Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d'exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la fin de la transcription par l’ARN polymérase vers la levure bourgeonnante dans des conditions in vivo par la transcription spécifique du brin à l’approche. Cette méthode permet de répondre à la question clé de savoir si la polymérase transcriptionnellement active détectée au-delà des trois extrémités premières du gène est celle initiée à partir de la région promotrice. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet de distinguer une polymérase transcrite par ARNm d’une polymérase transcrite de manière omniprésente qui initie les transcriptions et qui se trouve à l’extrémité trois du gène.

Cette technique peut être étendue à l’étude de la terminaison de la transcription par d’autres ARN polymérases et levures en raison de la nature conservatrice de la terminaison par différentes polymérases. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du rôle précis des facteurs de terminaison dans le cycle de transcription de la levure, elle peut également être étendue à l’étude de la terminaison chez les eucaryotes supérieurs. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à perméabiliser les cellules et à exécuter la transcription par arrêts, car elles nécessitent une exécution minutieuse et les transcrits naissants peuvent également être difficiles à purifier.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode à partir de l’approche GRO seek qui donne un aperçu à l’échelle du génome de la position des polymérases transcriptionnellement actives d’une manière spécifique au brin. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le cycle de transcription et la purification de l’ARN sont difficiles à réaliser en raison de la faible quantité et de la nature instable des transcrits naissants. Avant de commencer la transcription, exécutez la réaction, cultivez, récoltez et perméabilisez des cellules de levure à croissance exponentielle, pour obtenir une palette de cellules perméabilisées.

Pour démarrer la réaction, ajoutez 150 microlitres de transcription exécutée sur tampon à la palette cellulaire perméabilisée. À l’aide d’une pointe P-200 tronquée, mélangez doucement en pipetant de haut en bas. Placez l’échantillon sur de la glace.

Une fois que tous les échantillons ont été remis en suspension dans le cycle de transcription sur tampon, incubez les échantillons pendant cinq minutes à 30 degrés Celsius dans un bain-marie. Arrêtez la réaction en ajoutant 500 microlitres de réactif d’isolement d’ARN prêt à l’emploi à chaque échantillon. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.

Commencez la procédure d’extraction de l’ARN en ajoutant 200 microlitres de billes de verre lavées à l’acide dans chaque suspension cellulaire et en agitant vigoureusement dans un mélangeur vortex pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après 20 minutes, utilisez une aiguille chaude de calibre 22 pour percer le fond de chaque tube de microcentrifugation et placez le tube sur le dessus d’un tube conique stérile de 15 millilitres. Centrifugez à 300 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius et transférez le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Ajoutez 500 microlitres de réactif d’isolement d’ARN froid et 200 microlitres de chloroforme au lysat cellulaire. Mélangez le contenu sur le mélangeur vortex, puis centrifugez à 16, 168 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ajouter un volume égal d’alcool isoamylique phénol chloroforme froid. Agitez vigoureusement sur le mélangeur vortex, puis centrifugez à 16, 168 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez la phase aqueuse supérieure contenant l’ARN dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Ajoutez à nouveau un volume égal de phénol chloroforme, d’alcool isoamylique froid, de vortex et de centrifugeuse. À l’ARN final contenant la phase aqueuse, ajoutez un volume approprié d’un stock de chlorure de sodium de cinq molaires pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire. Ajoutez trois fois le volume d’éthanol froid pour précipiter l’ARN.

Incuber pendant une heure, ou toute la nuit, à 20 degrés Celsius. Lorsque la précipitation de l’ARN est terminée, centrifugez à 16, 168 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez en suspension la palette d’ARN dans 100 microlitres d’eau DEPC.

À l’aide d’un kit d’isolement d’ARN, séparez l’ARN des nucléotides de bromouridine triphosphate non incorporés et éluez l’ARN de la colonne avec 100 microlitres d’eau exempte d’ARNase. Incuber l’ARN dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez sur de la glace pendant au moins deux minutes.

Commencez cette procédure en préparant les billes d’uranium appauvri anti-bromo pendant que l’ARN est précipité. Pour chaque échantillon, ajoutez 500 microlitres de tampon de liaison EDTA de phosphate salin de sodium à 25 microlitres de billes décantées. Centrifugez à 200 fois G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant.

Lavez les perles trois fois avec le tampon de liaison. Après avoir retiré le surnageant du troisième lavage, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage aux billes et secouez doucement pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius sur une plate-forme vibrante. Lavez les perles deux fois de plus avec 500 microlitres de tampon de liaison.

Retirez le surnageant du deuxième lavage et ajoutez 400 microlitres de tampon de liaison aux billes. Transférez 100 microlitres d’ARN directement dans les billes. Incuber en secouant doucement pendant une à deux heures à quatre degrés Celsius sur une plate-forme vibrante.

Faites tourner à 200 fois G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius, puis retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de liaison aux billes. Faites tourner à 200 fois G pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius et retirez le surnageant.

De cette manière, lavez les billes séquentiellement avec un tampon de liaison, un tampon à faible teneur en sel, un tampon à haute teneur en sel et deux fois avec un tampon TET. Pour éluer l’ARN marqué à la bromouridine triphosphate des billes, ajoutez 150 microlitres de tampon d’élution et incubez pendant quatre minutes à 42 degrés Celsius dans un bain-marie. Faites une brève rotation vers le bas et récupérez le surnageant.

De cette manière, éluez séquentiellement deux fois avec 150 microlitres et une fois avec 200 microlitres de tampon d’élution. Environ 500 microlitres d’ARN marqué à la bromouridine triphosphate purifié d’affinité doivent être obtenus à partir de chaque échantillon. Pour précipiter l’affinité, l’ARN marqué à la bromouridine triphosphate purifié ajoute 500 microlitres de phénol chloroforme, alcool isoamylique froid à chaque échantillon.

Vortex et centrifugeuse à 16, 168 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation. Ajoutez le volume approprié d’un stock de chlorure de sodium à cinq molaires pour obtenir une concentration finale de 0,3 molaire.

Ajoutez ensuite trois fois le volume d’éthanol froid. Incuber à 20 degrés Celsius pendant la nuit pour précipiter l’ARN. Le lendemain, prélever l’ARN précipité par centrifugation à 16, 168 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le surnageant et laissez la palette sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Remettre en suspension la palette d’ARN dans 26 microlitres d’eau DEPC. Déterminez la concentration finale d’ARN en mesurant l’absorbance à 260 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre.

Conservez les échantillons d’ARN et les aliquotes à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à la synthèse de l’ADNc. L’approche de transcription spécifique du brin de bromouridine triphosphate a été utilisée pour tester la nécessité de l’ARN 14 pour la fin de la transcription du gène ASC1 chez la levure bourgeonnante. L’ARN marqué à la bromouridine triphosphate à partir du mutant de l’ARN 14-1 et de ses cellules isogéniques de type sauvage a été purifié et transcrit inversement avec les amorces C, D, E, F et G. L’ADNc correspondant a été amplifié par PCR à l’aide de paires d’amorces B et C, B et D, B et E, B et F, et B et G, et fractionné sur des gels d’agarose.

La présence de produits amplifiés par PCR à partir des paires d’amorces B et E, B et F, et B et G chez le mutant, reflète un phénotype de lecture de terminaison. Dans les cellules de type sauvage, cependant, l’exécution de la transcription sur le signal était limitée jusqu’à l’élément terminateur, et il n’y avait pas de transcription détectable sur le signal au-delà de la région du terminateur. Ce graphique montre la quantification des gels avec cinq ARN S comme contrôle de normalisation.

La détection de transcrits naissants initiés par le promoteur qui lisent le signal de terminaison dans les cellules mutantes mais pas dans les cellules de type sauvage confirme que l’ARN 14 est un facteur de terminaison. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que la transcription en réaction est essentielle pour obtenir un résultat réussi.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la recherche GRO peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le rôle d’un facteur de terminaison à l’échelle du génome. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la transcription pour explorer la terminaison par d’autres ARN polymérases dans la levure et les systèmes eucaryotes supérieurs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une transcription sur les réactions et de purifier les transcriptions marquées naissantes.

N’oubliez pas que l’ARN peut être extrêmement instable et que des précautions telles que le port de gants, le maintien d’une température d’environ quatre degrés Celsius et l’utilisation d’agents libres d’ARNASE doivent toujours être prises lors de cette procédure.