L'identification d'un épitope linéaire des cellules B monoclonales d'anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

L'objectif général de ce protocole est d'identifier un épitope linéaire de cellule B reconnu par un anticorps monoclonal à l'aide de protéines recombinantes tronquées de manière progressive et d'une analyse par balayage peptidique via hybridation en tache. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant l'interaction moléculaire entre l'antigène et l'anticorps. Les principaux avantages de cette technique résident dans sa simplicité et son efficacité.

L'épitope identifié peut ensuite être utilisé dans des études plus approfondies, comme dans des applications thérapeutiques et diagnostiques. La procédure sera démontrée par Chien-Wen Chen, post-doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, cultivez les cellules hybrides myélomateuses monoclonales RGM56 de souris dans un milieu sans sérum hybride.

Entretenir les cultures cellulaires dans des flacons de 175 T à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après cinq jours d'incubation, recueillir le milieu de culture une fois qu'il a viré au jaune et centrifuger le surnageant à 4 500 × g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminer le culot de débris cellulaires pour obtenir l'anticorps en solution.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de suspension d'agarose à la protéine G à 50 % dans une colonne de cinq millilitres et équilibrez la résine avec 10 millilitres de PBS glacé, correspondant à 10 volumes de la résine préchargée. Chargez 200 millilitres de la solution d'anticorps préparée précédemment sur la colonne équilibrée et jetez la fraction qui traverse la colonne. Lavez la colonne deux fois en utilisant 10 millilitres de PBS glacé.

Enfin, pour éluer l'anticorps de la résine, ajouter 10 millilitres de solution de glycérine millimolaire à pH 2,7 sur la colonne. Recueillir des fractions de 900 microlitres dans des tubes de microcentrifugeuse préalablement remplis avec 100 microlitres de tampon de neutralisation 10X. Conserver l'anticorps purifié dans une solution de glycérol à 50 % supplémentée en azoture de sodium à moins 20 degrés Celsius.

Préparez les constructions et transformez les cellules E.coli BL21 comme décrit dans le protocole écrit. Ensuite, transférez une colonie unique dans un tube de 15 millilitres contenant trois millilitres de bouillon LB supplémenté avec 100 microgrammes par millilitre d'ampicilline, et fermez le tube légèrement. Incubez la culture à 37 degrés Celsius avec agitation à 150 tr/min.

Surveillez la densité optique de la culture à 600 nanomètres. Lorsqu'elle atteint environ 0,6, refroidissez la culture à 25 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez de l'IPTG à une concentration finale de 0,4 millimolaire pour induire l'expression de la protéine recombinante.

Incuber la culture pendant quatre heures supplémentaires à 25 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min. Après l'incubation, transférer un millilitre de la culture bactérienne dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger les cellules à 12 000 ×g pendant une minute et éliminer le surnageant.

À l’aide d’une micropipette, aspirez et expulsez plusieurs fois afin de resuspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres de tampon de dénaturation. Mélangez ensuite la suspension obtenue par vortexage énergique pour obtenir un échantillon prêt à l’emploi de protéine recombinante. Pour réaliser l’hybridation en tache (dot-blot), dissolvez chaque peptide synthétique dans du DMSO afin d’obtenir des solutions de 10 milligrammes par millilitre.

Ensuite, activer la membrane en PVDF dans le méthanol pendant deux minutes et l'équilibrer avec du tampon Towbin modifié pendant deux autres minutes. Rincer un morceau de papier chromatographique avec le tampon Towbin modifié et poser la membrane en PVDF équilibrée dessus. Laisser la membrane reposer jusqu'à ce que le tampon disparaisse de sa surface.

À l’aide d’une pipette de 10 microlitres, ajoutez deux microlitres de chaque échantillon de peptide ou de protéine recombinante sur la membrane et laissez sécher à l’air pendant 10 minutes. Le dépôt d’un symbole sur la membrane constitue l’étape la plus critique de ce protocole. Le chargement d’une quantité précise d’échantillon sur une petite zone de la membrane en PVDF nécessite une attention particulière.

Ensuite, bloquer la membrane dans du tampon TBST enrichi avec 5 % de lait écrémé pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation douce. Diluer l'anticorps monoclonal RGM56 dans du tampon TBST enrichi avec 5 % de lait écrémé. Puis ajouter la solution d'anticorps à la membrane.

Incubez la membrane à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation douce. Après l'incubation, retirez la solution d'anticorps et lavez la membrane deux fois dans du tampon TBST pendant cinq minutes sous agitation douce.

Ensuite, ajoutez à la membrane la solution d'anticorps secondaire diluée dans du tampon TBST contenant 5 % de lait écrémé. Incubez la membrane pendant une heure à 37 degrés Celsius avec agitation douce. Après l'incubation, éliminez la solution d'anticorps et lavez la membrane deux fois dans du tampon TBST pendant cinq minutes avec agitation douce.

Ensuite, faire réagir la membrane avec la solution de substrat pendant 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Dès l'apparition du signal, arrêter la réaction en lavant la membrane avec de l'eau doublement distillée. Après séchage à l'air de la membrane, acquérir l'image du dot-blot à l'aide d'un système d'imagerie.

Enfin, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, mesurez l’intensité de chaque point du dot-blot. Est présenté ici le protéine complète du virus de la nécrose nerveuse, comprenant les acides aminés un à 338, ainsi que ses variantes tronquées en série. Afin de confirmer l’expression des protéines dans les cellules bactériennes transformées, une analyse par dot-blot à l’aide d’un anticorps anti-6XHis a été réalisée, montrant la présence de toutes les protéines étudiées.

Ensuite, les protéines recombinantes ont été analysées par hybridation dot-blot utilisant l'anticorps monoclonal RG-M56. L'analyse a révélé que l'épitope protéique reconnu par l'anticorps se situe dans le peptide 195 à 338. Enfin, un épitope composé de 20 ou huit résidus d'acides aminés a été identifié par balayage peptidique.

L'analyse par balayage alanine a montré que les substitutions des résidus de valine aux positions 197 et 199, ainsi que d'une cystine en position 201, abolissaient la capacité de liaison de l'épitope et l'hybridation en tache. De même, une affinité de liaison réduite a été observée lors de l'analyse de l'intensité de liaison, confirmant que les résidus identifiés sont essentiels pour la liaison de l'épitope à l'anticorps monoclonal RGM56. Cette technique d'identification de peptides peut être utilisée pour développer des médicaments thérapeutiques peptidiques ou des médicaments à base de peptides.