Name: En utilisant biocapteurs à base denzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins dAlzheimer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Découvrez la mesure du glutamate tonique et phasique dans l'hippocampe de souris transgéniques modèles d'Alzheimer à l'aide de microélectrodes enzymatiques. Cette méthode permet un suivi précis et peu invasif des dynamiques neurotransmettrices in vivo.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des sciences médicales générales (MRN, U54GM104942), NIA (MRN, R15AG045812), l&#39;Association Alzheimer (MRN, NIRG-12-242187), WVU Faculté Sénat Subvention de recherche (MRN), et WVU PSCOR Grant (MRN).

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GG est le propriétaire unique de Quanteon, LLC qui rend le système d&#39;enregistrement FAST-16 utilisé pour les mesures de glutamate dans cette étude. JEQ est un consultant rémunéré pour Quanteon.

La technique de MEA permet de mesurer la cinétique rapide de la libération et l&#39; absorption neurotransmetteur in vitro et in vivo. Par conséquent, la technologie produit une grande variété de la production de données, y compris les niveaux de neurotransmetteurs tonique, la libération des neurotransmetteurs évoqué, et la clairance des neurotransmetteurs. Cependant, parce que l&#39;utilisation des AME est une procédure relativement complexe, il existe de nombreux facteurs qui peuvent avoir besoin d&#...

La mesure des modifications de neurotransmetteurs dans le cerveau est un outil essentiel pour l&#39;étude des maladies neuroscientifiques du système nerveux central (SNC) qui sont souvent caractérisées par la dérégulation des neurotransmetteurs. Bien que microdialyse en combinaison avec une Chromatographie liquide haute pression (HPLC / CE) est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires 1, 2, 3, 4, la résolution spatiale et temporelle des sondes de microdialyse peuvent ne pas être idéal pour les neurotransmetteurs , tel que le glutamate, qui sont étroitement régulée dans l&#39;espace extracellulaire 5, 6. En raison des progrès récents de la génétique et de l&#39; imagerie, il existe d&#39; autres méthodes qui peuvent être utilisées pour cartographier le glutamate in vivo. Utilisation reporters fluorescents glutamate génétiquement codés (iGluSnFR) und &#39; imagerie à deux photons, les chercheurs sont capables de visualiser la libération de glutamate par les neurones et les astrocytes in vitro et in vivo 7, 8, 9. En particulier, cela permet d&#39;enregistrer à partir d&#39;un champ de vision plus large et ne perturbe pas les connexions intrinsèques du cerveau. Bien que ces nouvelles techniques optiques permettent la visualisation de la cinétique du glutamate et mesure des réponses sensorielles et de l&#39;activité neuronale évoqués, ils ne sont pas capables de quantifier la quantité de glutamate dans l&#39;espace extracellulaire dans les régions discrètes du cerveau. Une autre méthode est la matrice de microélectrodes (MEA) lié à une enzyme qui permet de mesurer de manière sélective les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire, tels que le glutamate, par l&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;enregistrement auto-référencée. La technique de MEA a été utilisée pour étudier les modifications dans le glutamate extracellulaire après cérébrales traumatiquesblessure 10, 11, 12, vieillissement de 13, 14, le stress 15, 16, l&#39; épilepsie 17, 18, la maladie d&#39;Alzheimer 19, 20, et l&#39; injection d&#39;un synoptique viral 21 et représente une amélioration par rapport aux limites spatiales et temporelles inhérentes à la microdialyse. Alors que microdialyse limite la capacité à mesurer près de la synapse 22, 23, AME ont une haute résolution spatiale qui permet des mesures sélectives de glutamate extracellulaire empiétement synapses près de 24, 25. En second lieu, la faible résolution temporelle de microdialyse (1 - 20 min) limite la possibilité d&#39;étudier ladynamique rapide de la libération et la clairance du glutamate qui se produisent dans la milliseconde à la deuxième plage 26. En raison des différences dans la libération ou la clairance du glutamate peuvent ne pas être évident dans les mesures de tonique, de repos taux de glutamate, il peut être essentiel que mesurer directement la libération et la clairance du glutamate. AME permettent de telles mesures en raison de leur haute résolution temporelle (2 Hz) et faibles limites de détection (&lt;1 um). En troisième lieu, les AEM permettent l&#39;examen des variations sous-régionales dans les neurotransmetteurs dans une région particulière du cerveau, telles que l&#39;hippocampe de rat ou de la souris. Par exemple, en utilisant AME on peut cibler séparément le gyrus denté (DG), corne d&#39; Ammon 3 (CA3) et corne d&#39; Ammon 1 (CA1) de l&#39;hippocampe, qui sont reliés par l&#39; intermédiaire d&#39; un circuit trisynaptic 27, pour examiner les différences sous - régionaux de glutamate extracellulaire. En raison de la taille des sondes de microdialyse (1 - longueur de 4 mm) et les dommages causés par l&#39; implantation 28 &lt;/ sup&gt;, 29, les différences sous - régionales sont difficiles à traiter. En outre, les systèmes optiques ne permettent la stimulation par des stimuli externes, comme une stimulation ou quartiles le scintillement de lumière, ce qui ne permet pas la stimulation sous - régionale 7. Un dernier avantage des AME par rapport aux autres méthodes est la possibilité d&#39;étudier ces sous - régions in vivo sans perturber leurs relations extrinsèques et intrinsèques. Ici, nous décrivons comment un système d&#39;enregistrement (par exemple, FAST16mkIII) en combinaison avec les AEM, consistant en une microélectrode multisite à base de céramique, peut être revêtue de façon différentielle sur les sites d&#39;enregistrement pour permettre à des agents interférant être détectés et supprimés à partir du signal d&#39;analyte. Nous démontrons également ces tableaux peuvent être utilisés pour des études à base ampérométrie-de régulation du glutamate in vivo au sein de la DG, CA3 et sous - régions hippocampiques CA1 de ELO anesthésié (TauP301L) 4510 souris, un couramment utilisé mmodèle Ouse de la maladie d&#39;Alzheimer. De plus, nous confirmons que la sensibilité du système de MEA à la dynamique rapide de la libération du glutamate et la clairance en traitant les souris avec riluzole, un médicament montré in vitro pour diminuer la libération du glutamate et d&#39; augmenter l&#39; absorption du glutamate 30, 31, 32, 33, et de démontrer ces changements respectifs in vivo dans le modèle de souris TauP301L.

<table><tbody><tr><td>FAST-16mkIII-8 canaux</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td>Réseaux de microélectrodes</td><td>CenMet</td><td>W4 ou 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (expire après 1 mois)</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (expire après 6 mois)</td></tr><tr><td>Glutamate oxydase</td><td>US Biological ou Sigma Aldrich</td><td>G4001-01 ou 100646</td><td>50 UI (expire après 6 mois)</td></tr><tr><td>Seringues Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 seringues</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>de dichlorhydrate de m-phénylènediamine (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Électrodes de référence (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 électrodes</td></tr><tr><td>Alimenté par batterie Magnétique plaque à agitation</td><td>Cole-parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de dopamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Acide perchlorique</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Chlorure de postassium</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Pipettes à éjection sous pression en verre</td><td>CenMet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cire collante</td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Microseringue</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Pâte à modeler</td><td>WalMart</td><td></td><td>Peut acheter auprès de différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>AM systems</td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Platinum wire</td><td>AM Systems</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet à souder</td><td>Lowes ou Home Depot</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Multimètre</td><td>WalMart</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un fournisseur différent</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un fournisseur différent</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un fournisseur</td></tr><tr><td>différent Dispositif</td> <td>stéréotaxiqueStoelting</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Meiji EMZ microscope</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Ciseaux de chirurgie</td><td>VWR</td><td></td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Cotons-tiges stériles</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>Peut acheter auprès d’un autre fournisseur</td></tr><tr><td>Pommade pour les yeux</td><td>Puralube Vet Pommade</td><td></td><td>Obtenir auprès du vétérinaire</td></tr><tr><td>Écouvillons d’iode</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>Peut acheter auprès de différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Tampons d’alcool Pharmacie</td><td>locale</td><td></td><td>Peut acheter auprès de différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Champ de chirurgie stérile</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>Peut acheter auprès de différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Saline stérile</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>Peut faire sa propre solution à l’aide</td></tr><tr><td>de filtres Peroxyde d’hydrogène (3 %)</td> <td>Pharmacie</td><td></td> locale <td>Peut acheter auprès de différents fournisseurs</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>WalMart</td><td></td><td>Peut acheter auprès de différents fournisseur</td></tr></tbody></table>

en utilisant biocapteurs à base d&#39;enzymes pour mesurer tonic et phasic glutamate dans les modèles murins d&#39;alzheimer

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

perturbation neurotransmetteur est souvent un élément clé des maladies du système nerveux central (SNC), jouant un rôle dans la pathologie sous-jacente de la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression et l&#39;anxiété. Traditionnellement, microdialyse a été le plus commun (louangé) technique pour examiner les changements de neurotransmetteurs qui se produisent dans ces troubles. Mais parce que microdialyse a la capacité de mesurer les changements lents 1-20 minute dans de vastes zones de tissu, il présente l&#39;inconvénient d&#39;invasivité, risque de détruire les connexions intrinsèques dans le cerveau et une capacité d&#39;échantillonnage lente. Une technique relativement récente, la matrice de microélectrodes (MEA), présente de nombreux avantages pour la mesure des changements de neurotransmetteurs spécifiques au sein des régions discrètes du cerveau comme ils se produisent, ce qui rend une approche spatiale et temporelle précise. En outre, en utilisant les AME est peu invasive, permettant la mesure des modifications de neurotransmetteurs in vivo. Dans notre laboratoire, nous have été particulièrement intéressés par des changements dans le neurotransmetteur, le glutamate, lié à la pathologie de la maladie d&#39;Alzheimer. En tant que tel, la méthode décrite ici a été utilisé pour évaluer les perturbations potentielles hippocampiques en glutamate dans un modèle de souris transgénique de la maladie d&#39;Alzheimer. En bref, le procédé utilisé consiste à enduire une microélectrode multi-site avec une enzyme très sélective pour le neurotransmetteur d&#39;intérêt et l&#39;utilisation de sites d&#39;auto-référencement pour soustraire le bruit de fond et les interférents. Après étalement et d&#39;étalonnage, on peut construire la MEA avec une micropipette et abaissé dans la région du cerveau d&#39;intérêt à l&#39;aide d&#39;un appareil stéréotaxique. Ici, le procédé décrit consiste à anesthésier RTG (TauP301L) 4510 souris et en utilisant un appareil stéréotaxique afin de cibler avec précision les sous-régions (DG, CA1 et CA3) de l&#39;hippocampe.

Bien que cette technologie peut être utilisée pour mesurer des modifications dans glutamatergique de signalisation dans de nombreux types de modèles animaux, tels que des lésions cérébrales traumatiques, le vieillissement, le stress et l&#39;épilepsie, ici nous montrons comment la technologie MEA peut être utilisé pour examiner les modifications glutamatergiques dans le modèle de souris transgénique de tauopathie humain 19, 20. L...

Ici, nous décrivons la configuration, la navigation logicielle, et l&#39; analyse de données pour une méthode spatiale et temporelle précise de la mesure tonique et les changements de glutamate extracellulaire phasiques in vivo en utilisant des réseaux de microélectrodes enzyme-linked (MEA).

En utilisant biocapteurs à base d&#39;enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d&#39;Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer in vivo les variations toniques et phasiques du glutamate extracellulaire à l'aide de microélectrodes associées à des enzymes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que savoir si les concentrations extracellulaires de neurotransmetteurs ainsi que la dynamique rapide de leur libération et de leur élimination sont modifiées dans les états pathologiques. Le principal avantage de cette technique réside dans la capacité des microélectrodes à mesurer des variations spécifiques de neurotransmetteurs au sein de régions cérébrales distinctes, ce qui en fait une approche précise à la fois spatialement et temporellement, tout en étant peu invasive.La procédure sera démontrée par Holly Hunsberger et Ryan Heslin de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, recouvrez une paire de sites d'enregistrement sur une MEA avec l'enzyme souhaitée et une autre paire de sites d'enregistrement avec la matrice protéique inactive. Ensuite, aspirez l'oxydase du glutamate ou la matrice protéique à l'aide d'une seringue Hamilton de 10 microlitres.Appuyez doucement sur le piston pour déposer un

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Une des caractéristiques pathologiques de la MA est la formation de plaques amyloïdes β protéines neuritique positif. Dans ce protocole, nous décrivons deux méthodes pour détecter les plaques séniles dans le modèle de souris transgéniques AD: détection immunohistochimique utilisant la méthode ABC et DAB et détection par fluorescence en utilisant la méthode de coloration thioflavine S.

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Dans cette vidéo, un réseau de multiélectrodes (MEA) recouvert de glutamate oxydase est implanté dans le tissu cérébral d’une souris anesthésiée. La solution de glutamate est injectée dans l’espace extracellulaire où le MEA détecte les niveaux de glutamate, ce qui permet de surveiller en temps réel l’absorption du glutamate par les astrocytes.

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On décrit ici une approche de dépistage comportementale qui peut être utilisée pour cribler des composés qui présentent une efficacité in vivo sur les comportements moteurs cognitifs et fonctionnels dans les modèles de souris transgéniques de la β-amyloïdose et de la tauopathie. Ces méthodes sont optimisées pour filtrer les composés pour l'activité dans des tâches de mémoire à court terme et de travail.

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Ce livre présente en détail l’utilisation d’enregistrements ampérométrie potentiel fixe à l’aide d’électrodes de fibre de carbone et de la technologie de biocapteurs enzymatiques pour mesurer la libération de dopamine et du glutamate avec haute résolution temporelle lors de comportement gratifiant naturel dans le hamster femelle.

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Cette étude explore la nouvelle utilisation de la technologie de baies (MEA) de microélectrodes à base d’enzymes pour surveiller l’activité du neurotransmetteur in vivo chez les porcelets. L’hypothèse était que ce dérèglement du glutamate contribue au mécanisme de neurotoxicité anesthésique. Nous présentons ici un protocole visant à adapter la technologie de la MEA pour étudier le mécanisme de la neurotoxicité induite par l’anesthésie.

Adaptation de la microélectrode Array technologie pour l’étude de la neurotoxicité induite par l’anesthésie dans le cerveau Intact Porcinet

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Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer in vitro Ca2 + flux dans les neurones midbrain et leurs effets en aval sur caspase-3 en utilisant les cultures primaires de la souris midbrain. Ce modèle peut être employé pour étudier les changements pathophysiologiques liés à l’activité anormale de Ca2+ dans les neurones midbrain, et pour dépister de nouvelles thérapies pour des propriétés anti-apoptotiques.

Quantification spontanée Ca2+ Fluxes et leurs effets en aval dans les neurones midbrains de souris primaires

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Nous avons créé des souris modèles de la leucomalacie périventriculaire (PVL), la lésion cérébrale prédominante chez les prématurés caractérisée par des lésions de la substance blanche périventriculaire. L'hypoxie / ischémie avec / sans infection systémique sont les principales causes de PVL. Unilatérale ligature carotidienne et l'exposition hypoxie avec / sans injection de lipopolysaccharide crée PVL lésions semblables chez les souris P6.

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Découvrez la mesure du glutamate tonique et phasique dans l'hippocampe de souris transgéniques modèles d'Alzheimer à l'aide de microélectrodes enzymatiques. Cette méthode permet un suivi précis et peu invasif des dynamiques neurotransmettrices in vivo.

En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer

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