Fabrication de Mousses et microsupports dérivés Matrice extracellulaires culture cellulaire spécifique de tissu et plates-formes de livraison

L'objectif général de ce protocole est d'aider à la caractérisation dimensionnelle de mousses ou de micro-supports non réticulés chimiquement, dérivés de la matrice extracellulaire spécifique à un tissu, destinés à des applications dans des modèles de culture cellulaire in vitro en 3D ou comme supports pro-régénératifs dans des systèmes de délivrance cellulaire. Cette méthode peut contribuer à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie cellulaire appliquée et du génie tissulaire, telles que la manière dont le microenvironnement cellulaire en 3D module la fonction cellulaire et la régénération tissulaire. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à fabriquer des supports dont les géométries sont ajustables, qui imitent la composition native de la MEC spécifique au tissu et qui restent stables en culture prolongée sans réticulation supplémentaire.

Après avoir lyophilisé la MEC d'origine tissulaire conformément au protocole décrit, utilisez des ciseaux chirurgicaux pointus pour hacher finement le tissu décellularisé. Pour broyer par cryobroyage le tissu traité, remplissez une chambre de broyage en acier inoxydable de 25 millilitres destinée à un système de broyeur à billes de laboratoire avec la MEC lyophilisée hachée, puis ajoutez deux billes de broyage en acier inoxydable de 10 millilitres. Fermez la chambre de broyage chargée et immergez-la complètement dans de l'azote liquide pendant trois minutes.

Ensuite, broyer l'échantillon congelé à 30 hertz pendant trois minutes. Répéter l'immersion dans l'azote liquide et le broyage jusqu'à ce que la MEC soit réduite en une poudre fine. Peser 250 milligrammes de MEC hachée ou broyée cryogéniquement et transférer dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Ajoutez cinq millilitres de tampon NaH2PO4 22 M dans un tube d'essai pour centrifugeuse et marquez le niveau du liquide sur le tube. Préparez ensuite une solution mère d'alpha-amylase en ajoutant 7,5 milligrammes d'alpha-amylase à un millilitre de tampon NaH2PO4 22 M. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution mère d'alpha-amylase à l'échantillon.

Ensuite, ajouter du NaH2PO4 à 22 M pour obtenir un volume final de 10 millilitres. Agiter la suspension en continu à 300 tr/min et à température ambiante pendant 72 heures. Centrifuger la suspension à 1500 × g pendant 10 minutes.

Recueillez soigneusement et jetez le surnageant sans perturber le culot de MEC digéré. Ensuite, utilisez 10 millilitres de NaCl à cinq pour cent dilué dans de l’eau doublement distillée pour resuspendre le matériel en culot et agitez en continu pendant 10 minutes à 300 tr/min. Répétez ce lavage deux fois supplémentaires avant d’utiliser 10 millilitres d’eau doublement distillée pour resuspendre le culot.

Agiter ensuite la suspension en continu à 300 tr/min pendant 10 minutes à température ambiante. Après une nouvelle centrifugation de l'échantillon, recueillir soigneusement le surnageant et le jeter sans perturber le culot de MEC digérée. Ajouter de l'acide acétique molaire jusqu'au trait de 5 millilitres.

Et vortexer. Ensuite, agiter continuellement la suspension à 120 tr/min et à 37 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, à l’aide d’un homogénéisateur portable muni d’une sonde à dents de scie de 10 millimètres de large, homogénéiser la suspension de MEC à température ambiante par intervalles de 10 secondes jusqu’à ce qu’il ne reste aucun fragment visible.

Placer la suspension dans un bécher d'eau froide entre les intervalles d'homogénéisation afin d'éviter la surchauffe. Incuber la suspension de MEC à 37 degrés Celsius avec agitation continue à 120 tr/min jusqu'à ce que la suspension soit tiède. Ensuite, utiliser de l'acide acétique 2 M pour diluer la suspension échantillon à la concentration souhaitée.

Avec une seringue de trois millilitres et une aiguille de calibre 18, remplir le moule souhaité avec la suspension de MEC. Les mousses peuvent être fabriquées selon diverses géométries, selon la forme du moule. Couvrir les moules et les congeler à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, placer les moules dans un flacon de lyophilisateur. Relier le flacon au système de lyophilisation de laboratoire et sécher les moules pendant 24 heures ou jusqu'à complète dessiccation. Incuber la suspension d'ECM cryobroyée sous agitation continue à 100 tr/min toute la nuit.

Introduisez trois millilitres de suspension de MCE dans une seringue de trois millilitres munie d’un embout Luer lock et fixez un ensemble d’infusion à ailettes sur l’orifice de la seringue. Fixez solidement la seringue dans la pompe à seringue. Ensuite, fixez l’aiguille à un support en fer et positionnez la pointe de l’aiguille verticalement à une distance de quatre à six centimètres au-dessus d’un creuset Dewar peu profond.

Ensuite, fixez une électrode à pince crocodile à l'extrémité de l'aiguille, en veillant également à ce que la pince crocodile soit reliée à la borne positive de l'alimentation haute tension. Repliez une bande de papier d'aluminium sur le bord du ballon à vide. Puis, fixez une deuxième électrode à pince crocodile sur le bord extérieur du papier d'aluminium.

Connectez-le à la borne de masse de l'alimentation électrique. Remplissez le flacon de Dewar avec de l'azote liquide jusqu'à environ un centimètre du bord supérieur, de sorte que les trois quarts de la feuille soient immergés. Réglez ensuite la pompe à seringue à un débit d'infusion de 30 millilitres par heure et pulvérisez électriquement les échantillons conformément au protocole décrit dans le texte.

Une fois l'infusion terminée, versez soigneusement l'excès d'azote liquide du Dewar, en laissant le micro-support en suspension dans environ 25 millilitres d'azote liquide afin de garantir qu'ils restent congelés. Transférez immédiatement les micro-supports avec l'azote liquide dans un tube de centrifugation de 50 millilitres en versant d'un seul mouvement fluide. Utilisez ensuite une spatule pour récupérer les micro-supports congelés restants dans le Dewar.

Ajoutez-les également à la centrifugeuse. Pour préparer la lyophilisation, recouvrez le tube à centrifuger d'une feuille d'aluminium perforée de petits trous. Placez les tubes à centrifuger ainsi recouverts dans un flacon de lyophilisateur.

Ensuite, connectez immédiatement le ballon au lyophilisateur et séchez les échantillons toute la nuit. Transférez délicatement la mousse lyophilisée dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant un excès d'éthanol absolu. De même, remettez en suspension la microporteuse lyophilisée dans un excès d'éthanol absolu directement dans le tube à centrifuger d'origine utilisé pour la collecte.

À l’aide d’une pipette serologique, filtrer les micro-supports à travers un tamis en acier inoxydable de taille de maille définie dans un nouveau tube de centrifugation de 50 millilitres afin d’éliminer tous les agrégats et de sélectionner les plages de taille souhaitées. Incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou jusqu’à ce que la mousse ou les micro-supports se soient déposées au fond du tube de centrifugation. Ensuite, sous une hotte à flux laminaire et en utilisant une technique aseptique, utiliser une pipette serologique pour éliminer l’éthanol absolu des supports et ajouter un excès d’éthanol à 95 % dilué avec du PBS stérile.

Incuber les supports à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou jusqu'à ce que les supports aient coulé au fond du récipient de réhydratation. Réhydrater progressivement les supports à l'aide d'une série d'éthanol. À chaque étape, incuber les supports à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils tombent au fond du récipient, avant de changer la solution.

Remplacer le PBS stérile par deux autres rinçages afin d'éliminer l'éthanol résiduel. Conserver les échantillons dans du PBS stérile à 100 % à quatre degrés Celsius jusqu'à leur utilisation en culture cellulaire. Utiliser les supports de culture entre une et deux semaines après leur réhydratation.

On voit ici des exemples de types de mousses et de micro-supports dérivés de la MEC, fabriqués à partir de tissu adipeux décellularisé, de tissu dermique porcin décellularisé et de ventricule gauche porcin décellularisé. Ces exemples montrent que ces techniques peuvent être appliquées pour générer des bioscaffolds spécifiques à un tissu en utilisant divers tissus décellularisés comme sources de MEC.

Après broyage cryogénique ou hachage, digestion enzymatique et homogénéisation, les échantillons peuvent être distribués dans un récipient avant congélation et lyophilisation. Cette figure représente des mousses broyées de DAT, DDT et DLV réhydratées, synthétisées dans un moule de plaque de culture tissulaire à 48 puits. Ces mousses de DAT, DDT et DLV ont été fabriquées à l’aide de MEC broyé cryogéniquement à une concentration de 35 milligrammes par millilitre et à une température de congélation de moins 80 degrés Celsius.

Pour fabriquer des microporteurs dérivés de la MEC à l’aide d’une technique d’électrospray, pour chaque concentration de suspension de MEC, la taille de l’aiguille, le débit d’infusion et la tension peuvent être ajustés afin de générer des microporteurs sphériques distincts, dont le diamètre varie de 350 à 500 micromètres après réhydratation contrôlée. Enfin, les microporteurs DAT, DDT et DLV présentés ici en MEB révèlent que l’ultrastructure en taille peut varier selon la source de MEC décellularisée. Les méthodes présentées dans cette vidéo peuvent être utilisées pour fabriquer une grande variété de microporteurs et de mousses spécifiques aux tissus, composés de MEC pure, non réticulée chimiquement, en utilisant un tissu décellularisé comme source matricielle.

Après avoir suivi ces procédures, les mousses et les micro-supports peuvent être ensemencés avec des cellules en conditions statiques ou dynamiques et peuvent être utilisés comme substrats instructifs pour les cellules en culture cellulaire in vitro et en applications in vivo.