Analyse de particules à haute résolution à partir de microscopie à électrons à l'aide d'images utilisant SPHIRE

L’objectif général de cette procédure est de déterminer la structure de complexes macromoléculaires par analyse de particules uniques de données de cryo-microscopie électronique à l’aide du logiciel de traitement d’images SPHIRE. La cryo-EM à particule unique est en train de devenir une technologie courante pour étudier les structures des macromolécules à une résolution proche de l’atome. SPHIRE est un nouveau progiciel qui permet un traitement semi-automatisé des données cryo-EM de manière conviviale.

Le principal avantage de SPHIRE est le mécanisme de validation automatique. La plupart des procédures ne doivent être exécutées qu’une seule fois, et les résultats sont objectifs et reproductibles. La cryo-EM à haute résolution peut être utilisée pour placer des résidus individuels, fournissant ainsi des informations cruciales sur l’organisation et le fonctionnement de machines micromoléculaires complexes.

Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode doivent garder à l’esprit que l’obtention d’une structure à haute résolution dépend fortement de la qualité de l’échantillon et des données d’entrée. Pour commencer à utiliser l’application SPHIRE, ouvrez l’interface graphique à partir du terminal. Ouvrez les UTILITAIRES pour afficher une image de cryo-microscopie avec e2display.

Utilisez l’outil de mesure intégré pour mesurer l’axe de particule le plus long en angström par pixel. Ouvrez les paramètres du projet. Définissez la taille de la fenêtre CTF au moins sur la taille de la boîte de particules.

Réglez la taille de la boîte de particules sur un nombre pair, au moins 1 1/2 fois le diamètre de la particule. Réglez le rayon des particules sur au moins la moitié de la longueur mesurée. Entrez la symétrie du groupe de points, si elle est connue, et la masse moléculaire approximative.

Enregistrez les paramètres. Ensuite, dans le menu MOVIE, ouvrez l’alignement de la vidéo Micrograph. Définissez les chemins d’accès aux fichiers exécutables unblur et summovie.

Choisissez une vidéo de micrographie brute non alignée et remplacez la variable de nom de fichier par un caractère générique pour définir le modèle de chemin de la micrographie d’entrée. Nommez le répertoire de sortie. Indiquez le nombre d’images vidéo, la tension du microscope et l’exposition par image.

Exécutez le processus pour générer des micrographies moyennes pondérées et non pondérées et corrigées du mouvement. Ensuite, ouvrez le menu CTER et sélectionnez Estimation CTF. Définissez les micrographies non pondérées en tant qu’entrée.

Nommez le répertoire de sortie et renseignez les paramètres de collecte de données. Réglez la fréquence la plus basse sur 0285 angströms inverses et la fréquence la plus élevée sur 0,285 angströms inverses. Exécutez le processus pour générer une liste de paramètres CTF.

Ensuite, ouvrez le menu FENÊTRE et sélectionnez Prélèvement de particules. Définissez les micrographies pondérées en fonction de la dose comme entrée et démarrez l’utilitaire e2boxer. Effectuez le prélèvement de particules manuellement ou automatiquement.

Extrayez les particules sélectionnées dans des piles d’images et combinez-les en une seule pile d’images virtuelles dans une base de données BDB. Une fois les particules prélevées et empilées, ouvrez le menu ISAC et sélectionnez Clustering ISAC 2D. Définissez la pile d’images virtuelles dans la base de données BDB en tant qu’entrée.

Estimez le nombre d’images par classe, remplissez les paramètres restants et générez les moyennes des classes 2D. Une fois la classification 2D terminée, utilisez l’utilitaire Afficher les données pour afficher les moyennes de classe reproductibles validées.

Vérifiez que plusieurs orientations de particules sont représentées et que les moyennes des classes sont de qualité satisfaisante. Générez une nouvelle pile d’images virtuelles contenant uniquement des particules appartenant aux moyennes de classe validées. Ensuite, ouvrez le menu VIPER et utilisez l’utilitaire Afficher les données pour afficher les moyennes de la classe.

Supprimez les moyennes de classe de mauvaise qualité ou affichant des vues identiques de la particule. Enregistrez les moyennes de classe restantes dans un nouveau fichier. Ensuite, sélectionnez Modèle 3D initial RVIPER et utilisez la petite sélection de moyennes de classe comme entrée.

Exécutez la commande pour générer un premier modèle 3D reproductible de la protéine. Inspectez le modèle dans le programme de graphiques moléculaires Chimera. Comparez le modèle à une structure connue d’une protéine ou d’un domaine homologue de la protéine d’intérêt.

Revenez au menu VIPER dans SPHIRE et sélectionnez Créer une référence 3D. Générez un modèle de référence 3D initial avec la taille de pixel correcte et un masque 3D. Ouvrez le menu MÉRIDIEN et sélectionnez Raffinement 3D.

Remplissez la pile d’images d’entrée et les chemins d’accès initiaux des fichiers de référence 3D. Nommez le répertoire de sortie et définissez le masque du modèle de référence comme masque 3D. Sélectionnez Appliquer un masque 2D dur.

Réglez la résolution de départ entre 20 et 25 angströms et exécutez le raffinement 3D pour produire les demi-volumes non filtrés. Ensuite, visualisez en demi-volume non filtré dans Chimera. Déterminez un seuil de binarisation dans lequel toutes les densités de protéines sont connectées, mais pas les artefacts de bruit.

Revenez au menu MÉRIDIEN de SPHIRE et ouvrez Masque 3D adaptatif. Entrez le seuil d’entrée et de binarisation d’un demi-volume non filtré. Nommez le masque de sortie et exécutez le processus pour générer un masque 3D aux contours doux.

Ensuite, ouvrez Netteté et sélectionnez les deux demi-volumes non filtrés. Définissez le masque 3D à demi-volume à bords doux comme masque fourni par l’utilisateur. Exécutez le processus qui fusionne les demi-volumes, puis filtre et affine le volume fusionné.

Ouvrez le fichier journal pour afficher l’estimation de la résolution finale. Générez une carte 3D de la distribution angulaire des particules de la pile d’images d’entrée générée lors de l’affinement 3D. Ouvrez le modèle 3D affiné et filtré dans Chimera.

Inspectez la carte de densité et ses fonctionnalités haute résolution. Ouvrez la distribution angulaire dans Chimera et vérifiez que les angles d’Euler sont distribués isotropiquement. Ouvrez le menu SORT3D et sélectionnez Estimation de la variabilité 3D.

Générez une carte de variabilité 3D à partir de la pile virtuelle d’images de particules appartenant aux moyennes de classe validées. Générez un masque 3D binarisé à partir de cette carte de variabilité pour le clustering 3D ciblé suivant. Ensuite, ouvrez le RSORT3D Clustering 3D et sélectionnez le répertoire de l’affinement 3D précédent comme entrée.

Nommez le répertoire de sortie et définissez les masques 3D globaux et ciblés. Utilisez au moins 5 000 à 10 000 images par groupe pour les grands ensembles de données. Exécutez le processus de tri pour générer des volumes de chaque groupe 3D homogène.

Utilisez Chimera pour identifier la structure avec la résolution apparente la plus élevée. Revenez au menu SORT3D dans SPHIRE et ouvrez Local Subset Refinement. Définissez le chemin d’accès du fichier texte du sous-ensemble sur le fichier de cluster d’ID de particules correspondant à la structure de résolution la plus élevée.

Définissez le répertoire de raffinement 3D sur le répertoire contenant les demi-volumes non filtrés et l’itération de redémarrage sur l’itération de résolution la plus élevée de l’affinement 3D précédent. Exécutez la commande pour générer des demi-volumes locaux non filtrés. Ensuite, créez un masque 3D aux contours adoucis à partir de l’un des demi-volumes locaux.

Fusionnez les demi-volumes locaux et affinez le volume fusionné sans appliquer de filtre passe-bas. Ensuite, ouvrez le menu LOCALRES et cliquez sur Résolution locale. Sélectionnez les demi-volumes locaux.

Ensuite, sélectionnez le masque local à contours adoucis. Définissez la résolution globale sur la résolution absolue estimée lors de l’affûtage du volume local fusionné. Calculez la résolution locale du volume.

Ensuite, ouvrez le filtre local 3D. Réglez le volume local non filtré aiguisé comme entrée. Sélectionnez la carte de résolution locale et le masque 3D à contours adoucis.

Appliquez le filtre de résolution locale au volume affûté pour produire le modèle 3D final. Ouvrez la carte de volume et de résolution locale résultante dans Chimera. Démarrez l’outil Couleur de surface, puis choisissez le volume dans le menu et l’option permettant de colorer la surface en fonction de la résolution locale.

Le complexe toxine TcdA1 a été imagé par cryomicroscopie. Toutes les images ont montré des particules uniques clairement discernables et des anneaux de Thon s’étendant à une résolution supérieure à quatre angströms dans le spectre de puissance. Les particules ont été sélectionnées à l’aide d’e2boxer, puis extraites dans une pile d’images.

Les moyennes de classe bidimensionnelles ont été générées par l’alignement et le clustering stables itératifs, ou ISAC. Ces moyennes de classe ont été utilisées pour calculer un modèle 3D reproductible avec RVIPER. Ce modèle s’accordait bien avec la structure cristalline précédemment résolue de TcdA1.

raffinement 3D automatique de ce modèle à l’aide de MERIDIEN a généré une résolution quasi atomique map. 3D l’analyse de la variabilité a indiqué une flexibilité localisée de la région terminale N marquée à l’histidine, des domaines de liaison au récepteur et du domaine de liaison au TcB. Des calculs de résolution locale ont été effectués.

Le modèle affiné a été filtré localement et une échelle de couleurs correspondant à la résolution locale a été appliquée, montrant la concordance topologique entre les zones de grande variabilité et les zones de faible résolution. La structure cryo-EM finale de 3,5 angströms de TcdA1 a montré des densités claires pour la plupart des chaînes latérales. Une carte de densité avec ce niveau de détail peut être utilisée pour la construction de modèles atomiques de novo.

En utilisant cette approche, une structure de résolution proche de l’atome peut être obtenue en quelques heures ou quelques jours, sans information structurelle a priori. Lors de cette procédure, n’utilisez que des données de haute qualité et vérifiez les résultats intermédiaires. L’hétérogénéité de la composition et de la structure de l’échantillon cryo-EM pourrait être un facteur limitant pour atteindre une résolution proche de l’atome.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser SPHIRE pour la détermination structurelle cryo-EM. Comme vous l’avez vu, les routines de clustering incluses dans SPHIRE vous permettront non seulement de résoudre la structure de la protéine d’intérêt, mais aussi d’étudier la dynamique conformationnelle et de fournir des informations mécanistes cruciales sur les mécanismes moléculaires complexes.