Name: Imagerie en direct de lactivité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à A. fumigatus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Découvrez l'évaluation de l'activité antifongique des neutrophiles et monocytes humains primaires en temps réel par imagerie vidéo à l'aide de conidies fluorescentes d'Aspergillus fumigatus.

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Ce travail a été soutenu par la MRC et l&#39;Université d&#39;Aberdeen (MRC Centre de Mycologie Médicale) et par le Prix stratégique Wellcome Trust - mycologie médicale Fungal Immunologie (SFB, JMB, JK, AW). Un grand merci est donnée au soutien du Fonds Chloe. TMH est soutenu par une subvention de l&#39;Institut national de la santé (NIH, le code RO1 093808) et le Memorial Sloan Kettering Cancer Center est soutenu par des subventions du NIH CA008748 P30. De plus, TMH est un enquêteur dans la pathogénie des maladies infectieuses soutenu par le Fonds Burroughs Wellcome. Nous tenons à remercier le Microscopie Aberdeen et Facility Histologie pour leur aide et leur soutien.

Le protocole pour l&#39; obtention de neutrophiles et des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont basées sur les méthodes publiées antérieurement 9. L&#39;utilisation d&#39;échantillons de sang provenant de volontaires sains a été approuvé par le comité d&#39;éthique de la recherche humaine de l&#39;Université d&#39;Aberdeen. Avant de commencer assurez-vous que toutes les approbations éthiques sont en place pour prélever du sang chez des volontaires sains et / ou des patients dans le but de l&#39;expérience décrite. Gardez les cellules sur la glace si possible d&#39;augmenter leur survie. 1. A. fumigatus Culture et conditions <ol><li> Préparer un milieu d&#39; agar minimal de glucose comme décrit 10. <ol><li> Ajuster médias à pH 6,5 en utilisant du NaOH 1 M et autoclave à 120 ° C pendant 20 min. </li><li> Laisser refroidir à 65 ° C. </li><li> Travailler dans une hotte à flux stérile, verser 30 ml de milieu refroidi dans un flacon T75 et on laisse refroidir le col du ballon reposant sur une pipette de 25 ml à créer incliné de gélose. </li></ol></li><li> Série de la DsRed Af293- souche de A. fumigatus sur la gélose et incuber pendant 7 jours à 37 ° C + 5% CO 2. Deux flacons donneront environ 10 9 conidies dans une solution saline 5 tamponnée au phosphate mL (PBS) pré-biotinylation. </li></ol> 2. A. fumigatus étiquetage et préparation Remarque: Lors de cet essai pour la première fois, préparer le Af293- parental souche de A. fumigatus. Prélever des échantillons des deux souches dans des tubes de microcentrifugation et étiqueter un seul de chaque souche comme décrit ci-dessous. Cela permettra d&#39;avoir une conidies de contrôle sans couleur et conidies avec une seule couleur, soit DsRed ou AF633, pour tester la configuration et de l&#39;équipement. <ol><li> Récolte A. fumigatus conidies par immersion de la culture avec 30 ml de PBS + 0,05% de Tween-80. On filtre la suspension résultante à travers un tamis cellulaire de 40 um dans un tube de 50 ml pour éliminer les fragments d&#39;hyphes. </li><li> Centrifuge à 805 xg pendant 10 minutes, éliminer le surnageant et laver une fois dans 20 ml de PBS stérile. Piscine conidies de deux plaques de la même souche lors de l&#39;étape de lavage. </li><li> Après l&#39;étape de lavage, resuspendre le culot dans 5 ml de PBS et le transfert aliquotes de 1 ml de suspension de conidies dans des tubes de microcentrifugation. 1 ml de suspension de chaque souche est généralement suffisant pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. Envelopper les aliquotes restantes dans la feuille et stocker à 4 ° C. </li><li> aliquotes centrifugeuse de suspension de conidies à 9,300 g pendant 10 min à température ambiante et retirez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de conidies 0,05 M pH 8,3 NaHCO 3. </li><li> Préparer 10 mg de biotine / 200 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) solution mère en reconstituant 25 mg de biotine dans 500 ul de DMSO. Ajouter 10 ul de biotine / DMSO solution mère dans le tube de microcentrifugeuse, le couvercle en feuille d&#39;aluminium et incuber pendant 2 heures sur une bascule à 4 ° C. <ol><li> Aliquoter le reste de la biotine / DMSO stock solution et congeler à -20 ° C pour une utilisation dans des expériences ultérieures. </li></ol></li><li> Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et retirez soigneusement le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de conidies de Tris-HCl pH 8,0 100 mM pendant 1 h pour désactiver la biotine flottante. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et retirez soigneusement le surnageant. Laver le culot deux fois avec 1 mL de PBS stérile et resuspendre le culot dans 1 ml de PBS. </li><li> Dissoudre 1 mg de streptavidine-AF633 dans 0,5 ml de PBS pour faire une solution mère à 2 mg / mL. Ajouter 10 ul de 2 mg / ml de streptavidine-AF633 par 1 ml de suspension de conidies et incuber pendant 40 min à température ambiante sur une bascule recouverte de feuille d&#39;aluminium. Le reste streptavidine-AF633 peut être congelé en aliquots pour une utilisation dans des expériences ultérieures. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 9,300 xg et enlever soigneusement surnageant. Remettre en suspension le culot de conidies dans 1 mL de PBS et compter les conidies en utilisant un hémocytomètre à une dilution de 1: 1000 (1: 100 et 1:10). Ajuster la concentration de conidies à 3,6 x 10 6 / mL avec du CO 2 supports indépendants, envelopper dans du papier et stocker à 4 ° C. NOTE: Les conidies sont maintenant étiquetés avec AF633 et seront appelés FLARE conidies. </li><li> Facultatif: Si la stimulation avec des conidies gonflé est nécessaire, après le comptage des conidies (étape 2.9), diluer conidies à 7,2 x 10 6 / ml dans une base d&#39;azote de levure (YNB) moyen et ajouter 500 uL de suspension de conidies à 4,5 ml de milieu YNB dans un autoclave 50 ml flacon Erlenmeyer. Couvrir et placer le ballon dans un incubateur à secousses (200 tours par minute à 37 ° C) pendant 6 h. <ol><li> Transférer le milieu à un tube de 15 ml. Centrifuger à 805 g pendant 10 min à température ambiante et laver une fois dans du PBS. Centrifuger à nouveau culot et remettre en suspension dans 1 ml de milieu CO 2 indépendant, ce qui donne 3,6 x 10 6 conidies / ml. Remarque: Les conidies agglutiner fréquemment après enflent rendant difficile le comptage précis, il est conseillé de calculer le cnuméros ounted de repos conidies utilisés. </li></ol></li></ol> 3. Isolement des humains neutrophiles et des monocytes <ol><li> Tracer 20 ml de sang veineux de volontaires sains dans deux tubes de sang de 10 ml contenant de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Pour chaque donneur séparément, verser 20 ml de sang dans un tube de 50 mL et diluer avec 15 ml de PBS. </li><li> Sous-couche du sang avec 15 ml d&#39;une solution d&#39;isolement des lymphocytes (densité 1,077 g / ml) avec une seringue et une aiguille de fer. Placer l&#39;aiguille dans le bas du tube et forcer doucement la solution d&#39;isolation de lymphocytes out. Centrifuger à 630 g pendant 20 min sans frein et une faible accélération. </li><li> Préparer PBS, refroidi sur la glace. REMARQUE: Les étapes 3.4 et 3.5 doivent être suivies simultanément pour générer des monocytes (3.4) et neutrophiles (3,5). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pastette, récolte la couche PBMC. Ceci est la couche dans le centre entre la couche de sérum jaune (supérieure) et la solution d&#39;isolation de lymphocytes transparent (inférieur), ettransférer dans un nouveau tube de 50 ml. <ol><li> Remplir le tube avec le PBMC jusqu&#39;à 50 ml avec du PBS froid et centrifuger à 582 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS froid et remettre en suspension dans 1 ml de PBS par 20 ml de sang de donneur utilisé initialement. </li><li> Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Préparer une solution tampon par addition de 26 ml de inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (FCS) et 2,1 ml d&#39;EDTA 0,5 M et 500 ml de HBSS. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 515 xg et remettre en suspension dans 40 pl de solution tampon pour 1 x 10 7 cellules. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml et ajouter 10 ul de microbilles CD14 par 1 x 10 7 cellules, bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C, en veillant à mélanger les tubes toutes les 5 min. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 1 ml de solution tampon pour 1 x 10 7 cellules et centrifuge à 515 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension complètement jusqu&#39;à 1 x 10 8 cellules dans 500 ul de solution tampon. </li><li> Placer une colonne par échantillon sur un séparateur magnétique selon les instructions du fabricant. Tout d&#39;abord laver la colonne une fois avec 500 pi de solution tampon. </li><li> Pipeter 500 ul de suspension de cellules à travers la colonne, attendez la colonne pour sécher et laver, en répétant cette opération trois fois avec une solution tampon. </li><li> Placer un nouveau tube de 15 ml en dessous de la colonne et prendre la colonne hors du séparateur magnétique. Ensuite, rincer les cellules de la colonne dans le tube avec 1 ml de solution tampon. </li><li> Ajouter 4 ml de solution tampon et centrifuger à 515 g pendant 10 min, puis remettre en suspension dans 1 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de support. </li><li> Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec unhémocytomètre. </li><li> Ajuster la concentration cellulaire à 6 x 10 5 / ml avec du RPMI et de semences de 200 ul sur une boîte de formation d&#39;image à base de verre de 35 mm. Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Le jour suivant, avant l&#39;imagerie, retirer le RPMI et ajouter 200 ul de milieu CO 2 indépendant. Remarque: Ces monocytes peuvent également être différenciées en différents sous-ensembles macrophage avant l&#39;imagerie. Si cela est une technique à explorer, un excellent point de départ est le document récent de Ohradanova-Repic et al. 1 1. </li></ol></li><li> Après la récolte, la couche PBMC, enlever tout le sérum et la majeure partie de la solution d&#39;isolement des lymphocytes, mais attention à ne pas enlever la petite bande blanche sur le dessus de la pastille rouge comme cela contiendra la plupart des neutrophiles. <ol><li> Préparer un stock tampon de lyse hypotonique 10x en ajoutant 83 g de NH 4 Cl et 10 g de KHCO 3 dans 1 L d&#39;eau stérile. Conserver à 4 °C. </li><li> Diluez ce stock 10x avec de l&#39;eau stérile et l&#39;ajouter aux tubes. Ensuite, retourner avec précaution 3 fois et laisser incuber dans de la glace pendant 15 minutes. </li><li> Centrifuger à 394 g pendant 10 min et remettre en suspension dans un tampon de lyse hypotonique pendant 10 min dans la glace. </li><li> Centrifuger à 394 xg et laver deux fois avec du PBS froid. Remettre en suspension dans 1 ml de CO 2 par moyen indépendant donneur. </li><li> Faire des dilutions 1:10 pour compter par addition de 20 ul de la suspension de cellules à 160 pi de PBS et 20 ul de bleu trypan. Compter les cellules avec un hémocytomètre. </li><li> Par cytométrie de flux, d&#39; ajuster la concentration de 6 x 10 5 / ml et ajouter la suspension de cellules 400 pl sur une plaque à 24 puits. Pour la microscopie, ajouter 200 pi de la même suspension de cellules dans une boîte de formation d&#39;image à base de verre de 35 mm. Remarque: l&#39; imagerie ou neutrophile cytométrie de flux doit être initié immédiatement en raison de leur propension à subir l&#39; apoptose si on les laisse non stimulées. Si ce n&#39;est pas possible neutrophiles doivent être conservésglace et utilisé le plus tôt possible (dans la même journée). </li></ol></li></ol> 4. cytométrie en flux <ol><li> Ajouter 200 pi de 1,2 x 10 6 / mL FLARE conidies aux cellules dans la plaque à 24 puits, puis ajouter 100 ul de 20 ug / mL voriconazole. Ajouter 300 ul de RPMI et incuber pendant 16 h à 37 ° C avec 5% de CO 2. NOTE: Le voriconazole est ajouté pour empêcher la germination des conidies. </li><li> Ajouter 25 ul d&#39;une solution mère de calcofluor blanc 1 mM dans chaque puits pour une concentration finale de 25 uM et incuber pendant 10 min à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Centrifuger à 582 g pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS. </li><li> Pour récolter les cellules adhérentes (monocytes), ajouter 1 ml de PBS avec de l&#39; EDTA 3 mM à chaque puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C avec 5% de CO 2. Lavez délicatement les cellules de la plaque par pipetage et recueillir des cellules dans un tube. </li><li> Laver une fois dans du tampon FACS (2% de sérum de veau foetal à PBS), puis remettre en suspension dans le tampon FACS pour l&#39;analyse FACS. <ol><li> Pour l&#39;analyse FACS, d&#39;abord régler les paramètres de compensation du cytomètre à flux et régler les portes positifs en utilisant des tubes de compensation unique de couleur, y compris les conidies sans couleur: DsRed + conidies, AF633 + conidies, et calcofluor blanc + conidies (généré comme en 4.2). </li><li> Set porte conidies libre basée sur l&#39;avant et la diffusion latérale à l&#39;aide conidies sans couleur. Régler la porte de la cellule sur l&#39;avant et la diffusion latérale en excluant la porte de conidies libre. </li><li> Analyse tube d&#39;échantillon en enregistrant 10.000 événements. NOTE: Les cellules associées à conidies en direct seront DsRed + et + AF633. Les cellules associées aux conidies morts seront AF633 + seulement. Spectateur cellules qui n&#39;ont pas engagés conidies sera dsRed- et AF633-. Les populations de cellules engagées conidies-sont analysés plus en détail pour calcofluor coloration blanc sur le canal bleu du Pacifique. Conidies qui restent en dehors des cellules sera calcofluor blanc + et conidies qui ont été intériorisé serontCalcofluor Blanc-. </li></ol></li></ol> 5. Live Cell Microscopie Vidéo Remarque: Le choix du microscope dépendra de ce qui est disponible localement, mais la configuration du microscope devra inclure une étape inversée, une chambre environnementale chauffé à 37 ° C et les filtres d&#39;excitation / émission appropriés pour DsRed (532/561 nm) et AF633 (633 nm). conidies FLARE ne fonctionnent pas avec le laser 488 nm au lieu du laser 532/561 nm pour DsRed. Lors de cette expérience pour cette première fois, utilisez le conidies de contrôle sans couleur et couleur unique pour tester la fluorescence de fond et transpercement entre les DsRed et les canaux de AF633. <ol><li> Mettre en marche le chauffe-microscope avant l&#39;expérience et laisser suffisamment de temps pour la chambre de contrôle de l&#39;environnement se réchauffer à 37 ° C. Le temps pris pour la température de la chambre afin de stabiliser varie pour différentes configurations de microscope. </li><li> Allumez le microscope et l&#39;ordinateur, et voiciannonce le logiciel d&#39;imagerie. Monter le plat d&#39;imagerie sur la scène du microscope et la mise au point de trouver les neutrophiles humains ou monocytes. </li><li> Pour DsRed et AF633, régler la puissance du laser de 10% et le temps d&#39;exposition à 1 s dans les paramètres d&#39;acquisition. </li><li> Retirer la lame de formation d&#39;image et ajouter 100 ul de 3 x 10 6 / mL FLARE de suspension de conidies dans les puits appropriés (volume total de 300 pl / puits). Notez le temps que FLARE conidies sont ajoutés au plat. </li><li> Retour à la diapositive la scène et régler la sensibilité de la caméra pour DsRed et AF633 pour voir clairement les conidies mais pas surexposer l&#39;image. Mettre en place une liste de points d&#39;étape si l&#39;acquisition multi-points est nécessaire. </li><li> Commencer l&#39;imagerie lorsque tous les points sont mis au point, les canaux sont optimisés et le temps de cycle et la durée est définie. Le temps de cycle et la durée de formation d&#39;image dépend de la question expérimentale. Le but est de maintenir le temps de cycle le plus court possible (≤2 min) avec 1 min pour permettre une analyse en profondeur de uptla dynamique de AKE. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Cette méthode décrit une méthode novatrice dans in vitro pour étudier l&#39;activité antifongique des phagocytes humains primaires contre A. fumigatus utilisant Aspergillus fluorescent rapporteur (FLARE) conidies, imagerie des cellules vivantes et cytométrie de flux. Des études antérieures ont démontré la valeur ajoutée de l&#39; utilisation conidies FLARE in vivo dans une infection fongique expérimentale murine et dans l&#39; évaluation in vitro de l&#39; immunité antifongique 6, 7. La combinaison de FLARE conidies avec cette nouvelle génération en temps réel technique d&#39;imagerie cellulaire permet une installation pour mesurer la viabilité des conidies individuelle au cours des interactions dynamiques in vitro. La méthode décrite a le potentiel d&#39;enquêter sur les rôles et l&#39;importance de certains processus cellulaires de cellules immunitaires sur leurs réponses anti-fongiques. En outre, les réponses anti-fongiques de phagocytes de patients spécifiques souffrant desimples défauts de composants définies dans le système immunitaire peut être évaluée de façon plus détaillée. Très tôt et les réponses initiales antifongiques peuvent être étudiés en détail plus de 6 h d&#39;imagerie continue. Cela permet même des différences subtiles à détecter, telles que la vitesse de migration des phagocytes vers le champignon, les taux d&#39;intériorisation, la dynamique des événements 12 parasiticides, qui seraient indiscernables en utilisant des méthodes de phagocytose conventionnelles. Tout type de cellule peut être utilisée avec cette méthode; les types cellulaires utilisés ici ont été choisis parce que ces phagocytes constituent les première et deuxième lignes de défense dans les voies respiratoires humaines contre A. fumigatus 13. Fait intéressant, on observe des différences très claires entre la façon dont les monocytes et les neutrophiles engagent des aires de repos et conidies enflé et hyphes. Monocytes migrent à peine conidies, tandis que les neutrophiles présentent une activité beaucoup plus migratoire. mar fluorescent supplémentairekers tels que des marqueurs vivants morts sur les cellules immunitaires peuvent être inclus dans l&#39;essai pour fournir des indications sur la survie des phagocytes suivant interactions avec Aspergillus. Des applications intéressantes futures potentielles de cette technologie comprennent la co-culture de différents types de cellules hôtes, les conséquences pour les réponses antifongiques (par exemple, les macrophages sur une monocouche épithéliale, les cellules dendritiques dérivées de monocytes ensemble avec neutrophiles), et la mesure en temps réel de réactif production d&#39; oxygène de l&#39; espèce ou des neutrophiles formation de piège extracellulaire après stimulation par Aspergillus. Quelques points doivent être notés pour utiliser ce protocole, avant tout de l&#39;installation de laboratoire requis: un microscope avec une phase inversée, une chambre environnementale stable à 37 ° C, et l&#39;excitation / filtres d&#39;émission pour DsRed (532/561 nm) et AF633 ( 633 nm). La capacité du microscope pour maintenir les cellules en mise au point et à conserver l&#39;immersion dans l&#39;huile (particulièrement pertinente au cours de macquisition ulti point) doit être contrôlée périodiquement en raison de la longue durée de l&#39;imagerie. Pour la quantification de l&#39;activité parasiticides installations cytométrie de flux sont nécessaires. En outre, les approbations institutionnelles et éthiques appropriées doivent être mises en place pour travailler avec donneur sain et des échantillons de sang provenant de patients et les champignons génétiquement modifiés. Il est fortement recommandé d&#39;utiliser des échantillons de sang frais (utilisation le même jour) pour augmenter la viabilité des cellules et de préserver la fonctionnalité. Idéalement, l&#39;isolement des cellules est effectuée immédiatement après l&#39;étirage des échantillons de sang et les neutrophiles sont imagés immédiatement après l&#39;isolement. En conclusion, une nouvelle génération technique d&#39;imagerie de cellules vivantes pour évaluer en détail l&#39; activité antifongique phagocytaire contre A. fumigatus est décrit. Cette technologie peut fournir un aperçu unique sur les interactions cellulaires fongiques individuelles dans les premières défenses immunitaires innées contre Aspergillus.

Aspergillus fumigatus est un champignon pathogène opportuniste et la cause fongique la plus courante des infections pulmonaires invasives chez l&#39;hôte immunodéprimé 1, 2. Comprendre comment les cellules immunitaires hôtes reconnaissent et éliminent Aspergillus est un domaine important de la recherche fongique, cependant, les tests actuellement disponibles parasiticides ont des limites importantes. Les méthodes couramment utilisées pour mesurer l&#39; activité fongicide comprennent les dosages colorimétriques et détermination des unités formant des colonies 3, 4. Cependant, ces méthodes fournissent des informations sur la viabilité des champignons à un seul point du temps plutôt que de considérer l&#39;interaction dynamique entre l&#39;hôte et l&#39;agent pathogène. Par conséquent, ces méthodes ne peuvent pas prendre en compte si un champignon a été tué ou simplement (temporairement) restreint la croissance ou l&#39;activité métabolique. Nous avons mis au point une méthode capable d&#39;observer fungiciactivité dal directement tout en capturant simultanément des informations détaillées sur la phagocytose, la migration des phagocytes et l&#39;inhibition de la croissance fongique. Auparavant, un protocole a été publié en utilisant l&#39; imagerie en temps réel comme un moyen pour mesurer la phagocytose de Candida albicans par une lignée cellulaire de macrophages de souris 5. Ce concept a été développé plus pour combler le déficit de connaissances dans notre compréhension des interactions avec les cellules immunitaires Aspergillus en utilisant FLUORESCENT Aspergillus REPORTER (FLARE) conidies 6, 7, 8. Ces conidies expriment un fluorochrome rouge (DsRed) et sont marquées avec un second fluorophore (Alexa Fluor 633). Une fois qu&#39;une conidie FLARE est tué, il cesse de produire DsRed et la DsRed restants fondus, tandis que le reste AF633 fluorescent et lié à la conidies. Cela crée une distinction claire entre fu morts et vivantscellules NGAL lors de l&#39;imagerie de cellules vivantes et cytométrie de flux, et permet le suivi du sort des conidies individuels après leur interaction avec les cellules immunitaires. Les essais décrits fournissent une méthode efficace de visualiser l&#39;interaction entre les cellules immunitaires hôtes et Aspergillus et seront d&#39; une valeur considérable dans le décryptage des voies de signalisation cellulaires responsables de mécanismes effecteurs antifongiques dans les cellules immunitaires innées. D&#39; autres applications comprennent la visualisation de la façon dont les changements dans la croissance d&#39; Aspergillus, tels que le passage de repos à conidies gonflé, ou de conidies gonflés à hyphes, affectent la reconnaissance des phagocytes et la fonction. Le protocole suivant décrit en détail comment obtenir des monocytes humains et des neutrophiles; la façon de préparer la FLARE conidies; et comment capturer leurs réponses avec la microscopie vidéo et cytométrie de flux. Bien que l&#39;utilisation de cellules immunitaires humaines isolées à partir du sang de donneur est décrit ici, cettetechnique a fait ses preuves tout aussi efficace en utilisant une variété de populations de cellules murines.

<table><tbody><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>T75 flacon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658 175</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>10592955 https://nl.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>40 &micro ; Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>15 mL Tube Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td>50 mL Tube Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227 261</td><td>http://www.greinerbioone.com/</td></tr> <tr><td></td><td>MilliQ Millipore</td><td>QGARD00R1</td><td>L’eau Nanopure fonctionne de la même manière. http://www.merckmillipore.com/</td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td> à <td>la biotine</td><td>B-6352</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td> <td>à la streptavidine-AF633</td>.<td>S-21375</td><td>AF633 est le seul fluorophore testé à ce jour qui reste visible dans les phagosomes. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html</td></tr> tubes sanguins <tr><td>EDTA</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455036</td><td>Tous les tubes sanguins contenant un agent anticoagulant devraient fonctionner. http://www.greinerbioone.com/en/start/</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>http://www3.gehealthcare.com/</td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV3008401</td><td>https://www.thermofisher.com/</td></tr> <tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112&nbsp ;</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>Microbilles CD14</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>D’autres méthodes d’isolement des monocytes peuvent également être utilisées, nous préférons cette méthode car elle donne une grande pureté constante des monocytes sans être gourmande en main-d’œuvre. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>MS Columns</td><td>Myltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Voir le commentaire sur les microbilles CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/</td></tr> <tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>72400-021</td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html</td></tr><tr><td>Milieu indépendant 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045054</td><td>Nécessaire s’il n’y a pas suffisamment d’échange de CO2 pendant l’imagerie. https://www.thermofisher.com/uk/en/home</td></tr><tr><td>&micro ;-slide 8 puits fond en verre</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>C’est la parabole d’imagerie que nous utilisons, mais n’importe quelle parabole d’imagerie en verre de taille appropriée devrait fonctionner. http://ibidi.com/</td></tr> <tr><td>UltraVIEW VoX 3D Live Cell Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>L7267000</td><td>Comprend un logiciel de volocité pour l’acquisition et l’analyse. http://www.perkinelmer.com/</td></tr> <tr><td>Calcofluor blanc</td><td>Sigma</td><td>18909</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>Voriconazole</td><td>Sigma</td><td>PZ0005</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>BD LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Débitcytomètre utilisé. https://www.bdbiosciences.com/</td></tr></tbody></table>

imagerie en direct de l&#39;activité par human antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; a. fumigatus</em

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus est un champignon pathogène opportuniste causant des infections invasives chez les hôtes immunodéprimés avec un fort taux de létalité. Recherche portant sur les réponses immunologiques contre A. fumigatus a été limitée par l&#39;absence d&#39;analyses cohérentes et fiables pour mesurer l&#39;activité antifongique des cellules immunitaires spécifiques in vitro. Une nouvelle méthode est décrite pour évaluer l&#39;activité antifongique des monocytes et des neutrophiles primaires provenant de donneurs humains contre A. fumigatus utilisant Aspergillus fluorescent rapporteur (FLARE) conidies. Ces conidies contiennent un reporter DsRed génétiquement codé, qui est exprimée de manière constitutive par les conidies en direct FLARE et sont à l&#39; extérieur marqué avec Alexa Fluor 633, qui est résistant à la dégradation à l&#39;intérieur du phagolysosome, permettant ainsi une distinction entre vivants et morts A. fumigatus conidies. microscopie vidéo et cytométrie de flux sont ensuite utilisés pour visualiser la Interagirion entre conidies et les cellules immunitaires innées, l&#39;évaluation de l&#39;activité fongicide tout en fournissant également une mine d&#39;informations sur la migration des phagocytes, la phagocytose et l&#39;inhibition de la croissance fongique. Cette nouvelle technique a déjà fourni de nouvelles informations passionnantes sur l&#39;interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus. Il est important de noter la configuration de laboratoire requis pour effectuer cette analyse, y compris la microscopie nécessaire et cytométrie de flux des installations, et la capacité de travailler avec du sang de donneurs humains et les champignons génétiquement modifiés. Cependant, cet essai est capable de générer de grandes quantités de données et peut révéler un aperçu détaillé dans la réponse antifongique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier l&#39;interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus. Il est important de noter la configuration de laboratoire requis pour effectuer cette analyse, y compris la microscopie nécessaire et cytométrie de flux facilities et la capacité de travailler avec le sang des donneurs humains et les champignons génétiquement modifiés. Cependant, cet essai est capable de générer de grandes quantités de données et peut révéler un aperçu détaillé dans la réponse antifongique. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier l&#39;interaction hôte-pathogène des cellules immunitaires primaires contre A. fumigatus.

Les résultats représentatifs sont présentés suivant le protocole décrit. La figure 1 illustre un représentant 6 h vidéo en direct avec des cellules neutrophiles humains et FLARE conidies. DsRed (rouge) est exprimé par les conidies eux-mêmes alors qu&#39;ils ont été étiquetés avec AF633 (Magenta). La figure 2 est une image à partir d&#39; un seul point du temps d&#39;un film similaire comme indiqué dans la figure 1, illustrant la différence entre FLARE morts et vivants conidies. Morts conidies se distinguent des conidies en direct en perdant leur signal DsRed (rouge), tout en maintenant une fluorescence AF633 lumineux (magenta). A. fumigatus conidies survivent souvent dans les phagocytes pour plus de 6 h. Par conséquent, pour quantifier efficacement tuer, cytométrie de flux sont présentés parcelles pendant une période d&#39;incubation de 16 h à la figure 3. Ces données ont été obtenues avec un macrophage alvéolaire CEligne ll comme un exemple, mais peut être réalisée avec tout type de cellule. Dans la figure 4 , la migration est indiquée dans la première heure de stimulation pour les neutrophiles humains ainsi que leur vitesse et le mouvement directionnel. La figure 5 représente le pourcentage de neutrophiles et de monocytes qui ont ingéré 1, 2, 3 conidies ou plus tandis que la figure 6 montre le nombre de conidies qui germent dans les hyphes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig1.jpg" /> Figure 1: microscopie vidéo cellules vivantes film de neutrophiles humains et FLARE conidies. Les neutrophiles ont été isolés à partir de sang humain et ensemencées avec FLARE conidies en milieu CO 2 indépendant à un rapport de 1: 3, respectivement. L&#39;imagerie a été initiée directement à 37 ° C avec un microscope confocal à disque rotatif. Les images ont été capturées à intervalles de 1 min et 55 s sur une période de 6 h. Barre d&#39;échelle = 10 pm.Un zoom vidéo est représenté avec les canaux séparés pour clarifier le rôle des conidies évasé avec DIC en haut à gauche, DsRed (rouge) dans la partie supérieure droite, AF633 (vert) dans le coin inférieur gauche et la vidéo fusionnée en bas à droite . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/Fig_1.avi">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig2.jpg" /> Figure 2: image seul point du temps qui démontre la différence entre FLARE morts et vivants conidies. Les neutrophiles humains ont été stimulées avec FLARE conidies et imagé avec un microscope confocal à disque rotatif. Une image a été prise à partir des films générés. Morts conidies se distinguent des hyphes en ayant perdu leur DsRed (rouge: haut à droite) le signal tout en conservant leur fluorescence AF633 (verte: en bas à gauche). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig2large.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour</a><html> voir une version plus grande de ce chiffre. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig3.jpg" /> Figure 3: Quantification et validation de phagocytose et de A. fumigatus conidies. les cellules de macrophages alvéolaires de souris (MH-S) ont été incubées avec FLARE conidies à un rapport 1: 1 pendant 16 h en présence de voriconazole. les cellules MH-S associés aux conidies vivants sont présentées dans la grille rouge (DsRed + AF633 +). les cellules MH-S associés avec des conidies mortes sont présentées dans la grille bleue (DsRed-AF633 +). Bystander cellules MH-S sont présentées dans la grille d&#39;or. Calcofluor blanc, un colorant fluorescent de cellule imperméable qui se lie à la paroi cellulaire fongique, est utilisé pour distinguer les conidies extracellulaire (calcofluor blanc +) à partir de conidies intracellulaire (calcofluor Whitehead). Comme une validation supplémentaire pour le procédé, il est démontré que le traitement avec 2 uM de cytochalasine D inhibe l&#39;absorption des conidies par les cellules MH-S.e.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig3large.jpg&quot;&gt;Please cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig4.jpg" /> Figure 4: La migration des neutrophiles humains et monocytes contre A. fumigatus conidies. Les neutrophiles ont été isolés à partir de sang humain et ensemencées avec FLARE conidies en milieu CO 2 indépendant à un rapport de 1: 3, respectivement. L&#39;imagerie a été initiée directement à 37 ° C avec un microscope confocal à disque rotatif. Les images ont été capturées à 1 min et 55 s intervalles sur une période de 6 heures. La migration de tous les neutrophiles humains individuels par champ a été suivi en utilisant un logiciel de suivi manuellement à l&#39;encontre de repos (A) et gonflé (B) conidies pendant 1 h. Les données représentent une trame de cellules pour chaque condition du même donneur. Le facteur méandres (C), une mesure de la directiomouvement final, et la vitesse (D) ont ensuite été quantifiés en utilisant le même logiciel. Moyenne ± SEM pour 3 donneurs sont représentés avec 30 cellules par donneur plus de 2 expériences indépendantes. *: P &lt;0,05 (test t de Welch corrigé). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig4large.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig5.jpg" /> Figure 5: phagocytose de A. fumigatus conidies par les neutrophiles humains et les monocytes. Les neutrophiles et les monocytes ont été isolés à partir de sang humain et ensemencées avec FLARE conidies en milieu CO 2 indépendant à un rapport de 1: 3, respectivement. L&#39;imagerie a été initiée directement à 37 ° C avec un microscope confocal à disque rotatif. Les images ont été capturées à intervalles de 1 min et 55 s sur une période de 6 h. La phagocytose a été mesurée comme la quantité de cellules contiennenting conidies FLARE après 4 h de stimulation. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM de 3 donneurs et 3 images par donateur de plus de 2 expériences indépendantes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig5large.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/55444/55444fig6.jpg" /> Figure 6: Inhibition de la germination des conidies de A. fumigatus par les neutrophiles et les monocytes. Les neutrophiles et les monocytes ont été isolés à partir de sang humain et ensemencées avec FLARE conidies en milieu CO 2 indépendant à un rapport de 1: 3, respectivement. L&#39;imagerie a été initiée directement à 37 ° C avec un microscope confocal à disque rotatif. Les images ont été capturées à 1 min et 55 s intervalles sur une période de 6 heures. L&#39;inhibition de la germination fongique a été examiné en mesurant le pourcentage de conidies qui avait germeinés après 2, 4 et 6 h de co-culture. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM de 3 donneurs et 3 images par donateur de plus de 2 expériences indépendantes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55444/55444fig6large.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Nous décrivons ici un protocole pour évaluer l&#39; activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires en temps réel en utilisant fluorescent Aspergillus reporter conidies conjointement avec la microscopie vidéo en direct de cellules et cytométrie de flux. Les données obtenues permettent de mieux comprendre les interactions Aspergillus niger hôtes telles que l&#39; activité fongicide, la phagocytose, la migration cellulaire et l&#39; inhibition de la croissance fongique.

Imagerie en direct de l&#39;activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires en temps réel, à l'aide de conidies rapporteurs fluorescentes d'Aspergillus et de la microscopie vidéo de cellules vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les réponses immunitaires contre les infections fongiques chez des populations de patients spécifiques, en particulier la réponse immunitaire innée survenant précocement après l'exposition aux champignons. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'identifier des défauts spécifiques dans l'immunité innée et antifongique, tels que la phagocytose, la migration cellulaire, la destruction ou l'inhibition de la croissance fongique.Pour commencer, ensemencer la souche d'Aspergillus fumigatus AF293 portant le gène rapporteur fluorescent dsRed sur gélose préparée dans deux flacons T75. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius, 5 %CO2 pendant sept jours afin d'obtenir environ 10 à la puissance 9 conidies. Après l'incubation, immerger les cultures dans 20 millilitres de PBS contenant 0,05 % de Tween 80 et recueillir les conidies d'A. fumigatus.Ensuite, à l’aide d’un tamis à cellules de 40 micromètres, filtrer les suspensions obtenues dans un tube de 50 millilitres afin d’éliminer les fragments d’hyphes. Une fois les suspensions filtrées, les centrifuger à 805 × g pendant 10 minutes. Puis jeter les surnageants et resuspendre les culots dans 20 millilitres de PBS stérile.Enfin, rassemblez les échantillons et centrifugez la suspension obtenue une dernière fois. Resuspendez le culot dans cinq millilitres de PBS et transférez des aliquotes d'un millilitre de la suspension conidienne obtenue dans des tubes de microcentrifugation. Centrifugez les aliquotes à 9 300 × g pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot de conidies dans un millilitre de bicarbonate de sodium 0,05 molaire de pH 8,3. Pour marquer les conidies, ajoutez 10 microlitres de la solution mère de biotine dans le tube de microcentrifugation, recouvrez l'échantillon de papier d'aluminium et incubez pendant deux heures sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé l'échantillon marqué à la biotine pendant 10 minutes à 9 300 ×g, retirez soigneusement le surnageant.Ensuite, resuspendre le culot de conidies dans un millilitre d'une solution de Tris-HCl à 100 micromolaire et de pH 8,0. Incuber cette suspension à quatre degrés Celsius pendant une heure sous agitation douce pour désactiver la biotine non liée. Centrifuger l'échantillon à 9 300 ×g pendant 10 minutes.Retirez soigneusement le surnageant obtenu, lavez le culot avec un millilitre de PBS stérile et resuspendez le culot dans un millilitre de PBS. Ajoutez ensuite 10 microlitres d'une solution mère de Streptavidine-AF633 à un millilitre de la suspension conidienne. Incubez cette suspension, recouverte de papier d'aluminium, pendant 40 minutes à température ambiante sur un agitateur rotatif.Centrifuger l'échantillon à 9 300 ×g pendant 10 minutes. Ensuite, retirer soigneusement le surnageant et resuspendre le culot de conidies dans un millilitre de PBS. À l'aide d'un hématimètre, dénombrer les conidies à une dilution de un à 1 000, puis ajuster la concentration de conidies à 3,6 × 10⁶ conidies par millilitre avec un milieu indépendant du CO₂.Enfin, envelopper la suspension dans du papier d’aluminium et conserver à quatre degrés Celsius. Prélever et diluer un échantillon de sang humain avec du PBS. Puis utiliser une seringue munie d’une aiguille en fer pour superposer l’échantillon sanguin avec 15 millilitres d’un milieu destiné à l’isolement des cellules mononucléées.Centrifuger l'échantillon à 630 ×g pendant 20 minutes sans frein et avec une accélération faible. Prélever avec une pipette Pasteur la couche centrale de PBMC située entre le sérum jaune et la couche transparente de solution d'isolement des lymphocytes. Ensuite, transférer la suspension recueillie dans un nouveau tube de 50 millilitres.Diluez les PBMC avec du PBS afin d'obtenir 50 millilitres de suspension et lavez les cellules. Après le lavage, mélangez 20 microlitres de la suspension cellulaire avec 160 microlitres de PBS et 20 microlitres de bleu de trypan, puis comptez les cellules à l’aide d’un hématimètre. Une fois le comptage effectué, diluez à une concentration appropriée dans un tube de 15 millilitres, centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 515 ×g, puis resuspendez-les en utilisant 40 microlitres de solution tampon par 1 × 10⁷ cellules.Ajouter 10 µL de microbilles CD14 par 1 × 10⁷ cellules et mélanger soigneusement. Incuber l'échantillon à 4 °C pendant 15 minutes, en veillant à mélanger le tube toutes les cinq minutes. Après la conjugaison, laver les cellules dans 1 mL de solution tampon par 1 × 10⁷ cellules et centrifuger la suspension à 515 × g pendant 10 minutes.Ensuite, resuspendre jusqu'à une fois 10 à la puissance 8 cellules dans 500 microlitres de solution tampon. Monter une colonne, qui sera utilisée avec un échantillon unique, sur un séparateur magnétique selon les instructions du fabricant, et rincer la colonne une fois avec 500 microlitres de solution tampon. Appliquer 500 microlitres de la suspension cellulaire sur la colonne.Une fois qu'il est sec, lavez la colonne trois fois à l'aide de solution tampon. Placez un nouveau tube de 15 millilitres sous la colonne et détachez la colonne du séparateur magnétique. Ensuite, à l'aide d'un millilitre de solution tampon, éluerez les cellules de la colonne dans le tube.Lavez et resuspendez les cellules éluées dans du milieu RPMI. Après avoir ajusté la densité cellulaire à six fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre, semez 200 microlitres de la suspension dans une boîte d'observation de 35 millimètres à fond en verre. Incubez la culture toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.Pour isoler les neutrophiles, retirez tout le sérum et la majeure partie de la solution d'isolement des lymphocytes de l'échantillon sanguin restant après la récolte des PBMC. Veillez à ne pas retirer la fine bande blanche située au-dessus du culot rouge. En gardant les cellules sur de la glace, lysez ensuite les globules rouges et centrifugez les neutrophiles restants à 394 fois G. Lavez ensuite les cellules deux fois avec du PBS froid, puis resuspendez-les dans un millilitre de milieu indépendant du CO2.Pour une cytométrie en flux, ajustez la densité cellulaire à six fois 10 à la puissance 5 cellules par millilitre et ajoutez 400 microlitres de la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits. Ajoutez 200 microlitres de la même suspension cellulaire dans une boîte d’imagerie de 35 millimètres à base de verre pour l’examen microscopique. Pour visualiser dsRed et Alexa Fluor 633 lors de la microscopie, préchauffez le réchauffeur du microscope et allumez le microscope ainsi que l’ordinateur.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de suspension conidienne FLARE à trois fois dix puissance six par millilitre dans les puits appropriés de la boîte d'imagerie. Notez l'heure d'ajout des conidies FLARE. Placez la boîte d'imagerie sur la platine du microscope, puis dans les paramètres d'acquisition, réglez la puissance du laser à 10 % et le temps d'exposition à une seconde.Et régler la sensibilité de la caméra pour obtenir une image nette mais non surexposée de dsRed et d'AF633, puis configurer une liste de points de la platine. Lancer l'acquisition lorsque tous les points sont au point focal, que les canaux fluorescents sont optimisés, et que le temps de cycle et la durée sont définis. Les images présentées ici ont été prises lors d'une culture simultanée de neutrophiles et de conidies FLARE.Le signal fluorescent vert correspondant à la coloration par l'AF633 est visible dans les conidies vivantes et mortes. En revanche, la fluorescence dsRed ne peut être observée que dans les conidies vivantes. Ainsi, parmi toutes les conidies détectées, seules celles colorées simultanément par les deux colorants et visibles sous forme de taches magenta sont vivantes.La phagocytose et la destruction des conidies d’A. fumigatus co-cultivées avec des macrophages alvéolaires de souris ont été quantifiées par cytométrie en flux. Dans l’analyse, les macrophages témoins sont délimités par une fenêtre orange, tandis que les macrophages associés à des conidies mortes et positifs uniquement pour la coloration AF633 sont situés dans la fenêtre bleue. De plus, les conidies mortes ne présentent pas de coloration au blanc calcofluor, indiquant leur localisation intracellulaire.Les conidies vivantes marquées par dsRed et AF633 sont délimitées par une fenêtre rouge ; ces conidies sont également internalisées dans les cellules macrophagiques, comme en témoigne la diminution de la coloration au calcofluor blanc. Enfin, l'influence d’A. fumigatus sur la migration des neutrophiles humains a été évaluée, révélant une augmentation du déplacement et de la vitesse des cellules immunitaires en réponse aux conidies gonflées par rapport aux conidies au repos. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit heures pour une population cellulaire unique.Pendant la réalisation de cette procédure, il est important de garder vos cellules sur de la glace. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que la mesure des espèces réactives de l'oxygène ou la cytocinèse, peuvent être réalisées afin d'obtenir des informations supplémentaires concernant la réponse immunitaire innée antifongique au sein de la même population cellulaire. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie fongique pour explorer la phagocytose et la destruction antifongique à l'aide de pathogènes fongiques dans des cellules immunitaires primaires.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer en temps réel les réponses immunitaires innées antifongiques des cellules immunitaires humaines primaires à l'aide de conidies rapporteurs fluorescents d'Aspergillus et de la microscopie vidéo de cellules vivantes. N'oubliez pas que le travail avec du sang humain peut présenter des risques et que des précautions appropriées en matière d'équipement de protection individuelle (EPI) doivent toujours être prises pour prévenir la transmission d'infections.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous montrons, comment utiliser les deux photons de microscopie pour l'observation de la dynamique des granulocytes neutrophiles dans les poumons infectés alors qu'ils phagocyter des pathogènes ou de produire des neutrophiles pièges extracellulaires (NET).

Observation directe de la phagocytose et NET-formation par les neutrophiles dans les poumons infectés en utilisant deux microscopie biphotonique

Cette vidéo présente l’imagerie de cellules vivantes pour l’analyse de l’activité antifongique dans les neutrophiles humains à l’aide de conidies rapporteures d’Aspergillus fluorescentes. Initialement, la fluorescence rouge et magenta est détectée dans les neutrophiles, tandis que la fluorescence rouge diminue avec le temps, indiquant la dégradation des conidies et confirmant l’activité antifongique des neutrophiles.

Évaluation en temps réel de l’activité antifongique des cellules immunitaires humaines primaires

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes...

Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Une méthode pour évaluer la capacité des macrophages alvéolaires isolés de la souris pour contrôler la croissance des spores d'Aspergillus phagocytées par microscopie confocale.

Évaluation de l&#39;activité anti-fongique isolé macrophages alvéolaires par microscopie confocale

Plante défensines jouent un rôle important dans la défense de la plante contre les agents pathogènes. Pour une utilisation efficace de ces peptides antifungal agents antifongiques, comprendre leurs modes d’action (PA) est critique. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes est décrite afin d’étudier les aspects essentiels du ministère de l’agriculture de ces peptides.

Imagerie de cellules vivantes des cellules fongiques d’enquêter sur les Modes d’entrée et de la localisation sous-cellulaire des défensines plante antifongique

Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d'Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Les colorants fluorescents vitaux sont des outils essentiels pour les analyses d'imagerie des cellules vivantes dans la biologie des cellules fongiques modernes. Cet article détaille l'application de colorants fluorescents établis et moins connus pour suivre la dynamique de la membrane plasmatique, l'endo-/exocytose et la morphogénèse de la paroi cellulaire dans les champignons filamenteux.

Application de colorants fluorescents sélectifs de membrane et de mur cellulaire pour l'imagerie de cellules vivantes des champignons filamenteux

Les protocoles décrits ci-dessus fournissent un guide pour visualiser et quantifier l’activité des protéases neutrophiles dans les expectorations humaines. Les applications de cette analyse vont de l’évaluation des traitements anti-inflammatoires à la validation des biomarqueurs, au dépistage des médicaments et aux études cliniques de grandes cohortes.

Surveillance de l’activité de l’élastase neutrophile et de la cathepsine G dans les échantillons d’expectorations humaines

En raison de l’opacité du sol, les interactions entre ses microbes constitutifs ne peuvent pas être facilement visualisées avec une résolution cellulaire. Ici, deux outils microfluidiques sont présentés, qui offrent de nouvelles opportunités pour étudier les interactions fongiques-microbiennes. Les appareils sont polyvalents et simples à utiliser, permettant un contrôle spatio-temporel élevé et une imagerie haute résolution au niveau cellulaire.

Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

Ce protocole comprend un ensemble de tests fonctionnels des neutrophiles à utiliser comme méthode de criblage pour couvrir les fonctions de différentes voies de signalisation. Le protocole comprend une évaluation initiale et simple de la viabilité cellulaire, de la pureté, de la production d’espèces réactives de l’oxygène, de la migration en temps réel, de la phagocytose et d’une suggestion préliminaire de pièges extracellulaires à neutrophiles.

Un ensemble de techniques de dépistage pour un aperçu rapide de la fonction des neutrophiles

Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.

Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

Découvrez l'évaluation de l'activité antifongique des neutrophiles et monocytes humains primaires en temps réel par imagerie vidéo à l'aide de conidies fluorescentes d'Aspergillus fumigatus.

Imagerie en direct de l'activité par Human Antifongique primaire neutrophiles et des monocytes en réponse à

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