L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

L’objectif global de ce test de biocapteur conductimétrique est de détecter les interactions biomoléculaires, en utilisant la technologie hybride bêta-lactamase. Nous décrivons une méthode pour détecter les interactions anticorps-antigènes, en utilisant une protéine chimérique bêta-lactamase. Le principe de cette méthode repose sur la détection de la liaison en mesurant la libération de protons de l’activité bêta-lactamase.

Le principal avantage de cette technique par rapport à un immunocapteur conventionnel est l’utilisation d’une bêta-lactamase chimérique, permet des tests sensoriels moins coûteux et plus rapides en utilisant une protéine hybride pour détecter les analytes. Commencer cette procédure par la préparation de l’échantillon de protéines et de la solution comme décrit dans le protocole textuel. Préparez l’électrode réutilisable en trempant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution de préparation d’électrode pendant deux minutes en mélangeant doucement à température ambiante.

Répétez cette étape trois fois. Ensuite, rincez les électrodes en trempant les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits d’eau distillée pendant deux minutes en mélangeant doucement à température ambiante. Pour régénérer les électrodes, trempez les pointes dans les puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution de régénération pendant la nuit à quatre degrés Celsius ou une heure à température ambiante.

Ensuite, effectuez trois lavages des électrodes en trempant les pointes dans des puits de plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de solution saline tamponnée au phosphate. Effectuez chaque lavage pendant deux minutes en mélangeant doucement à température ambiante. Enduisez le lysozyme de blanc d’œuf de poule sur la surface polyaniline de l’électrode en déposant une goutte de 15 microlitres de 40 microgrammes par millilitre de HEWL préparée dans un tampon phosphate sur la surface de l’électrode.

Incuber l’électrode une heure à température ambiante. Ensuite, effectuez trois lavages des électrodes avec un tampon de phosphate en trempant les parties des électrodes des puces du capteur dans un puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de tampon de phosphate. Effectuez chaque lavage pendant deux minutes en mélangeant doucement à température ambiante.

Saturez les électrodes en ajoutant une goutte de 30 microlitres de solution de blocage sur la surface de l’électrode. Incuber pendant une heure à température ambiante. Ensuite, lavez trois fois comme précédemment.

Diluez les solutions BlaP-cAb-Lys3 ou BlaP à 20 microgrammes par millilitre dans un tampon de liaison. Ensuite, appliquez une goutte de 15 microlitres de cette solution diluée sur les électrodes. Incuber les électrodes pendant une heure à température ambiante.

Après la réaction du nanocorps d’antigène, lavez les électrodes trois fois avec une solution de lavage. Ensuite, lavez les électrodes du capteur dans le tampon de détection en trempant les électrodes dans un puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres par puits de tampon de détection. Et incubez brièvement pendant une minute.

Pour la détection, connectez le multimètre numérique à l’ordinateur. Ensuite, branchez la puce du capteur sur le multimètre numérique via la partie circuit en cuivre. Amorcez la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 microlitres de solution de benzylpénicilline à quatre millimolaires sur les électrodes marquées positivement.

Appliquez une goutte de 50 microlitres de la solution de détection sur les électrodes marquées négativement pour servir de contrôle négatif. Surveillez les valeurs conductométriques avec le multimètre numérique connecté pendant 30 minutes. Visualisez les données en temps réel directement sur l’écran, ou exportez les données numériques sous forme de fichier texte.

Ces données brutes peuvent être tracées afin de créer une sortie graphique qui représente les mesures des changements de conductivité entre l’électrode de référence et l’électrode de l’échantillon en fonction du temps. Pour construire la protéine chimérique, la bêta-lactamase de classe A BlaP a été utilisée comme protéine porteuse. Ici, les résidus catalytiques sont présentés en rouge.

Le site d’insertion situé dans une boucle exposée au solvant est indiqué en jaune. Le fragment d’anticorps camélidé nommé cAb-Lys3 a été inséré dans BlaP. La protéine chimérique résultante, BlaP-cAb-Lyse3, est capable de se lier à HEWL tandis que l’activité de la bêta-lactamase est conservée.

HEWL a été immobilisé sur une électrode codée en polyaniline avant de charger BlaP-cAb-Lys3. La libération de protons lors de l’hydrolyse de la benzylpénicilline par la protéine chimérique immobilisée induit des changements de conductivité qui peuvent être interprétés par l’utilisateur. Les capteurs contiennent huit puces organisées en quatre paires.

Chaque puce comprend trois électrodes, une électrode de travail recouverte de polyaniline, une électrode de référence et une contre-électrode. Pour chaque paire, la puce étiquetée négative correspond à un contrôle négatif, tandis que la puce étiquetée positive correspond à l’échantillon testé. Les mesures de conductance montrent l’interaction spécifique de BlaP-cAb-Lys3 avec HEWL.

Les changements de conductivité résultent de la libération de protons induite par l’hydrolyse des antibiotiques par la bêta-lactamase chimérique immobilisée. Aucune liaison n’a pu être détectée pour le témoin négatif, la bêta-lactamase native BlaP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 1/2 par jour si elle a bien fonctionné et que les conditions expérimentales sont optimisées.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à le faire, car l’insertion d’un fragment d’anticorps dans le BlaP est difficile. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la qualité des données générées dépendra de la fonctionnalité de la bêta-lactamase chimérique. Suite à cette procédure, d’autres méthodes permettant de quantifier l’interaction détectée peuvent être effectuées afin de déterminer la constante d’association d’équilibre de cette interaction.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des biocapteurs immunitaires pour explorer les interactions moléculaires dans divers échantillons allant des organismes vivants à différents environnements. Les implications de cette technique s’étendent à la détection de nombreuses biomolécules, car la technologie chimérique des bêta-lactamases est un outil polyvalent pour fonctionnaliser n’importe quel anticorps ou fragment de protéine dans le secteur. Par conséquent, il pourrait être utilisé pour développer des outils de diagnostic rapides et bon marché dans de nombreux domaines, tels que la santé humaine et animale.