Name: Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Apprenez à quantifier la migration cellulaire avec un dispositif mécanique à huit canaux dans une plaque 96 puits. Cette méthode semi-haut débit permet d'évaluer rapidement les effets des traitements sans équipement coûteux.

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Les auteurs tiennent à remercier M. Tam Po Leung, M. Wong Chi Kin et le personnel technique de la Faculté des sciences Atelier, Hong Kong Baptist University, pour leurs compétences techniques et des conseils pour rendre le prototype de ce wounder.

1. Introduction aux parties du wounder (Figure 1) <ol><li> Préparer le porte-broche en fixant les broches blessantes à des distances égales. Tenez les embouts de pipette et d&#39;ajuster la hauteur de la pointe en déplaçant les broches blessantes réglables de haut en bas. </li><li> Monter le guidage-bar ajustable sur différentes marques de plaques de culture de 96 puits et de veiller à ce que la zone de la blessure est dans une position fixe. </li><li> Fixer la tige de blessure réglable en serrant la vis à tête hexagonale. Fixer la barre de guidage en position en serrant la tête bouchons à six pans creux sur les deux extrémités. </li></ol> 2. Réglage de la largeur du titulaire Pin (Figure 2) <ol><li> Desserrez les bouchons de tête à six pans creux avec la clé hexagonale M5. </li><li> Insérer un nombre approprié de bagues de réglage sur les deux côtés du porte-broches de sorte que les barres de guidage correspondent parfaitement à la largeur de la plaque de culture à 96 puits. NOTE: Corning et plaques Iwaki nécessite 1 paire de grands anneaux et 1 paire de petits anneaux. Falcon et Nunc plAtes besoin 1 paire de grands anneaux. </li><li> Serrer la tête de douille hexagonale bouchons pour fixer la barre de guidage. </li></ol> 3. Réglage des barres de guidage (Figure 3) <ol><li> Monter les goupilles blessant avec 10 ul embouts de pipette en plastique stériles. </li><li> Desserrez les bouchons de tête à six pans creux avec la clé hexagonale M5. </li><li> Tenez le wounder et tremper les tiges blessantes dans une colonne d&#39;une plaque de culture à 96 puits. </li><li> Réglez la hauteur des barres de guidage jusqu&#39;à ce que tous les conseils à peine toucher le fond des puits. </li><li> Serrer les bouchons de tête à six pans creux. Assurez-vous que le wounder maintenant correspond parfaitement sur la plaque de culture et que les broches sont bien placés dans le milieu des puits. </li></ol> 4. Calibrage des Pins <ol><li> Tenir la wounder perpendiculaire à une surface stérile plat (c. -à -boîte de Pétri) et desserrer toutes les vis à tête hexagonale avec la clé hexagonale M3. </li><li> Appuyez sur le wounder jusqu&#39;à ce que tous les conseils uniformément toucher la surface stérile plat. &lt;/ Li&gt; <li> Serrer les vis à tête hexagonale à nouveau pour verrouiller les broches en position. </li><li> Vérifier la planéité de chaque pointe en appuyant sur le wounder doucement sur la surface stérile plat. </li></ol> 5. Scratching monocouche de cellules (Figure 4) <ol><li> Seed cellules ombilicales humaines endothéliales vasculaires sur une plaque à 96 puits revêtu de gélatine à 0,1% de la culture cellulaire. les cellules de culture en milieu 199 supplémenté avec 20% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin, 1% de pénicilline / streptomycine et 0,09 g / L de l&#39;héparine. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone à 37 ° C pendant une nuit avant d&#39;être utilisé. Les cellules doivent atteindre 100% de confluence avant blessant. </li><li> Placer les pointes blessantes à l&#39;extrême gauche (ou droite) latérale de chaque puits dans la même colonne de la plaque de culture. Faites glisser le wounder travers de l&#39;autre côté du puits; assurez-vous que les conseils blessantes touchent le fond du puits. </li><li> Répétez le grattage (étape 5.2) pour toutes les colonnes. </li><li> Après la blessure, défausse til milieu de chaque puits et le remplacer par un milieu contenant des composés d&#39;essai frais. </li></ol> Acquisition de données 6. et analyse d&#39;images <ol><li> L&#39;ensemble d&#39; image bien avec la blessure mécanique sur la monocouche cellulaire en utilisant un microscope de faible puissance avec un appareil photo numérique (par exemple un objectif 10X) immédiatement après la blessure (t = 0 h). </li><li> Ajouter des composés d&#39;essai, si désiré et laisser incuber pendant la durée souhaitée. L&#39;ensemble d&#39;image bien avec la surface de la plaie à nouveau après le temps d&#39;incubation désirée (t = Dh). </li><li> En utilisant l&#39; image des logiciels d&#39;analyse tels que ImageJ ( <a href="https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/</a> ), mesurer la zone blessée sur l&#39;image en utilisant l&#39;outil à main levée. </li><li> Calculer le pourcentage de fermeture de la plaie: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55411/55411eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prespecification+and+plasticity%3A+shifting+mechanisms+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
<li>Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+replication+in+endothelial+regeneration%3A+a+study+using+irradiated+endothelial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures.</a> Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).</li>
<li>Gotlieb, A. I., Spector, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+into+an+in+vitro+experimental+wound%3A+a+comparison+of+porcine+aortic+endothelial+and+smooth+muscle+cells+and+the+effect+of+culture+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation.</a> Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).</li>
<li>Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparsion+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+repair+process+involved+in+the+repair+of+a+cell+monolayer+using+an+in+vitro+model+of+mechanical+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury.</a> Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).</li>
<li>Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+quantifying+cell+migration%2F+wound+healing+in+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates.</a> J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).</li>
<li>Yue, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanisms+underlying+the+angiogenic+effects+of+ginsenoside+Rg%281%29+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro.</a> Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).</li>
<li>Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenoside-Rg1+induces+angiogenesis+by+the+inverse+regulation+of+MET+tyrosine+kinase+receptor+expression+through+miR-23a%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Notre wounder cellulaire a plusieurs caractéristiques uniques pour résoudre les problèmes des tests traditionnels de migration cellulaire. La wounder mécanique à 8 canaux cellule est réalisée en acier inoxydable de haute qualité (acier 304) avec une longue durée de vie qui peut être stérilisé par autoclavage. Presque toutes les marques commerciales de plaques de culture à 96 puits disponibles sur le marché peuvent être utilisés avec ce wounder mécanique des cellules en raison de la barre de guidage réglable. La concepti...

La migration cellulaire joue un rôle important dans les processus cellulaires, tels que l&#39; embryogenèse, la neurogenèse, l&#39; angiogenèse, la cicatrisation, la réparation des muqueuses, épithélio-mésenchymateuse transitions en cours de développement normal et la situation de la maladie 1. Il est un processus complexe qui implique la coordination de nombreux événements internationaux et intra-cellulaires , y compris la signalisation des interactions moléculaires, la polarisation de la cellule, la réorganisation du cytosquelette, remodelage de la matrice, protrusion de la membrane et cellule-cellule dynamique adhérence modulation 2. En étudiant la migration cellulaire, la découverte et la validation des produits chimiques ou des biomolécules conduisant à un mouvement cellulaire et les voies biochimiques apparentées peuvent être déterminées. Ce processus fondamental peut être utilisé avantageusement en tant que proxy pour diverses applications, telles que le traitement de la maladie et le ciblage de médicaments. L&#39;essai est blessant l&#39; un des essais de migration cellulaire 3. Ici, unéchantillon individuel de cellules sera partiellement éliminé par des moyens mécaniques pour produire une zone dénudée où les cellules migrent pour couvrir la zone. Le pourcentage de récupération à un point de temps particulier sera surveillé. Lors de la manipulation grand nombre d&#39;échantillons, des questions telles que le coût expérimental et la contamination croisée dans les échantillons peuvent être problématiques. Bien que de nombreux outils commerciaux et des essais sont disponibles pour l&#39; étude de la migration des cellules 4, 5, 6, beaucoup d&#39;entre eux nécessaire un équipement coûteux et sophistiqué et des améliorations sont encore nécessaires. Pour ces raisons, un wounder cellulaire mécanique à 8 canaux (figure 1) est développée. Notre wounder mécanique 8 canaux cellulaire a incorporé plusieurs caractéristiques uniques pour résoudre les problèmes mentionnés ci-dessus. Il offre la possibilité d&#39;effectuer la migration des cellules / blesser les dosages dans le format de plaque de culture à 96 puits. Le réglage gubar design Iding veille à ce que la zone de zéro est dans la position centrale de chaque puits. En outre, la hauteur des barres de guidage peut être ajustée de sorte que la wounder est applicable pour les différentes marques de plaques de culture. Enfin, la conception de la broche de blessure réglable permet un contact même des pointes de pipette à la surface de la plaque de culture pour obtenir une blessure simultanée et reproductible 7, 8.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 96 puits</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>D’autres marques de plaque de culture cellulaire à 96 puits peuvent également être utilisées</td></tr><tr><td>Pointes de pipette P10</td><td>Axygen</td><td>301-03-051</td><td>La pointe de pipette courte P10 est plus facile à créer une plaie claire</td></tr><tr><td>Wounder</td><td>R& P Technology Limited</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture approprié et une condition pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Sel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture approprié et des conditions pour d’autres types de cellules.</td></tr><tr><td>Gélatine de peau bovine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Pour la culture cellulaire de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine. Utiliser un milieu de culture et une condition appropriés pour d’autres types de cellules.</td></tr></tbody></table>

un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / wound healing dans une plaque à 96 puits

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

La migration cellulaire / blessure dosage est une méthode couramment utilisée pour étudier la migration cellulaire et d&#39;autres processus biologiques tels que l&#39;angiogenèse et les métastases tumorales. Dans cet essai, les cellules sont cultivées pour former une monocouche confluente et une blessure mécanique est créée par grattage avec un périphérique. Ensuite, le taux des cellules vers la zone dénudée de migration peut être surveillé par imagerie. Notre wounder mécanique à 8 canaux est conçu pour traiter la plupart des problèmes liés à la détermination de la migration cellulaire. Tout d&#39;abord, notre wounder peut être facilement stérilisé par autoclavage ou avec des désinfectants courants. Deuxièmement, les broches individuels réglables permettent même le contact avec la plaque de culture cellulaire de telle sorte que les plaies vives et reproductibles peuvent être créés. Troisièmement, les barres de guidage des deux côtés de la position de wounder assurent une blessure constante dans chaque puits. L&#39;utilisation de jetables conseils de pipette en plastique pour blesser peut en outre assurer une meilleure gestion de la wounder ainsi que pour minimiser les contre-contamination. En conclusion, notre wounder cellulaire peut fournir aux chercheurs un dispositif convivial et reproductible utilisateur pour effectuer le test de migration des cellules en utilisant la plaque standard de culture de 96 puits.

Cette wounder mécanique 8 canaux est construit de façon à gratter une monocouche cellulaire afin d&#39;effectuer le test de migration des cellules. Il est un dispositif convivial qui peut effectuer des essais grattage de cellules dans des plaques à 96 puits en moins d&#39;une minute sans formation spéciale. Ce wounder peut introduire des zones enroulées sur des monocouches de cellules avec une largeur uniforme d&#39;environ 600 pm et présentant des arêtes vives (figures 5</strong...

Ici, nous présentons un protocole pour effectuer un test de migration des cellules semi-haut débit sur une plaque de culture cellulaire de 96 puits. Ce protocole est une méthode rapide, simple et économique pour créer des blessures à gratter cohérentes sur une monocouche cellulaire.

Un dispositif pour effectuer la migration cellulaire / Wound Healing dans une plaque à 96 puits

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

L'objectif général de ce bobineur mécanique de cellules à huit canaux est de quantifier l'effet d'un traitement sur la migration cellulaire à l'aide du test de cicatrisation des lésions, de manière rapide et semi-haute performance, sans recourir à des équipements coûteux et complexes. La migration cellulaire est un processus cellulaire important dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. Les tests in vitro de cicatrisation des lésions sont utilisés dans diverses études, notamment en cancérologie, en recherche cardiovasculaire et en dermatologie.Le principal avantage de cette méthode est que l'effet sur la migration cellulaire peut être surveillé sur une plaque à 96 rails, permettant d'observer simultanément différentes conditions de traitement. La procédure sera démontrée par Ka Chun Ng, étudiant diplômé de notre laboratoire. Pour commencer l'expérience, préparez le porte-épingles en fixant les épingles de blessure à des distances égales.Tenez les embouts de pipette et déplacez les broches de blessure réglables vers le haut et vers le bas afin d'ajuster la hauteur des embouts. Ensuite, fixez la barre de guidage réglable sur différentes marques de plaques de culture en 96 puits et assurez-vous que la zone de blessure soit en position fixe. Fixez la broche de blessure réglable en resserrant la vis hexagonale.Fixez la barre de guidage en position en resserrant les vis à tête hexagonale aux deux extrémités. Utilisez une clé hexagonale M5 pour desserrer les vis à tête hexagonale. Insérez un nombre approprié de bagues de réglage des deux côtés du porte-épingle afin que les barres de guidage s'ajustent parfaitement à la largeur de la plaque de culture de 96 puits.Ensuite, serrez les vis à tête hexagonale pour fixer la barre de guidage. Commencez par ajuster les barres de guidage en insérant les broches de blessure dans des embouts de pipette plastiques stériles de 10 microlitres. Puis, desserrez les vis à tête hexagonale à l’aide de la clé hexagonale M5.Tenez le dispositif de blessure et trempez les broches de blessure dans une colonne d'une plaque de culture de 96 puits. Réglez ensuite la hauteur des barres de guidage jusqu'à ce que toutes les pointes effleurent à peine le fond des puits. Serrez les vis à tête hexagonale.Veillez à ce que le dispositif d'incision s'adapte parfaitement à la plaque de culture et que les broches soient bien positionnées au centre des puits. Maintenez le dispositif perpendiculairement à une surface plane et stérile, comme une boîte de Pétri, puis desserrez toutes les vis hexagonales à l’aide de la clé Allen M3. Tapez doucement sur le dispositif jusqu’à ce que toutes les pointes touchent uniformément la surface.Une fois que les embouts touchent uniformément la surface, resserrez à nouveau les vis hexagonales pour verrouiller les broches en position. Vérifiez ensuite l’uniformité de chaque embout en tapotant doucement l’appareil sur une surface plane et stérile. Ensemencez des cellules endothéliales vasculaires humaines du cordon ombilical sur une plaque de culture cellulaire de 96 puits revêtue de gélatine à 0,1 %.Cultiver les cellules dans le milieu 199 supplémenté avec 20 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,09 gramme par litre d'héparine. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit avant utilisation. Une fois que les cellules ont atteint une confluence à 100 %, placer les embouts de blessure du côté le plus à gauche de chaque puits dans la même colonne de la plaque de culture.Faites glisser l'appareil de griffure jusqu'à l'autre côté du puits. Assurez-vous que les pointes de griffure touchent le fond du puits. Pour garantir que la lésion dans chaque puits de la plaque cellulaire soit centrée et présente la même orientation, faites pivoter l'appareil de griffure en l'étendant d'un bout à l'autre du puits.Répétez le grattage pour toutes les colonnes. Après la blessure, jetez le milieu de chaque puits et remplacez-le par du milieu frais contenant les composés testés. Ensuite, passez à l'acquisition des données et à l'analyse d'images.Des images représentatives d'une rangée et d'une colonne de puits prises immédiatement après le grattage permettent une analyse quantitative de la largeur de chaque plaie. Les images de plaie ont été obtenues à partir de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine et de fibroblastes dermiques humains. La ligne en pointillés indique la zone de la plaie et la ligne continue indique la zone de migration cellulaire.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cet appareil pour réaliser un test de cicatrisation des plaies dans une plaque de 96 puits de manière semi-haute performance et vous assurer que chaque puits est rayé par l'outil de création de la plaie.

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