Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

L’objectif général de ce protocole est d’analyser le routage dendrique des neurones médullaires de la drosophile adulte en colonnes et en couches afin de caractériser les motifs dendriques, de déterminer les types de cellules en fonction de la morphologie et d’identifier les mutants. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, notamment la cartographie des circuits cérébraux et la compréhension du mécanisme de câblage de la dendrite. Le principal avantage de cette technique est qu’elle transmet les propriétés dendritiques dans l’espace tridimensionnel, améliorant ainsi la compréhension de la logique et des fonctions de câblage dendritique.

Le but de cette procédure est d’acquérir deux piles d’images des neurones d’intérêt dans deux orientations orthogonales, horizontales et frontales. En utilisant les techniques standard, la coloration a disséqué le cerveau de mouches avec de l’anti-GFP de lapin et un anticorps qui marque les axones photorécepteurs des anticorps primaires. Ensuite, marquez les anticorps primaires avec des anticorps secondaires fluorescents et nettoyez le cerveau avec 70 % de glycérol et 1X PBS.

Pour monter le cerveau dans l’orientation horizontale, transférez un cerveau éliminé au glycérol dans une goutte de 20 microlitres de milieu de montage anti-décoloration déposée au centre de la lame de microscope. Ensuite, sur une lamelle, fixez de petites plaques d’argile aux quatre coins pour éviter que la lamelle n’écrase le cerveau. Maintenant, sous un microscope à dissection, positionnez les cerveaux en position ventrale vers le haut.

Utilisez la surface dorsale convexe du cerveau comme point de repère pour identifier l’orientation de l’échantillon de cerveau. Cela fournira une vue horizontale du neurone. Fixez ensuite la lamelle.

À l’aide d’un microscope confocal, idéalement équipé de détecteurs GaAsP, obtenez la pile d’images à vue horizontale avec un objectif à haute ouverture numérique et un zoom numérique de 2,5. Acquérir au moins 180 sections optiques, avoir 512 pixels carrés et une taille de pas de 2 microns. Après avoir pris la première pile d’images, retirez la lamelle de la lame et repositionnez le cerveau en position antérieure vers le haut qui offre une vue frontale.

Ensuite, en utilisant la même technique, faites une nouvelle pile d’images de la vue frontale des mêmes neurones imagés dans la vue horizontale. Assurez-vous également de noter l’emplacement du neurone d’intérêt par rapport au neuropal de la moelle. L’identification des mêmes neurones est réalisable sous un grossissement plus faible.

Cependant, si le signal est perdu parce que le tissu est profond, imaginez simplement la moitié ventrale de votre cerveau. Vérifiez également si l’échantillon s’est déplacé lors de l’acquisition des images en examinant les piles d’images. La convolution d’image et la combinaison d’images sont détaillées dans le protocole texte.

Le but de cette procédure est de tracer les neurites et d’attribuer des points de référence pour l’enregistrement. Ouvrez d’abord le fichier image recombiné. Allez ensuite dans Modifier.

Ensuite, affichez le réglage de l’affichage et désactivez le canal photorécepteur, qui est rouge. Visualisez ensuite l’image en mode surpassement. Si l’ordinateur est équipé d’un système stéréographique, activez la stéréo et utilisez le mode quadruple tampon pour visualiser les images 3D.

Ajoutez de nouveaux filaments, allez dans surpasser, puis filaments, et cliquez sur l’onglet intitulé sauter la création automatique, modifier manuellement. Cliquez ensuite sur l’onglet Dessiner et sélectionnez Profondeur automatique. Ensuite, sélectionnez les paramètres.

Basculez l’option de ligne et entrez le numéro de pixel approprié pour une meilleure visualisation. Ensuite, basculez l’affichage des dendrites, le point de départ et le point de branchement, et réglez la qualité de rendu sur 100 %Sélectionnez maintenant l’onglet Dessiner et commencez à tracer les neurites. Commencez par l’axone, puis passez aux dendrites.

L’axone et les dendrites des neurones trans-médullaires devraient être faciles à différencier. Après avoir tracé les neurites, revenez aux paramètres et désactivez-les à la fois le point de départ et le point de branchement. Allez ensuite dans dépasser, puis exporter.

Sélectionnez l’objet et enregistrez le filament en tant que fichier d’inventeur. L’étape suivante consiste à attribuer des points de référence. Pour commencer, sélectionnez Afficher le réglage de l’affichage et activez les deux canaux d’imagerie.

Passez ensuite au dépassement, puis à la mesure. Et sous l’onglet d’édition, basculez un canal spécifique et sélectionnez le canal photorécepteur dans ce cas. Attribuez maintenant des points de référence pour la couche supérieure.

Sélectionnez le dépassement, puis les points de mesure, et marquez le début de la couche m1 en tant que couche supérieure. Utilisez la fonction de plan de coupe pour faciliter l’affectation des points. L’ordre des points est équatorial, équatorial antérieur, antérieur, ventral antérieur, ventral, ventral postérieur, postérieur, postérieur, équatorial postérieur et central.

Pour trouver le photorécepteur central, c’est celui associé aux processus les plus dendritiques. Ensuite, attribuez les points de référence aux couches R8 et R7 en utilisant la même technique. Après avoir défini chaque ensemble de points de référence, exportez les coordonnées.

Sélectionnez les statistiques, puis les valeurs détaillées, spécifiques et la position. Sélectionnez ensuite exporter les statistiques sur l’onglet Afficher dans le fichier, puis enregistrez les coordonnées sous forme de fichier CSV. Ensuite, ouvrez les trois fichiers CSV dans un éditeur de tableur.

Copiez et collez les coordonnées des 27 points de référence dans un nouveau fichier, en suivant l’ordre du haut, R8, puis R7. Procédez en suivant le protocole de texte pour la normalisation de l’enregistrement non linéaire des corps rigides et du TPS jusqu’à la configuration ventrale droite dans le calcul des fréquences de ramification et de terminaison dendritiques. En fin de compte, les données sont utilisées pour réaliser divers graphiques informatifs. À l’aide de la procédure d’imagerie à double vue présentée ici, le cerveau d’une mouche contenant des neurones tm 20 peu marqués a été imagé dans deux directions orthogonales.

La recombinaison de l’image améliore la résolution axiale. L’image recombinée a une meilleure résolution que celles des images en vue horizontale et en vue frontale. Après consultation de modèles 3D, des traces dendritiques ont été collectées sur 15 tm 20 neurones et comparées à des traces dendriques sur 15 tm 2 neurones.

Les probabilités de ramification et de terminaison de ces neurones ont été analysées. Les deux types étaient similaires pour les segments de moins de 4 microns. L’analyse spécifique à la couche de la terminaison dendritique a montré que les deux types de neurones se distribuent de manière distincte et spécifique à la couche.

Les dendrites Tm 2 reçoivent des entrées en m2 et en m5. Tandis que les dendrites tm 20 se terminent dans la couche m1 à m3. L’analyse planaire montre que les dendrites tm 2 se projettent vers l’avant, tandis que les dendrites tm 20 se projettent vers l’arrière.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’acquérir deux de vos images confocales. Lisez vos marques d’étude sur les fichiers d’imagerie et extrayez les propriétés dendritiques de ces images. Lors de cette procédure, il est important de marquer correctement l’échantillon avant l’imagerie confocale.

Comme la combinaison d’imagerie échouera si l’échantillon se déplace pendant l’imagerie.