personnalisé.Ensuite, préparez quelques pipettes d'enregistrement à l'aide d'un tireur de micropipettes afin d'obtenir une résistance finale de cinq à six mégohms. Remplissez une pipette avec trois à quatre microlitres de solution interne, puis placez la solution sur de la glace. Visualisez ensuite les cellules à l'aide d'une caméra CCD en utilisant l'optique IR-DIC.Positionnez la pipette sur la membrane cellulaire à l'aide d'un micromanipulateur. Maintenez une pression positive par l'intermédiaire d'un orifice d'aspiration sur le porte-pipette. Une fois la pipette en place sur la cellule, appliquez une pression négative douce à la pipette afin d'obtenir un scellement de gigaohm.Ensuite, rompre la membrane cellulaire à l'aide d'une brève pression négative. Par la suite, commencer l'enregistrement en mode courant ou tension en configuration de cellule entière. Pour l'imagerie ratiométrique de la Fura-2, utiliser un commutateur de longueurs d'onde à très haute vitesse afin de fournir des longueurs d'onde d'excitation de 340 nanomètres et 380 nanomètres.Ensuite, captez la lumière émise à l’aide d’un filtre d’émission et d’une caméra numérique haute sensibilité et haute vitesse. Pour une longueur d’onde d’excitation unique de Fluo-4, filtrez la lumière d’excitation à travers un filtre passe-bande de 460 à 490 nanomètres, et la lumière émise à travers un filtre passe-bande de 515 à 550 nanomètres. Après digestion, les cellules ganglionnaires rétiniennes et les cellules amacrines déplacées peuvent être clairement visualisées en éclairage DIC et peuvent être ciblées pour des enregistrements en configuration whole-cell sans aucun écaillage préalable de la membrane limitante interne.Des enregistrements représentatifs en mode courant constant provenant d'une cellule ganglionnaire rétinienne sont présentés ici. La dépolarisation de la cellule par la pipette de patch a induit une génération d'potentiels d'action dépendante de la dose, indiquant la viabilité des cellules après traitement à la papaine. La suppression de la membrane limitante interne a également permis une coloration ubiquitaire de la couche des cellules ganglionnaires avec le Fura-2 AM. Les cellules ont répondu à l'application de chlorure de potassium à 30 millimolaire par une forte augmentation de la concentration calcique intracellulaire, comme en témoigne une augmentation du rapport entre 342 et 380 nanomètres par rapport à F0. Après l'application de chlorure de potassium, les niveaux de calcium sont revenus à la ligne de base suite à la stimulation.Et les cellules pouvaient être ultérieurement stimulées pour produire une réponse d'amplitude similaire. De plus, ces réponses étaient indistinguables entre les rétines enregistrées moins de quatre heures et plus de 24 heures après la dissection. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le tissu neuronal aigu est vulnérable aux variations environnementales.Par conséquent, une régulation stricte du LCR artificiel par une surveillance étroite du pH, de la température et des niveaux bactériens est essentielle pour maintenir l'activité cellulaire et l'intégrité du réseau. Cette procédure permet de conserver un tissu neuronal pendant plus de 24 heures sans nécessiter de techniques aseptiques ni l'utilisation de milieux de culture contenant des facteurs de croissance ou des antibiotiques susceptibles d'affecter la physiologie. Nous espérons que cette méthode établira la référence en matière de paramètres idéaux pour maximiser la viabilité du tissu.Cela réduit la variabilité de la santé du tissu lui-même et, par conséquent, diminue la variabilité expérimentale. L'utilisation du protocole à base de papaine pour digérer la membrane limitante interne de la rétine permet d'obtenir une coloration ubiquitaire avec des colorants calciques. Ce protocole peut également être utilisé pour obtenir des enregistrements intracellulaires multipoints à partir de neurones de la couche des cellules ganglionnaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de maintenir un tissu viable pendant plus de 24 heures pour des expériences d'imagerie et d'électrophysiologie. N'oubliez pas que le travail avec la lumière ultraviolette peut être dangereux. Des précautions, telles que le port de lunettes de protection, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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