Name: L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Découvrez un test de biosenseur conductimétrique utilisant une β-lactamase chimérique pour détecter les interactions anticorps-antigène. Cette méthode rapide et économique mesure le relargage de protons pour surveiller les liaisons biomoléculaires en temps réel.

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Les auteurs reconnaissent la région wallonne dans le cadre des projets de recherche SENSOTEM et NANOTIC, ainsi que le National fonds pour la recherche scientifique (F.R.S-F.N.R.S) pour leur soutien financier.

1. protein préparation des échantillons
<ol><li>Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre précédente étude15. Stocker la protéine en 50 mM tampon phosphate pH 7.4 composée comme suit : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dissous dans 800 mL d’eau distillée Difficulté le pH de la solution à 7,4 avant réglage du volume final de la solution à 1 L. filtre stériliser la solution protéique.</li>
	<li>Préparer une solution-mère poule blanc d’oeuf lysozyme (lysozyme). Dissoudre 100 mg (40 000 unités/mg) de lysozyme acheté dans le commerce dans 10 mL de solution saline le tampon au phosphate (PBS voir étape 2.1.1). Stériliser la solution protéique en filtrant à l’aide de filtres avec un seuil de 0,22 μm.</li>
</ol>2. tests de biocapteur
<ol><li>
Préparation de solution et tampon
	<ol>
<li>Préparer 50 mM PBS en dissolvant les 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4et 0,24 g de KH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH 7,4 avec 1 N HCl ou NaOH N 1 avant d’ajuster le volume de la solution à 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de saturation/blocage en dissoudre 3 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de liaison en dissolvant 1 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de lavage (0,1 % Tween - PBS) en ajoutant 100 μL de Tween 20 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de préparation des électrodes (1 % Triton X-100-PBS) en ajoutant 1 mL de Triton X-100 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de régénération de l’électrode (KCl 3,5 M) en 26 g de KCl dans l’eau distillée pour un volume final de dissolvant 100 mL. Filtre stérilisé et conserver à 4 ° C.</li>
		<li>Préparer une solution de NaCl de 5 mM en dissolvant 0,29 g de NaCl dans l’eau distillée pour un volume final de 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C. Ensuite, préparer une solution de détection (4 mM benzylpénicilline) en dissolvant 26,7 mg de benzylpénicilline dans 20 mL de 5 mM NaCl solution. Filtre à stériliser et conserver à-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Régénération et préparation de capteur Remarque : La polyaniline enduit capteur puces ont été élaborées et aimablement fournis par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La description de la sonde ainsi que les protocoles d’electro-polymérisation de polyaniline utilisés pour synthétiser ces capteurs sont détaillées dans leurs précédents travaux17. En bref, ce système utilise des capteurs réutilisables de huit jetons individuels qui ont été fabriqués par des techniques classiques de circuits imprimés Conseil (PCB). Puces individuelles sont composées de trois électrodes ronds points. Celui du haut est l’électrode de travail sur lequel polyaniline a été synthétisé electro. Celle du milieu est l’électrode de référence et l’électrode inférieure constitue la contre-électrode. La référence et les électrodes de compteur sont fonctionnalisés en utilisant des amalgames Ag/AgCl solide sur le dessus de la couche de carbone.<ol>
<li>Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution de préparation des électrodes (voir Triton X-100-PBS, 1 % étape 2.1.5.). Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.</li>
		<li>Rincer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’eau distillée pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.</li>
		<li>Régénérer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits de la solution de régénération (3,5 M KCl, reportez-vous à l’étape 2.1.6) durant la nuit à 4 ° C ou 1 h à température ambiante.</li>
		<li>Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1.). Effectuer chaque lavage pendant 2 minutes avec un mélange doux à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liaison test effectué sur le capteur
	<ol>
<li>Couche lysozyme sur PANI (polyaniline) la surface de l’électrode en déposant une goutte de 15 µL de 40 µg/mL lysozyme préparé dans du PBS sur la surface de l’électrode. Incuber une nuit à 4 ° C ou 1 heure à température ambiante.</li>
		<li>Effectuer trois lavages des électrodes avec une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1) en plongeant les pièces de l’électrode des puces capteur dans puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate. Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.</li>
		<li>Saturer les électrodes en ajoutant une goutte de 50 µL de la solution de saturation (voir étape 2.1.2) sur la surface de l’électrode. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver trois fois comme décrit dans la précédente étape (voir étape 2.3.2).</li>
		<li>Diluer la solution BlaP-cAb-Lys3 à 20 µg/mL en solution de liaison (voir étape 2.1.3) et appliquez une goutte de 15 µL de cette solution diluée sur les électrodes. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Après la réaction antigène-nanobody, se laver trois fois comme décrit à l’étape précédente à l’aide de la solution de lavage (voir étape 2.1.4). Ensuite, rincez l’électrode une fois avec du PBS (voir étape 2.1.1).</li>
		<li>Pour la détection, branchez la puce du capteur via la partie cuivre-circuits à un multimètre numérique. Puis, lancer la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 µL de solution de détection (voir étape 2.1.7) sur les électrodes positives et en appliquant une goutte de 50 µL de solution de NaCl 5 mM sur les électrodes négatives (voir étape 2.1.7). Incuber 30 min à température ambiante. Surveiller la conductance avec un multimètre numérique. Remarque : Le multimètre a été fourni par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Cette potentiostat est contrôlé par l’ordinateur via un port USB et analyse les huit différentes puces du capteur en même temps. Le logiciel créé par Yunus et collègues17 crée un tracé en temps réel qui représente la mesure de la différence de conductivité entre les électrodes de référence et l’échantillon contre la montre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li>
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<li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+of+antibody+binding+sites%3A+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li>
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<li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test%2C+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li>
<li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li>
<li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li>
<li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay%22%5BJournal%5D)">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li>
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<li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li>
<li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.gsma.com/connectedliving/wp-content/uploads/2013/06/Socio-economic_impact-of-mHealth_EU_14062013V2.pdf">Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union</a>. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce travail, nous présentons une méthode pour fonctionnaliser un nanobody à l’aide de la β-lactamase BlaP comme protéine porteuse et nous montrons que nous pouvons implémenter avec succès la protéine hybride résultant dans un essai de capteur potentiométrique. La principale innovation de notre travail par rapport aux autres tests biocapteur est le couplage covalent de la partie de l’anticorps à l’activité enzymatique qui génère le signal électrique. Cette technologie d’insertion dite protéine présente des avantages e...

Biocapteurs sont des dispositifs analytiques qui combinent une interaction biomoléculaire avec les dispositifs de signalisation physiques ou chimiques appelés transducteurs1. Les signaux enregistrés soient interprétés et convertis pour surveiller les interactions entre les partenaires immobilisées et libres. La plupart des biocapteurs impliquent l’utilisation d’un anticorps pour détecter les analytes tels que les hormones ou autre agent pathogène marqueurs2. Formats de capteur différent peuvent être utilisés et comprennent des biocapteurs basée sur la masse, magnétiques, optiques ou électrochimiques. Ces derniers sont parmi les plus couramment utilisé des détecteurs et fonctionnent en convertissant un événement de liaison en un signal électrique. Les interprétations et exécutions et les sensibilités de tous les dérivés des anticorps biocapteurs dépendent essentiellement de deux paramètres : i) la qualité de l’anticorps et ii) les propriétés du système utilisé pour générer le signal2.
Les anticorps sont des protéines dimères masse moléculaire élevé (150 – 160 kDa) qui sont composées de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. L’interaction entre les chaînes légères et lourdes est surtout stabilisée par des interactions hydrophobes, mais aussi une liaison disulfure conservée. Chaque chaîne comporte un domaine variable qui interagit avec l’antigène essentiellement par l’intermédiaire de trois régions hypervariables nommé complémentaires détermination de régions (CDR1-2-3). Malgré les nombreuses avancées dans le domaine, l’expression à grande échelle des anticorps pleine longueur avec des systèmes d’expression peu coûteux (p. ex., e. coli) mène souvent à la production de protéines instables et agrégées. C’est pourquoi divers fragments d’anticorps ont été conçus comme des fragments de chaîne unique variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Ils sont constitués des domaines variables des lourds respectivement un et un seul chaînes légères qui sont liées de façon covalente par une séquence d’acides aminés synthétiques. Toutefois, ces fragments souvent affichent une faible stabilité et ont tendance à regrouper, car ils exposent une grande partie de leurs régions hydrophobes au solvant4. Dans ce contexte, camélidés fragments d’anticorps, appelés nanocorps ou HHV, semblent être d’excellentes alternatives à ScFvs. Ces domaines correspondent à des domaines variables des anticorps de chaîne unique de camélidés. Contrairement aux anticorps traditionnels, les anticorps de camélidés sont dépourvues de chaînes légères et ne contiennent que deux chaînes lourdes5. Par conséquent, les nanocorps sont les fragments anticorps monomère plus petits (12 kDa) capables de se lier à un antigène avec une affinité semblable à celle des anticorps traditionnels6. En outre, ils présentent une stabilité et une solubilité par rapport à d’autres anticorps pleine longueur ou des fragments d’anticorps. Enfin, leurs petites tailles et leurs longues boucles CDR3 laissez-les reconnaissent des épitopes cryptiques et lier à l’enzyme sites actifs7,8. De nos jours, ces domaines suscitent un intérêt considérable et ont été combinés à la technologie des biocapteurs. Par exemple, Huang et al. ont mis au point un biocapteur axée sur les nanobody pour la détection et la quantification de l’antigène prostatique spécifique (PSA) humaine9.
Comme mentionné ci-dessus, un paramètre important dans les essais de biocapteur est l’efficacité du système utilisé pour générer le signal électrique. Pour cette raison, les biocapteurs électrochimiques à base d’enzymes ont attiré une attention croissante et ont été largement utilisés pour diverses applications telles que les soins de santé, la sécurité alimentaire et surveillance de l’environnement. Ces biocapteurs s’appuient sur l’hydrolyse catalytique d’un substrat par une enzyme pour générer le signal électrique. Dans ce contexte, β-lactamases se sont révélés être plus précis, plus sensible et plus facile à mettre en œuvre expérimentalement que beaucoup d’autres enzymes comme la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort10. Β-lactamases sont des enzymes qui sont responsables de la résistance bactérienne aux antibiotiques β-lactamines par hydrolyse d’eux. Ils sont des monomères, très stable, efficace et de petite taille. En outre, insertions de domaine/peptide dans les β-lactamases génèrent bifonctionnel protéines chimériques qui se sont avérés être des outils efficaces pour étudier les interactions de protéine-ligand. En effet, les études récentes ont montré qu’insertion de fragments d’anticorps variable dans les résultats de β-lactamase TEM1 dans une protéine chimérique qui reste capable de se lier avec une haute affinité pour l’antigène cible. Fait intéressant, la liaison de l’antigène a été montrée pour induire la régulation allostérique de TEM1 activité catalytique11,12. En outre, nous avons montré dans plusieurs études que l’insertion de domaine protéine dans une boucle permissive de la β-lactamase de BlaP Bacillus licheniformis génère fonctionnelles protéines chimériques qui conviennent bien à surveiller les interactions protéine-ligand13 ,,14. Nous avons récemment inséré un nanobody, nommé cAb-Lys3, dans ce site d’insertion permissive de BlaP15. Cette nanobody a été montré pour lier au lysozyme de blanc d’oeuf-poule (lysozyme) et d’inhiber son activité enzymatique16. Nous avons montré que la protéine hybride généré, nommée BlaP-cAb-Lys3, conservé une grande spécificité / affinité contre lysozyme tandis que l’activité de la β-lactamase est restée inchangée. Ensuite, nous avons réussi combinée à la technologie hybride de β-lactamase à un Biocapteur électrochimique et a montré que la quantité de signal électrique généré dépendait de l’interaction entre BlaP-cAb-Lys3 et lysozyme immobilisée sur une électrode. En effet, l’hydrolyse des β-lactamines par BlaP induit une libération de protons qui peut être convertie en un signal électrique quantitatif. Cette combinaison de la technologie hybride de β-lactamase avec un Biocapteur électrochimique est quantitative, sensible et rapide et permet de mesurer en temps réel du signal généré. Cette méthode est décrite dans les présentes.

<table><tbody><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>V000225&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>1551128</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris&ndash ; HCl</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>alanine</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>HClO4</td><td>Fluka</td><td>34288</td><td>1M HClO4 solution, distributeur : Sigma-Aldricht</td></tr><tr><td>hydrolysat de caséine</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>22090</td><td></td></tr><tr><td>benzylpénicilline sodique</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>B0900000</td><td></td></tr><tr><td>lysozyme de blanc d’œuf</td><td>de poule Roche</td><td>10837059001</td><td></td></tr><tr><td>heptane</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>solution d’hydroxyde d’ammonium</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>380539</td><td>28 % NH3&nbsp ; en H2O, purifié par double distillation (concentré ?)</td></tr><tr><td>Consommables de laboratoire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits&nbsp ;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>CELLSTAR 6-Well Plate</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>WTW</td><td>1AA110</td><td>PH-mètre de laboratoire inoLab pH 7110</td></tr><tr><td>système de vide et de filtration</td><td>Nalgene</td><td>NALG300-4100</td><td>Porte-filtres avec récepteur, distributeur :</td></tr><tr><td>Puces</td><td></td><td></td> de capteur potentiométrique VWR <td>fabriquées par Yunus et collègues (ref 16)</td></tr><tr><td>PGSTAT30 Autolab</td><td>Metrohm Autolab</td><td></td><td>abandonné, successeur Autolab PGSTAT302N</td></tr><tr><td>multimètre numérique, METRAHit 22M</td><td>Gossen Metrawatt</td><td></td><td>abandonné, successeur Metrahit Base</td></tr></tbody></table>

l’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des interactions biomoléculaires

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biocapteurs deviennent de plus en plus important et mis en œuvre dans différents domaines tels que la détection des pathogènes, diagnostic moléculaire, la surveillance environnementale et contrôle de sécurité des aliments. Dans ce contexte, nous avons utilisé des β-lactamases comme enzymes journaliste efficace dans plusieurs études sur les interactions protéine-protéine. En outre, leur capacité à accepter des insertions de peptides ou de protéines/domaines structurés fortement encourage l’utilisation de ces enzymes pour produire des protéines chimériques. Dans une étude récente, nous avons inséré un fragment d’anticorps à domaine unique dans la β-lactamase de Bacillus licheniformis BlaP. Ces petits domaines, également appelés nanocorps, sont définis comme le domaine de liaison antigène anticorps seule chaîne camélidés. Comme les anticorps double chaîne commune, ils montrent des affinités élevées et les spécificités de leurs cibles. La protéine chimérique qui en résulte ont montré une grande affinité contre sa cible tout en conservant l’activité β-lactamase. Ceci suggère que les fractions nanobody et β-lactamases restent fonctionnelles. Dans le présent travail, nous présentons un protocole détaillé qui combine notre système de β-lactamase hybride à la technologie des biocapteurs. La fixation spécifique de la nanobody vers sa cible peut être détectée grâce à une mesure conductimétrique des protons libérés par l’activité catalytique de l’enzyme.

Conception et l’ingénierie des protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3
La figure 1 représente l’insertion du cAb-Lys3 dans une boucle permissive de la β-lactamases de classe A BalP Bacilluslicheniformis. L’insertion a été effectuée entre les résidus Asp198 et Lys199. Un site de clivage de la thrombine a été introduit sur chaque côté du cAb-Lys3. Cellules transformés avec un expression constitutive de plasmide codant la protéin...

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

L'objectif général de ce dosage par biocapteur conductimétrique est de détecter des interactions biomoléculaires, en utilisant la technologie hybride de bêta-lactamase. Nous décrivons une méthode permettant de détecter des interactions anticorps-antigène, à l'aide d'une protéine chimérique de bêta-lactamase. Le principe de cette méthode repose sur la détection de la liaison par la mesure du relâchement de protons lors de l'activité de la bêta-lactamase.L'avantage principal de cette technique par rapport aux immunosenseurs classiques réside dans l'utilisation d'une bêta-lactamase chimérique, permettant des tests de détection moins coûteux et plus rapides grâce à une protéine hybride pour détecter les analytes. La procédure sera démontrée par Mathieu Dondelinger, chercheur diplômé. Commencez cette procédure par la préparation de l'échantillon protéique et des solutions, comme décrit dans le protocole écrit. Préparez l'électrode réutilisable en immergeant les pointes dans les puits d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution de préparation de l'électrode pendant deux minutes, avec un mélange doux à température ambiante.Répétez cette étape trois fois. Ensuite, rincez les électrodes en immergeant les pointes dans des puits d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits d'eau distillée pendant deux minutes, avec un mélange doux à température ambiante. Pour régénérer les électrodes, immergez les pointes dans des puits d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution de régénération, pendant toute la nuit à quatre degrés Celsius ou pendant une heure à température ambiante.Ensuite, effectuez trois lavages des électrodes en immergeant les extrémités dans des puits d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution saline tamponnée au phosphate. Réalisez chaque lavage pendant deux minutes avec un mélange doux à température ambiante. Recouvrez la surface de polyaniline de l'électrode de lysozyme d'albumen d'œuf de poule en déposant une goutte de 15 microlitres de 40 microgrammes par millilitre de HEWL préparée dans un tampon phosphate sur la surface de l'électrode.Incuber l'électrode une heure à température ambiante. Ensuite, effectuer trois lavages des électrodes avec du tampon phosphate en immergeant les parties électrodes des puces capteurs dans des puits d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de tampon phosphate. Réaliser chaque lavage pendant deux minutes avec un mélange doux à température ambiante.Saturer les électrodes en ajoutant une goutte de 30 microlitres de solution de blocage sur la surface de l'électrode. Incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, laver trois fois comme précédemment.Effectuez une dilution des solutions de BlaP-cAb-Lys3 ou de BlaP à 20 microgrammes par millilitre dans le tampon de liaison. Ensuite, appliquez une goutte de 15 microlitres de cette solution diluée sur les électrodes. Incubez les électrodes pendant une heure à température ambiante.Après la réaction entre l'anticorps et l'antigène, laver les électrodes trois fois avec la solution de lavage. Ensuite, laver les électrodes du capteur dans le tampon de détection en immergeant les électrodes dans une cavité d'une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de tampon de détection. Puis incuber brièvement pendant une minute.Pour la détection, connectez le multimètre numérique à l'ordinateur. Ensuite, branchez la puce capteur au multimètre numérique via la partie en circuit de cuivre. Déclenchez la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 microlitres de solution de benzylpénicilline à quatre millimolaire sur les électrodes marquées positivement.Appliquez une goutte de 50 microlitres de la solution de détection sur les électrodes marquées négatives afin de servir de témoin négatif. Surveillez les valeurs conductométriques à l’aide du multimètre numérique connecté pendant 30 minutes. Visualisez les données en temps réel directement sur l’écran, ou exportez les données numériques sous forme de fichier texte.Ces données brutes peuvent être tracées afin de créer un graphique représentant les mesures des variations de conductivité entre les électrodes de référence et d'échantillon en fonction du temps. Pour construire la protéine chimérique, la bêta-lactamase de classe A BlaP a été utilisée comme protéine support. Ici, les résidus catalytiques sont présentés en rouge.Le site d'insertion situé dans une boucle exposée au solvant est indiqué en jaune. Le fragment d'anticorps de camélidé nommé cAb-Lys3 a été inséré dans BlaP. La protéine chimérique résultante, BlaP-cAb-Lyse3, est capable de se lier à HEWL tout en conservant l'activité bêta-lactamase.La HEWL a été immobilisée sur une électrode codée en polyaniline avant la charge de BlaP-cAb-Lys3. Le relâchement de protons lors de l'hydrolyse du benzylpénicilline par la protéine chimérique immobilisée induit des changements de conductivité qui peuvent être interprétés par l'utilisateur. Les capteurs contiennent huit puces organisées en quatre paires.Chaque puce comprend trois électrodes : une électrode de travail revêtue de polyaniline, une électrode de référence et une électrode contre-électrode. Pour chaque paire, la puce étiquetée négative correspond à un témoin négatif, tandis que la puce étiquetée positive correspond à l'échantillon testé. On observe ici des mesures de conductance montrant l'interaction spécifique de BlaP-cAb-Lys3 avec HEWL.Les variations de conductivité résultent de la libération de protons induite par l'hydrolyse de l'antibiotique par la bêta-lactamase chimérique immobilisée. Aucune liaison n'a pu être détectée pour le contrôle négatif, la bêta-lactamase native BlaP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une demi-journée si elle est correctement effectuée et si les conditions expérimentales sont optimisées.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car l'insertion d'un fragment d'anticorps dans BlaP est délicate. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que la qualité des données obtenues dépendra de la fonctionnalité de la bêta-lactamase chimérique. Après cette procédure, d'autres méthodes permettant la quantification de l'interaction détectée peuvent être réalisées afin de déterminer la constante d'association à l'équilibre de cette interaction.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biocapteurs immunitaires pour explorer les interactions moléculaires dans divers échantillons, allant des organismes vivants à différents environnements. Les implications de cette technique s'étendent à la détection de nombreuses biomolécules, puisque la technologie de bêta-lactamase chimérique constitue un outil polyvalent pour fonctionnaliser n'importe quel anticorps ou fragment protéique dans les circuits principaux. Elle pourrait donc être utilisée pour développer des outils diagnostiques peu coûteux et rapides dans de nombreux domaines, tels que la santé humaine et animale.

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Dosage par biocapteur conductimétrique basé sur la β-lactamase pour les interactions protéine-protéine

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