L'identification d'un épitope linéaire des cellules B monoclonales d'anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

L’objectif global de ce protocole est d’identifier un épitope linéaire de lymphocytes B reconnu par un anticorps monoclonal à l’aide de protéines recombinantes tronquées en série et d’un balayage peptidique par hybridation dot-blot. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l’interaction moléculaire entre l’antigène et l’anticorps. Les principaux avantages de cette technique sont sa simplicité et son efficacité.

L’épitope d’identification peut ensuite être utilisé dans des investigations plus approfondies telles que des applications thérapeutiques et diagnostiques. La démonstration de la procédure sera faite par Chien-Wen Chen, un post-doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez des cellules d’hybridome monoclonal de souris RGM56 dans un milieu hybride exempt de sérum.

Maintenir les cultures cellulaires dans des flacons de 175 T à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone. Après cinq jours d’incubation, prélever le milieu de culture après qu’il ait jauni et centrifuger le surnageant à 4 500 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez les débris cellulaires granulés pour obtenir l’anticorps en solution.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de 50 % de protéines G agro slurry dans une colonne de cinq millilitres et équilibrez la résine avec 10 millilitres de PBS glacé, ce qui équivaut à 10 volumes de résine préchargée. Chargez 200 millilitres de la solution d’anticorps préalablement préparée sur la colonne équilibrée et jetez la fraction qui passe à travers la colonne. À l’aide de 10 millilitres de PBS glacé, lavez la colonne deux fois.

Enfin, pour récupérer l’anticorps de la résine, ajoutez 10 millilitres de solution de glycérine millimolaire à pH 2,7 dans la colonne. Collectez 900 fractions de microlitres dans des tubes de microcentrifugation préalablement remplis de 100 microlitres de tampon de neutralisation 10X. Conservez l’anticorps purifié dans une solution de glycérol à 50 % complétée par de l’azoture de sodium à moins 20 degrés Celsius.

Préparez les constructions et transformez les cellules E.coli BL21 comme décrit dans le protocole texte. Ensuite, transférez une seule colonie dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de bouillon LB complété par 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline et bouchez sans serrer le tube. Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 150 tr/min.

Surveiller la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Lorsqu’il atteint environ 0,6, refroidissez la culture à 25 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez IPTG à une concentration finale de 0,4 millimolaire pour induire l’expression de la protéine recombinante.

Incuber la culture pendant quatre heures supplémentaires à 25 degrés Celsius en secouant à 200 tr/min. Après l’incubation, transférez un millilitre de la culture bactérienne dans un tube de microcentrifugation. Centrifugez les cellules à 12 000 fois G pendant une minute et jetez le surnageant.

En pipetant de haut en bas avec une micropipette, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres de tampon de dénaturation. Et mélangez la suspension résultante par vortex vigoureux pour obtenir un échantillon de protéine recombinante prêt à l’emploi. Pour procéder à l’hybridation dot-blot, dissoudre chaque peptide synthétique dans du DMSO pour obtenir des solutions de 10 milligrammes par millilitre.

Ensuite, activez la membrane PVDF dans du méthanol pendant deux minutes et équilibrez-la avec un tampon Towbin modifié pendant deux minutes supplémentaires. Rincez un morceau de papier de chromatographie avec un tampon Towbin modifié et posez la membrane PVDF équilibrée dessus. Laissez la membrane reposer jusqu’à ce que le tampon disparaisse de sa surface.

À l’aide d’une pointe de 10 microlitres, ajoutez deux microlitres de chaque échantillon de peptide ou de protéine recombinante sur la membrane et laissez-le sécher à l’air libre pendant 10 minutes. La détection d’un symbole sur la membrane est l’étape la plus critique de ce protocole. Le chargement d’une quantité précise d’un échantillon sur une petite surface de la membrane PVDF nécessite une attention particulière.

Ensuite, bloquez la membrane dans un tampon TBST complété par 5 % de lait écrémé pendant 30 minutes à température ambiante en secouant doucement. Diluer l’anticorps monoclonal RGM56 dans un tampon TBST complété par 5 % de lait écrémé. Et ajoutez la solution d’anticorps à la membrane.

Incuber la membrane à 37 degrés Celsius pendant une heure en secouant doucement. Après l’incubation, retirez la solution d’anticorps. Et lavez la membrane deux fois dans un tampon TBST pendant cinq minutes en secouant doucement.

Ensuite, ajoutez à la membrane la solution de l’anticorps secondaire diluée dans un tampon TBST avec 5 % de lait écrémé. Incuber la membrane pendant une heure à 37 degrés Celsius en secouant doucement. Lors de l’incubation, jetez la solution d’anticorps et lavez la membrane dans le tampon TBST deux fois pendant cinq minutes en secouant doucement.

Ensuite, développez la membrane avec la solution de substrat à température ambiante pendant 15 minutes dans l’obscurité. Lorsque le signal apparaît, arrêtez la réaction en lavant la membrane avec de l’eau doublement distillée. Après avoir séché la membrane à l’air, capturez l’image à l’aide d’un système d’imagerie.

Enfin, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, mesurez l’intensité de chaque tache. Voici la protéine de code du virus de la nécrose nerveuse complète, composée des acides aminés un à 338, ainsi que ses variantes tronquées en série. Pour confirmer l’expression des protéines dans les cellules bactériennes transformées, une analyse dot-blot à l’aide d’anticorps anti-6XHis a été réalisée montrant la présence de toutes les protéines étudiées.

Ensuite, les protéines recombinantes ont été analysées par hybridation dot-blot dans laquelle l’anticorps monoclonal RG-M56 a été utilisé. L’analyse a révélé que l’épitope protéique reconnu par l’anticorps se trouve dans les peptides 195 à 338. Enfin, un épitope composé de 20 ou huit résidus d’acides aminés a été identifié par balayage peptidique.

La scintigraphie à l’alanine a montré que les substitutions de résidus de valine aux positions 197 et 199 ainsi que d’une cystine à 201 abolissaient la capacité de liaison de l’épitope et l’hybridation par transfert de points. De même, la diminution de l’affinité de liaison a été observée dans l’analyse de l’intensité de liaison, confirmant que les résidus identifiés sont essentiels pour la liaison de l’épitope à l’anticorps monoclonal RGM56. Cette technique d’identification des peptides peut être utilisée pour développer des médicaments peptidiques thérapeutiques ou des médicaments peptidiques.