En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer

L’objectif global de cette procédure est de mesurer les changements toniques et phasiques du glutamate extracellulaire in vivo à l’aide de réseaux de microélectrodes liés à des enzymes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la question de savoir si les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires et la dynamique rapide de la libération et de l’élimination des neurotransmetteurs sont modifiés dans les états pathologiques. Le principal avantage de cette technique est que les réseaux de microélectrodes peuvent mesurer des changements spécifiques de neurotransmetteurs dans des régions cérébrales discrètes, ce qui en fait une approche précise dans l’espace et dans le temps tout en étant peu invasive.

Holly Hunsberger et Ryan Heslin de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, enduisez une paire de sites d’enregistrement sur un MEA avec l’enzyme souhaitée et une autre paire de sites d’enregistrement avec la matrice protéique inactive. Ensuite, prélevez la matrice de glutamate oxydase ou de protéine à l’aide d’une seringue Hamilton de 10 microlitres.

Appuyez doucement sur le piston pour distribuer un petit cordon de solution à l’extrémité de la seringue. Pour cibler les sites d’enregistrement MEA, à l’aide d’un microscope à dissection, appliquez la solution sur les sites d’enregistrement appropriés en contactant brièvement les sites d’enregistrement avec la gouttelette de solution, qui représente une couche. Réglez une minuterie sur une minute entre les applications de revêtement sur les sites d’enregistrement.

Maintenant, placez l’électrode de référence à travers l’ouverture du bras en plastique. Abaissez l’électrode de référence dans un bécher contenant du PBS et assurez-vous qu’elle n’entre pas en contact avec le bas du bécher. Ensuite, connectez l’électrode de référence à l’étage de tête et connectez le MEA au mPD plaqué à l’étage de tête.

Abaissez le MEA dans le bécher de solution de sorte que seule la pointe du MEA soit immergée dans la solution. Ne plongez pas l’embout MEA dans un liquide au-delà de la bulle noire. Cela pourrait endommager l’AEM.

Ensuite, sélectionnez l’icône de galvanoplastie sur le bureau. Dans le menu de l’outil de galvanoplastie, vérifiez que les paramètres corrects sont saisis. Ensuite, sélectionnez quitter le logiciel pour terminer la galvanoplastie.

Rincez les pointes d’électrode plaquées mPD avec de l’eau DI et conservez-les pendant 24 heures avant de les calibrer. Dans cette procédure, allumez un coussin chauffant à 37 degrés Celsius et connectez l’étage de tête au système de contrôle de l’enregistrement. Ensuite, insérez l’embout MEA dans 40 millilitres de PBS 0,5 molaire agité.

Ensuite, connectez l’électrode de référence à l’étage de tête. Agissez l’embout de l’électrode de référence pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air. Après cela, ouvrez le programme d’enregistrement, assurez-vous que les paramètres sont corrects, choisissez le numéro MEA, cliquez sur Étalonnage et appuyez sur Démarrer.

Prévoyez cinq à 10 minutes pour l’équilibrage et commencez l’étalonnage une fois que la ligne de base s’est stabilisée. Ensuite, sélectionnez Ligne de base et ajoutez 500 microlitres d’acide ascorbique. Ensuite, sélectionnez Interférent une fois que le courant a atteint un nouveau plateau stable.

Si le MEA est correctement galvanisé, aucun changement ne doit être observé. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de 20 millimolaires de L-glutamate. Une fois que le courant a atteint un nouveau plateau stable, marquez le premier ajout comme analyte.

Répétez trois fois pour un total de trois ajouts de glutamate. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de dopamine. Sélectionnez Substance d’essai.

Par la suite, ajoutez 40 microlitres de peroxyde. Sélectionnez Substance d’essai et cliquez sur le bouton d’arrêt une fois l’étalonnage terminé. Dans cette étape, placez la micropipette au centre des quatre sites d’enregistrement de platine et montez-la de 50 à 100 micromètres au-dessus de la MEA à l’aide de cire collante et de pâte à modeler.

À l’aide d’un adaptateur CC, fixez le fil positif rouge au fil d’argent préparé du côté de la broche dorée et fixez le fil négatif noir à la cathode du bain de platine. Ensuite, branchez l’adaptateur CC et recherchez le bon processus de placage. Des bulles doivent apparaître au niveau de l’électrode du bain et l’électrode de référence doit prendre une couleur gris argenté.

Dans cette procédure, placez l’animal dans l’appareil stéréotaxique et utilisez les barres d’oreille pour stabiliser sa tête. Assurez-vous que l’animal est attaché et que la tête ne bouge pas. Ensuite, appliquez la pommade oculaire à l’aide d’un applicateur en coton stérile.

Après cela, rasez la tête avec une tondeuse. Et retirez la fourrure près des oreilles à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux. Ensuite, appliquez de l’iode puis de l’alcool sur le cuir chevelu trois fois en alternance.

Ensuite, faites une incision au milieu du cuir chevelu et étalez la peau. Absorbez le sang à l’aide d’un coton-tige stérile et appliquez du peroxyde d’hydrogène pour faciliter l’apparition du bregma et du lambda. Assurez-vous que la tête est correctement positionnée en mesurant le dorsal-ventral et le médial-latéral du bregma et du lambda.

Réglez les coordonnées à bregma sur zéro et marquez les coordonnées cibles. Ensuite, percez autour de la marque. Ensuite, fixez le MEA à la scène de tête.

Remplissez la pipette avec la première solution souhaitée. Assurez-vous de laisser un espace dans la pipette sans solution afin que la solution expulsée puisse être examinée. Ensuite, fixez le tube à la micropipette en verre.

Trouvez bregma avec le MEA attaché et réglez les coordonnées à zéro. Déplacez le MEA aux coordonnées souhaitées et abaissez-le lentement jusqu’à ce que la pointe touche le cerveau. Ensuite, mettez à zéro la coordonnée dorsale-ventrale, puis abaissez lentement le MEA dans le cerveau.

Placez l’électrode de référence dans un endroit éloigné de l’AEM de sorte qu’elle soit toujours en contact liquide avec le cerveau pour compléter le circuit. Sur le programme d’enregistrement, cliquez sur l’électrode calibrée souhaitée, puis cliquez sur effectuer l’expérience pour démarrer l’enregistrement. Après avoir obtenu une ligne de base stable, réglez l’éjecteur de pression sur 0,6 seconde et 0,5 psi et appuyez sur le bouton rouge de l’éjecteur de pression pour éjecter.

Notez le temps et la pression ainsi que les tics de volume déplacés sur la feuille d’injection et prenez des notes si nécessaire. Après cela, retirez le MEA avec la micropipette attachée, rincez-le à l’eau DI et faites-le tremper dans du PBS pendant la nuit jusqu’à ce que tout le sang ait disparu. Dans les régions CA3 et CA1 de l’hippocampe, les niveaux de glutamate tonique ont été significativement augmentés chez les souris TauP301L traitées par véhicule, un effet atténué par le traitement au riluzole.

Ici, les enregistrements représentatifs de référence de la libération de glutamate évoquée par le chlorure de potassium dans le CA3 ont montré que le traitement au riluzole atténuait l’augmentation significative de l’amplitude de libération de glutamate observée chez les souris Vehicle-TauP301L. L’application locale de chlorure de potassium a produit une augmentation robuste du glutamate extracellulaire qui est rapidement revenue à des niveaux toniques. L’augmentation significative de la libération de glutamate de chlorure de potassium a provoqué une libération de glutamate chez les souris DG, CA3 et CA1 observées chez les souris TauP301L traitées avec un véhicule après que l’application locale de chlorure de potassium ait été atténuée par le traitement au riluzole.

Cette section de l’hippocampe colorée en violet crésyl confirme l’emplacement des traces MEA dans CA3 et CA1. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler les étapes de dépannage répertoriées dans le manuscrit. Par exemple, pour réduire les signaux bruyants, n’oubliez pas de mettre le système à la terre et de suivre les étapes en temps opportun.