À l’aide de In Vitro imagerie de cellules vivantes pour explorer les agents chimiothérapeutiques livré par nanoparticules à base de lipides

L'objectif général de cette technique d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes est de suivre des processus cellulaires tels que l'absorption et la distribution d'agents chimiothérapeutiques, sans nécessiter de fixation. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, notamment : comment les agents chimiothérapeutiques, sous forme libre ou encapsulés dans des nanoparticules, sont internalisés par les cellules tumorales. Le principal avantage de cette technique réside dans l'imagerie de cellules vivantes, évitant ainsi les artefacts liés à la fixation et permettant une évaluation dynamique en temps réel.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en observant que les nanoparticules se dégradaient pendant la fixation, ce qui conduisait à une interprétation erronée du vecteur thérapeutique. Pour assembler la chambre d'imagerie, placez un couvre-objet de 25 millimètres au fond de la chambre, puis vissez la partie supérieure sur la partie inférieure. Ne serrez pas trop fort, car le verre pourrait se briser.

Stériliser l'ensemble de la chambre en autoclave. Pour ensemencer les cellules, retirer la chambre d'observation du sac de stérilisation dans une cabine d'écoulement laminaire. Visser soigneusement la chambre et la placer dans une boîte de Pétri.

Recouvrir le verre de la chambre d'imagerie avec un millilitre de gélatine stérile à 0,1 pour cent pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5 pour cent de dioxyde de carbone. Après avoir retiré le milieu des flacons de culture cellulaire, laver les cellules une fois avec du PBS 1x et détacher les cellules à l'aide de trypsine à 0,25 pour cent. Inactiver la trypsine en ajoutant du milieu de culture cellulaire.

Ensuite, recueillez les cellules et centrifugez-les à 1 100 g pendant cinq minutes. Resuspendez le culot dans cinq millilitres de milieu de culture cellulaire. Après avoir dénombré les cellules selon le protocole décrit dans le texte, aspirez la gélatine et ensemencez les cellules à une dilution permettant une couverture maximale de 70 pour cent en 24 heures.

Laisser les cellules adhérer à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Évaluer les cellules au microscope pour la confluence, la morphologie cellulaire et la contamination. Ensuite, allumer le microscope confocal, la lumière fluorescente et l'ordinateur.

Connectez le chauffage de l'objectif à l'objectif et réglez-le à 35 degrés. Préparez l'unité d'incubation comme indiqué dans le protocole écrit. Placez l'unité d'incubation sur la platine du microscope et connectez les tubes d'entrée et de sortie de dioxyde de carbone.

Ouvrez le robinet principal de dioxyde de carbone et mettez en marche le contrôleur de dioxyde de carbone. Vérifiez que le contrôleur est réglé à cinq pour cent de CO2. Des conditions appropriées de culture cellulaire, telles que la température, le CO2, le pH, l'humidité et la stérilité, sont cruciales pour l'imagerie cellulaire à long terme.

Par conséquent, chaque incubateur doit être correctement testé. Régler la température du plateau à 37 degrés Celsius. Laisser l’unité d’incubation atteindre la température sélectionnée et le pourcentage de dioxyde de carbone.

Prendre la chambre d'observation depuis l'incubateur principal de dioxyde de carbone et transporter la chambre dans une boîte de Pétri jusqu'à la salle de microscopie. Placer la chambre d'observation dans un support personnalisé pour plateau de 35 millimètres de diamètre et fermer la chambre avec un couvercle d'étanchéité sur mesure. Ouvrir l'unité d'incubation et, en travaillant aussi rapidement que possible afin d'éviter le refroidissement des cellules, remplacer le patch rouge par la chambre d'observation, puis refermer l'unité.

Veillez à ce qu'aucun câble ne soit coincé entre la platine et le microscope. Laissez l'appareil s'acclimater pendant 30 minutes. Ensuite, ouvrez le logiciel et allumez le laser.

Créez une nouvelle base de données en cliquant sur Nouveau sous l'onglet Fichier. Nommez et enregistrez la base de données. Définissez la configuration en cliquant sur Configurer sous l'onglet Acquérir.

Sélectionnez le « Mode canal » et « Piste unique » pour évaluer un fluorophore unique. Sélectionnez « Piste multiple » pour plusieurs fluorophores. Ensuite, choisissez les filtres appropriés de bande passante, en les adaptant au fluorophore.

Sélectionnez le canal de champ clair sur l'une des pistes. La numérisation implique un compromis entre le signal fluorescent des composés et la qualité de l'image. La surexposition, le photoblanchiment, le rapport signal sur bruit, la qualité des cellules et les composés ajoutés sont tous des facteurs pouvant influencer les résultats et doivent être correctement testés.

Définissez le contrôle de balayage en cliquant sur Balayage sous l'onglet Acquérir. Ensuite, cliquez sur Mode pour régler la taille de l'image, la vitesse de balayage, le sens de balayage et la moyenne de balayage. Cliquez sur Canaux pour régler le diaphragme, le gain et le décalage, ainsi que la puissance du laser.

Enregistrez ces paramètres en cliquant sur Config dans l'onglet Configuration et sauvegardez-les dans la base de données de configuration. Réglez l'intervalle de temps en cliquant sur Muti TimeX dans l'onglet Macro. Cliquez sur Emplacement unique.

Appliquez la configuration enregistrée en cliquant sur Piste unique et faites défiler jusqu'à la configuration requise dans la base de données de configuration. Réglez l'intervalle de temps et le nombre d'analyses. Chargez la configuration en cliquant sur Charger la conf.

Donnez un nom au laps-temps dans le champ Nom de fichier de base et sélectionnez la base de données en cliquant sur Base de données d'images pour enregistrer le laps-temps. Définissez un dossier temporaire en cliquant sur Dossier d'images temporaire. Ensuite, ouvrez l'unité d'incubation, soulevez l'anneau d'imagerie, ajoutez une goutte d'huile à immersion sur l'objectif, puis refermez l'unité aussi rapidement que possible. Focalisez et sélectionnez une position dans la chambre d'imagerie.

Dans la hotte à flux laminaire, diluez le médicament libre ou les nanoparticules à une concentration de cinq microgrammes par millilitre de médicament ou de 0,05 micromole de lipides dans du milieu de culture cellulaire. Filtrez à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micron si le médicament ou les nanoparticules ne sont pas stériles. Ouvrez la chambre d’incubation et soulevez le couvercle supérieur.

Ensuite, retirez le milieu des cellules, ajoutez un millilitre de médicament dilué ou de nanoparticules, puis fermez l'unité le plus rapidement possible. Concentrez-vous sur les cellules et effectuez une numérisation rapide en cliquant sur « Single » dans l'onglet Scan Control. Lorsque l'image en champ clair montre des cellules au foyer, démarrez l'acquisition en laps de temps en cliquant sur « Start Time » dans le macro Multi TimeX.

Le nombre de répétitions et le temps restant sont indiqués dans la macro et sur les images. Vérifiez régulièrement si les cellules sont toujours au point, ou utilisez la mise au point automatique. Le programme enregistre automatiquement le laps de temps dans la base de données.

Ne fermez pas la base de données pendant l'exécution du programme. Il s'agit d'une vidéo en accéléré de trois heures montrant des cellules exposées à de la doxorubicine libre. Observez l'absorption et le translocation immédiate de la doxorubicine fluorescente rouge vers le noyau.

Ici, les cellules sont incubées pendant trois heures avec de la doxorubicine encapsulée. Le signal fluorescent est beaucoup plus faible et se localise dans le cytoplasme. Le signal est à peine visible dans le noyau.

En transférant ces films en accéléré vers ImageJ, une région d'intérêt peut être dessinée autour du noyau et la densité de pixels peut être mesurée. Le graphique présenté ici montre la différence d'absorption nucléaire au fil du temps dans des cellules incubées avec de la doxorubicine libre ou encapsulée. Sont montrées ici des cellules incubées avec de la doxorubicine encapsulée, indiquée en rouge.

Le signal violet représente le transporteur et les lysosomes sont marqués avec un traceur vert pour cellules vivantes. La comparaison des deux types cellulaires révèle une différence dans la distribution lysosomale. Les lysosomes des cellules B16BL6 sont répartis dans tout le cytoplasme.

Tandis que les lysosomes des cellules BLM sont situés près du noyau. Cependant, les deux lignées cellulaires montrent une forte colocalisation du signal rouge et violet dans les lysosomes, indiquant que la doxorubicine et son vecteur sont piégés dans ces organites. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'imaginer l'absorption d'agents chimiothérapeutiques et d'autres marqueurs fluorescents dans des cellules vivantes pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours.