Analyse de particules à haute résolution à partir de microscopie à électrons à l'aide d'images utilisant SPHIRE

L'objectif général de cette procédure est de déterminer la structure de complexes macromoléculaires par analyse de particules uniques à partir de données de microscopie électronique cryogénique, en utilisant le logiciel de traitement d'images SPHIRE. L'analyse de particules uniques en cryo-ME devient une technologie courante pour l'étude des structures macromoléculaires à une résolution proche de l'échelle atomique. SPHIRE est un nouveau logiciel qui permet un traitement semi-automatisé des données de cryo-ME de manière conviviale.

Le principal avantage de SPHIRE réside dans son mécanisme de validation automatique. La plupart des procédures doivent être exécutées une seule fois, et les résultats sont objectifs et reproductibles. La cryo-microscopie électronique à haute résolution peut être utilisée pour positionner des résidus individuels, offrant ainsi un aperçu essentiel de l'organisation et de la fonction de complexes macromoléculaires.

Les personnes novices avec cette méthode doivent garder à l'esprit que l'obtention d'une structure à haute résolution dépend fortement de la qualité de l'échantillon et des données d'entrée. Pour commencer à utiliser l'application SPHIRE, ouvrez l'interface graphique depuis le terminal. Ouvrez les UTILITAIRES pour afficher une image de microscopie cryo-électronique avec e2display.

Utilisez l'outil de mesure intégré pour mesurer l'axe le plus long de la particule en angströms par pixel. Ouvrez les paramètres du projet. Réglez la taille de la fenêtre de la fonction de transfert de contraste (CTF) à au moins la taille de la boîte de la particule.

Définissez la taille de la boîte des particules comme un nombre pair, d’au moins 1 1/2 fois le diamètre des particules. Réglez le rayon des particules à au moins la moitié de la longueur mesurée. Saisissez le groupe ponctuel de symétrie, s’il est connu, ainsi que la masse moléculaire approximative.

Enregistrez les paramètres. Ensuite, dans le menu MOVIE, ouvrez l'alignement des films de micrographie. Définissez les chemins d'accès aux fichiers exécutables unblur et summovie.

Choisissez un film de micrographie brute non aligné et remplacez la variable du nom de fichier par un caractère générique pour définir le modèle de chemin des micrographies d'entrée. Nommez le répertoire de sortie. Saisissez le nombre de trames du film, la tension du microscope et l'exposition par trame.

Exécutez le processus pour générer les micrographies moyennes corrigées de mouvement pondérées et non pondérées par la dose. Ensuite, ouvrez le menu CTER et sélectionnez l'estimation de la CTF. Définissez les micrographies non pondérées par la dose comme entrée.

Nommez le répertoire de sortie et renseignez les paramètres de collecte des données. Réglez la fréquence la plus basse à 0285 angstroms inverses et la fréquence la plus élevée à 0,285 angstroms inverses. Exécutez le processus pour générer une liste de paramètres CTF.

Ensuite, ouvrez le menu FENÊTRE et sélectionnez le choix de particules. Définissez les micrographies pondérées par la dose comme entrée, puis lancez l'utilitaire e2boxer. Effectuez le choix des particules manuellement ou automatiquement.

Extraire les particules sélectionnées sous forme de piles d'images, puis combiner ces piles en une seule pile d'images virtuelle dans une base de données BDB. Une fois les particules sélectionnées et empilées, ouvrez le menu ISAC et sélectionnez le regroupement 2D ISAC. Définissez la pile d'images virtuelle dans la base de données BDB comme entrée.

Estimez le nombre d'images par classe. Remplissez les paramètres restants et générez les moyennes 2D par classe. Une fois la classification 2D terminée, utilisez l'utilitaire Affichage des données pour visualiser les moyennes de classe validées et reproductibles.

Vérifiez que plusieurs orientations des particules sont représentées et que les moyennes de classes sont de qualité satisfaisante. Générez une nouvelle pile d'images virtuelles contenant uniquement les particules appartenant aux moyennes de classes validées. Ensuite, ouvrez le menu VIPER et utilisez l'utilitaire Afficher les données pour visualiser les moyennes de classes.

Supprimez les moyennes de classe de mauvaise qualité ou présentant des vues identiques de la particule. Enregistrez les moyennes de classe restantes dans un nouveau fichier. Ensuite, sélectionnez le modèle 3D initial RVIPER et utilisez le petit ensemble de moyennes de classe comme entrée.

Exécutez la commande pour générer un modèle 3D initial reproductible de la protéine. Examinez le modèle dans le programme de représentation moléculaire Chimera. Comparez le modèle à une structure connue d'une protéine ou d'un domaine homologue de la protéine d'intérêt.

Revenez au menu VIPER dans SPHIRE, puis sélectionnez Créer une référence 3D. Générez un modèle de référence 3D initial avec la taille de pixel correcte et un masque 3D. Ouvrez le menu MERIDIEN, puis sélectionnez l'affinement 3D.

Remplissez les chemins d'accès de la pile d'images d'entrée et du fichier de référence 3D initial. Nommez le répertoire de sortie et définissez le masque du modèle de référence comme masque 3D. Sélectionnez Appliquer un masque 2D rigide.

Régler la résolution initiale entre 20 et 25 angströms, puis effectuer le raffinement 3D afin de produire les demi-volumes non filtrés. Ensuite, visualiser un demi-volume non filtré dans Chimera. Déterminer un seuil de binarisation pour lequel toutes les densités protéiques sont connectées, mais les artefacts de bruit ne le sont pas.

Retournez au menu MERIDIEN de SPHIRE et ouvrez le masque 3D adaptatif. Saisissez le volume demi-partiel non filtré en entrée ainsi que le seuil de binarisation. Nommez le masque de sortie, puis exécutez le processus pour générer un masque 3D à bords doux.

Ensuite, ouvrez l'affinage et sélectionnez les deux demi-volumes non filtrés. Définissez le masque 3D à bords doux du demi-volume comme masque fourni par l'utilisateur. Exécutez le processus qui fusionne les demi-volumes, puis filtre et affine le volume fusionné.

Ouvrez le fichier journal pour visualiser l'estimation finale de la résolution. Générez une carte 3D de la distribution angulaire des particules de la pile d'images d'entrée produite lors du raffinement 3D. Ouvrez le modèle 3D renforcé et filtré dans Chimera.

Examinez la carte de densité et ses caractéristiques à haute résolution. Ouvrez la distribution angulaire dans Chimera, puis vérifiez que les angles d'Euler sont distribués de manière isotrope. Ouvrez le menu SORT3D et sélectionnez l'estimation de la variabilité 3D.

Générez une carte de variabilité 3D à partir de la pile virtuelle d'images de particules appartenant aux moyennes de classe validées. Générez un masque 3D binarisé à partir de cette carte de variabilité pour le regroupement 3D ciblé ultérieur. Ensuite, ouvrez 3D Clustering RSORT3D et sélectionnez le répertoire du raffinement 3D précédent comme entrée.

Nommez le répertoire de sortie et définissez les masques 3D global et ciblé. Utilisez au moins 5 000 à 10 000 images par groupe pour les jeux de données volumineux. Exécutez le processus de tri pour générer les volumes de chaque groupe 3D homogène.

Utilisez Chimera pour identifier la structure présentant la résolution apparente la plus élevée. Revenez au menu SORT3D dans SPHIRE et ouvrez le raffinement local du sous-ensemble. Définissez le chemin du fichier texte du sous-ensemble sur le fichier d'identifiants de particules correspondant à la structure de résolution la plus élevée.

Définir le répertoire de raffinement 3D comme étant le répertoire contenant les demi-volumes non filtrés et l'itération de redémarrage comme étant l'itération de résolution la plus élevée du raffinement 3D précédent. Exécuter la commande pour générer les demi-volumes non filtrés locaux. Ensuite, créer un masque 3D à bords doux à partir de l'un des demi-volumes locaux.

Fusionnez les demi-volumes locaux et affinez le volume fusionné sans appliquer de filtre passe-bas. Ensuite, ouvrez le menu LOCALRES et cliquez sur Résolution locale. Sélectionnez les demi-volumes locaux.

Ensuite, sélectionnez le masque local à bords doux. Réglez la résolution globale sur la résolution absolue estimée lors de l'affinement du volume local fusionné. Calculez la résolution locale du volume.

Ensuite, ouvrez le filtre local 3D. Définissez le volume local non filtré renforcé comme entrée. Sélectionnez la carte de résolution locale et le masque 3D à bords adoucis.

Appliquer le filtre de résolution locale au volume amélioré afin d'obtenir le modèle 3D final. Ouvrir le volume résultant et la carte de résolution locale dans Chimera. Démarrer l'outil Coloration de surface, puis sélectionner le volume dans le menu et l'option permettant de colorer la surface selon la résolution locale.

Le complexe toxique TcdA1 a été visualisé par microscopie cryo-électronique. Toutes les images montraient des particules individuelles clairement discernables et des anneaux de Thon s'étendant jusqu'à une résolution meilleure que quatre angströms dans le spectre de puissance. Les particules ont été sélectionnées à l'aide de e2boxer, puis extraites sous forme de pile d'images.

Des moyennes de classes bidimensionnelles ont été générées par un alignement et un regroupement stables itératifs, ou ISAC. Ces moyennes de classes ont été utilisées pour calculer un modèle tridimensionnel reproductible avec RVIPER. Ce modèle était en bon accord avec la structure cristalline précédemment déterminée de TcdA1.

Un raffinement 3D automatique de ce modèle à l'aide de MERIDIEN a produit une carte de résolution quasi-atomique. Une analyse de la variabilité 3D a révélé une flexibilité localisée de la région N-terminale marquée par une étiquette d'histidine, des domaines de liaison au récepteur et du domaine de liaison à TcB. Des calculs de résolution locale ont été effectués.

Le modèle affiné a été filtré localement et une échelle de couleurs correspondant à la résolution locale a été appliquée, mettant en évidence un accord topologique entre les zones de forte variabilité et les zones de faible résolution. La structure finale de cryo-ME de TcdA1, avec une résolution de 3,5 angströms, présentait des densités claires pour la majorité des chaînes latérales. Une carte de densité présentant un tel niveau de détail peut être utilisée ultérieurement pour la construction de novo d’un modèle atomique.

Grâce à cette approche, une structure de résolution quasi atomique peut être obtenue en quelques heures ou jours, sans information structurale a priori. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, utilisez uniquement des données de haute qualité et vérifiez les résultats intermédiaires. L'hétérogénéité compositionnelle et structurale de l'échantillon de microscopie électronique cryogénique pourrait constituer un facteur limitant pour atteindre une résolution quasi atomique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez désormais bien comprendre comment utiliser SPHIRE pour la détermination de structures par cryo-ME. Comme vous l'avez vu, les routines de regroupement incluses dans SPHIRE vous permettront non seulement de résoudre la structure de la protéine d'intérêt, mais aussi d'étudier la dynamique conformationnelle et d'obtenir des informations mécanistiques cruciales sur des mécanismes moléculaires complexes.