Name: Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer lefficacité des médicaments contre Macrophage repiquées Mycobacterium tuberculosis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Découvrez un test de sensibilité aux médicaments contre Mycobacterium tuberculosis utilisant des agrégats de macrophages infectés en plaque 96 puits. Cette méthode simple, peu coûteuse et compatible BSL-2 améliore le développement précoce de médicaments antituberculeux.

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Nous remercions le Dr Frank Wolschendorf pour l’accès au lecteur de plaques d’imagerie automatisé Cytation 3. Ce travail a été financé en partie par la subvention R01-AI104499 du NIH à OK. Une partie du travail a été réalisée dans les installations de l’UAB CFAR et par le Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, qui sont financés par le NIH/NIAID P30 AI027767 et par le NIH 5P30 AR048311.

NOTE: Comme M. tuberculosis mc 2 6206 est une souche avirulente 17, 18, tous les travaux dans ce protocole peut être effectué dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). 1. Conditions de culture pour Green Fluorescent Protein Exprimer M. tuberculosis mc 2 6206 (Vtt GFP) NOTE: Le M. tuberculosis H37Rv dérivé auxotrophe souche mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) transformée avec le plasmide exprimant la GFP pMN437 est utilisé dans ce protocole 16. Il est possible de remplacer la souche Vtt GFP avec gfp non exprimant souche de type sauvage pour permettre un accès plus facile de la souche pour les chercheurs. Cependant, l&#39; expression gfp est souhaitable pour permettre une confirmation visuelle de la phagocytose et la formation d&#39;agrégats Mtb / macrophage. Pour LONg stockage à long terme, Vtt GFP ont été congelés à -80 ° C dans 7H9 milieux complets (décrits à l&#39; étape 1.1) additionné de 20% de glycérol. <ol><li> Préparer toutes les supports Vtt GFP (7H9-C) en la complétant 7H9 milieu avec 10% de Middlebrook OADC, 0,02% tyloxapol, / mL acide D-pantothénique de 24 pg, 50 pg / ml de L-leucine et 50 pg / ml d&#39; hygromycine B. </li><li> Décongelez un flacon de Vtt GFP et ajouter 10 ml de 7H9-C dans un carré ballon à fond de PETG 30 ml. </li><li> Incuber à 37 ° C sur un agitateur rotatif (50 rpm). Prendre des mesures de densité optique (DO 600) tous les quelques jours jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne 1,0 (environ 5-8 jours). </li><li> Diluer la culture et de passage au besoin pour maintenir une DO600 entre 0,2-1,0. </li><li> Pour l&#39; infection, en utilisant une culture établie de Mtb GFP au sein de la phase de croissance logarithmique (DO 600 de 0,6 à 1). Pour éviter les cultures grumeaux, sonication la culture flacon Vtt dans un bain d&#39;eau (130 W; 3 impulsions s x 5) once ou deux fois par semaine </li></ol> 2. Conditions de culture pour Les cellules THP-1 <ol><li> Préparer toutes les cellules THP-1 milieu cellulaire (RPMI-C) en complétant le milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de fœtus bovin, 2 mM de L-glutamine et 10 mM de HEPES. </li><li> Incuber les cellules dans un flacon T-75 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre ou cytométrie en flux tous les deux jours et maintenir les cellules THP-1 à une densité comprise entre 0,1 à 0600000 par mL. </li></ol> 3. Protocole d&#39;infection pour générer Vtt / macrophage Aggregate Structures <ol><li> THP-1 préparation de cellules (par plaque de 96 puits) <ol><li> Centrifuger de 7 x 10 6 cellules THP-1 à 250 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 7 ml de RPMI-C. </li></ol></li><li> Préparation Vtt GFP <ol><li> Centrifugeuse 2,8 x 10 8 Vtt GFP à 3.200 xg pendant 5 min dans une centrifugeuse oscillant seau uchanter une conversion de 600 OD 1.0 = 3 x 10 8 bactéries / ml. </li><li> Laver une fois avec du RPMI-C et centrifuger comme à l&#39;étape 3.2.1. </li><li> Remettre en suspension dans 7 ml de RPMI-C et vortex pendant 10 s. </li></ol></li><li> Infection REMARQUE: Voir la Figure 1 pour le modèle. <ol><li> Préparer une plaque à 96 puits en ajoutant 200 pi d&#39;eau stérile dans les rangées A et H, et les colonnes 1 et 12 pour un rebord d&#39;eau pour empêcher l&#39;évaporation du milieu de culture. </li><li> Ajouter 200 ul de RPMI-C à la colonne 2 (B2 à G2) pour le contrôle d&#39;arrière-plan (vierge). </li><li> Pour infecter, ajouter Vtt GFP suspension (étape 3.2) THP-1 suspension de cellules (étape 3.1) et bien mélanger par pipetage. La densité finale de cellules THP-1 est de 5 x 10 5 par ml et la multiplicité correspondante de l&#39; infection est de 40. </li><li> Verser le / Vtt GFP suspension dans un réservoir de 25 ml THP-1. </li><li> Ajouter 200 pi de THP-1 / Vtt GFP suspension à tous les 96 puits restants (B3 à G11) usinga multi-canal pipette. NOTE: Si vous travaillez avec des plaques multiples à 96 puits, resuspendre régulièrement le THP-1 / Vtt suspension restante dans le réservoir pour assurer un mélange homogène est ajouté à chaque puits. </li><li> Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 7-10 jours. </li><li> Changer les médias tous les 2 jours en retirant lentement 100 uL passé médias de la partie supérieure de chaque puits et doucement en ajoutant 100 pi de pré-chauffé RPMI-C à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canal. Ne pas remettre en suspension des puits et de perturber les agrégats Vtt / macrophage sur le fond des puits. </li><li> Examiner visuellement les puits par microscopie à fluorescence (objectif 4-10X) par jour, en prenant note de la taille des agrégats Mtb / macrophage. Par jour 7-10, Mtb agrégats / macrophage devraient être suffisamment grande (voir figure 2 pour référence) de procéder pour les tests l&#39; efficacité des médicaments (section 4). </li><li> Si on le désire, de capturer des images des 96 puits en utilisant un système d&#39;imagerie de cellules automatique montéesavec le champ lumineux et filtre GFP fixe pour documenter Vtt / formation d&#39; agrégats macrophage. NOTE: Si les utilisateurs ne pas avoir accès à un système d&#39;imagerie automatisée, des images de puits représentatifs peuvent être prises à l&#39;aide tout microscope approprié avec la GFP et sur le terrain lumineux capacités. </li></ol></li></ol> 4. inhibition de la croissance de dosage pour évaluer l&#39; efficacité des médicaments contre Vtt Dérivé de Mtb / macrophage Granulats <ol><li> Préparation des médicaments (conditions triple pour deux médicaments) REMARQUE: Voir la figure 1A pour modèle. <ol><li> Dans une plaque de 96 puits séparé, ajouter 125 ul de médias 7H9-C à B2 jusqu&#39;à G10. </li><li> Préparer deux médicaments au double de la concentration finale la plus élevée souhaitée dans 1 ml de 7H9-C pour tenir compte de la dilution dans l&#39;étape 4.2.4. </li><li> Ajouter 250 ul de chaque médicament à des puits B11-C11-D11 et E11-F11-G11, respectivement pour les traitements en triple. </li><li> En utilisant une pipette multi-canal, en série dilute les médicaments d&#39;essai deux fois en déplaçant 125 pi de B11-G11 dans B10-G10. Mélanger par pipetage 5 fois à chaque étape. </li><li> Continuez à déplacer 125 pi de colonne en colonne (droite à gauche) à travers la plaque, et arrêter après la colonne 4. </li><li> Après mélange colonne 4, jeter 125 ul dans un conteneur de déchets. Les colonnes 2 et 3 ne doivent pas contenir de médicaments pour permettre une utilisation comme fond (blanc) et les contrôles de croissance positifs. REMARQUE: Vous pouvez également suivre modèle dans la figure 1B pour les bibliothèques des tests de drogue. Chaque plaque de 96 puits peut accueillir 58 médicaments à une seule concentration. Préparer cette plaque de médicament à l&#39;aide du double de la concentration finale souhaitée car elle sera diluée dans la moitié à l&#39;étape 4.2.4. </li></ol></li><li> Traitement médical: <ol><li> Récupérer la plaque de 96 puits contenant le Vtt macrophages infectés par l (agrégats Vtt / macrophages). </li><li> Décanter avec soin tous les puits concernés (B2 par G11) avec une pipette multi-canal.Effectuez cette manière en deux étapes: d&#39;abord supprimer 150 pi sans incliner la plaque, puis retirez les médias restants (~ 50 pi) en inclinant la plaque et l&#39;insertion de la pointe de la pipette sur le bord inférieur du puits. En ce Mtb / macrophage agrégats sont adhérentes au fond du puits, aucun matériau ne soit perdu. </li><li> Ajouter délicatement 100 pi de 7H9-C médias à tous les puits pertinents (B2 par G11) de la plaque contenant les agrégats / macrophage Mtb. </li><li> En utilisant une pipette à canaux multiples, transférer 100 ul du médicament contenant plaque à 96 puits (étape 4.1) dans les puits correspondants de la plaque d&#39;infection. </li><li> Placer dans un sac scellé et incuber pendant 3 jours à 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Quantification de l&#39;efficacité des médicaments en utilisant le test résazurine microplaque <ol><li> Préparer la résazurine solution mère à une concentration finale de 0,8 mg / ml dans H 2 O. Filtre 0,22 um pores membrane taille de PVDF pour la stérilisation.</li><li> Préparer la résazurine solution de travail en mélangeant la résazurine solution mère, H 2 O et du Tween-80 (solution à 20% en H 2 O) dans un rapport de 2: 1: 1. Les concentrations finales sont de 0,4 mg / mL résazurine et 5% de Tween-80. </li><li> En utilisant un lecteur de plaque, mettre en place un programme pour lire la fluorescence à 530 nm excitation et 590 nm émission toutes les 30 minutes pendant 24 heures à 37 ° C. lecteur de plaque pré-chaude à 37 ° C. </li><li> Ajouter 20 ul de solution de travail de la résazurine dans tous les puits appropriés (B2 à G11) de la plaque de médicament traitée (étape 4.11) à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li><li> Placer la plaque sur le lecteur de plaque et démarrer le programme mis en place à l&#39;étape 5.3. NOTE: Pour faciliter le traitement des volumes élevés de plaques d&#39;essai, il est suffisant pour développer le dosage dans un incubateur à 37 ° et effectuer fluorescence unique lit toutes les 24 h. Ceci est également applicable aux utilisateurs qui ne disposent pas de l&#39;accès à un lecteur de plaque avec des capacités cinétiques et d&#39;incubation. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit en détail un modèle d&#39;infection Vtt alternative appropriée pour les tests l&#39; efficacité des médicaments. Ce modèle prend en compte deux facteurs clés qui devraient être donnés plus de considération au cours du processus de développement de médicaments antituberculeux précoce: la présence d&#39;obstacles physiologiquement pertinents à la pénétration du médicament et des changements métaboliques de Vtt lors de l&#39; infection. Alors que nous avons précédemment montré les a...

<html> La tuberculose (TB) reste une menace pour la santé mondiale sérieuse malgré la disponibilité de traitements de chimiothérapie anti-tuberculose depuis plus de 40 ans 1. Cela est dû en partie à l&#39;exigence pour des périodes de plus de 6 mois de traitement longs en utilisant de multiples combinaisons de médicaments, ce qui conduit à des patients non-conformité 2. L&#39;émergence de la tuberculose résistante aux médicaments au cours des dernières années a encore aggravé les problèmes dans un domaine où un développement réussi des médicaments cliniquement approuvés est pratiquement inexistante 3. En effet, en dépit de l&#39; anti-développement des antituberculeux exhaustive, un seul médicament a été approuvé par la FDA pour une utilisation clinique au cours des 40 dernières années 4. Ainsi, de nouvelles générations de médicaments anti-tuberculeux sont nécessaires de toute urgence pour remédier à ce problème. Un problème clé dans la découverte de médicaments antituberculeux est le manque de succès du transfert à partir de composés ayant une activité in vitro à l&#39; efficacité dans le cadre clinique= &quot;référence externe&quot;&gt; 5, 6, 7. Initialement, les approches cibles basées ont été utilisés pour le dépistage de médicaments anti - Mtb 5, qui a échoué à traduire dans des cellules bactériennes entières. Même lorsque les cellules sont utilisées Mtb, elle est souvent réalisée en utilisant le bouillon cultivé des cultures, qui ne permettent pas de prédire avec précision l&#39; efficacité du médicament in vivo , 8, 9. Ces problèmes ont été reconnus et des essais de criblage de médicaments contre les macrophages contenant Vtt ou Mtb latente ont été établis avec succès 8, 10, 11, 12. Toutefois, même ces tests plus avancés ne donnent pas suffisamment compte des barrières de pénétration que les médicaments rencontrent dans les lésions pulmonaires non-vascularisées, et dans les foyers nécrotiques sur le site de l&#39;infection. Effectivement, Même pour la première ligne de médicaments antituberculeux rifampicine, le dosage sous-optimal a été remise en question en raison de l&#39; insuffisance dans les tissus in vivo et cérébral liquide céphalo - rachidien (LCR) pénétration 13, 14, 15 ainsi qu&#39;une diminution de l&#39; efficacité contre intracellulaire Vtt 8, 9. En tant que tel, de nouveaux modèles et des analyses qui prennent en compte ces paramètres au cours du processus de développement avance rapide sans aucun doute améliorer la tuberculose des efforts de découverte de médicaments. Pour répondre à ce besoin, nous avons récemment mis sur pied un bon marché, rapide et BSL-2 modèle d&#39;infection de remplacement compatible pour les tests d&#39;efficacité des médicaments Vtt 16. Ce modèle d&#39;infection produit dense Vtt au sein de grandes structures globales macrophage, qui récapitulait les barrières de pénétration cellulaire physiologiquement pertinents et généré repiquées macrophage <em&gt; Vtt avec un état physiologique modifié ressemblant Mtb latente. Vtt dérivée de ce modèle d&#39;infection a été combiné avec le dosage résazurine de microtitrage (REMA) pour évaluer l&#39; efficacité du médicament, ce qui a produit des résultats cohérents avec d&#39; autres modèles d&#39;infection intracellulaire et une bonne corrélation avec la capacité déclarée de médicaments courants TB pour atteindre des concentrations élevées de CSF par rapport à des concentrations sériques 16. Ici , nous décrivons en détail la génération de Mtb / structures globales macrophage pour produire macrophage-repiquées Vtt approprié pour les tests de sensibilité aux médicaments en utilisant REMA. En particulier, nous montrons comment ce système d&#39;infection pourrait être adapté à un format de 96 puits pour la compatibilité avec le criblage à des candidats médicaments anti-TB.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Suivre les recommandations du fabricant</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Préparer une solution mère à 20 % dans un filtre H2O ; stériliser le</td></tr><tr><td>sel hémicalcique d’acide D-pantothénique</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Préparer une solution mère à 24 mg/mL dans un filtre H2O ; filtre stériliser</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Préparer une solution mère de 50 mg/mL dans un filtre H2O ; stériliser</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Préparer une solution mère de 200 mg/mL dans H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Flacon de média PETG carré</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 média</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 lecteur de plaques</td><td>Biotek</td><td></td><td>Interchangeable avec n’importe quel lecteur de plaques fluorescentes et microscope</td></tr><tr><td>Gen5 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Enregistrement et analyse de rézasurine coversion</td></tr><tr><td>rifampicine&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Préparer une solution mère de 10 mg/mL dans H2O</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de moxifloxacine</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Préparer une solution mère de 10 mg/mL dans H2O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Préparer 800 &mu ; g/mL de solution mère dans H2O ; stérilisation par filtre</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Préparer une solution mère à 20 % dans une stérilisation par filtre H2O</td></tr></tbody></table>

un haut-débit assay compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre macrophage repiquées<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Le processus précoce de développement de médicaments antituberculeux est entravé par l’inefficacité de la traduction des composés ayant une activité in vitro en efficacité dans le cadre clinique. Cela est probablement dû à un manque de considération pour les barrières de pénétration cellulaire physiologiquement pertinentes qui existent chez l’hôte infecté. Nous avons récemment établi un modèle d’infection alternatif qui génère de grandes structures d’agrégats de macrophages contenant en son cœur M. tuberculosis (Mtb) densément tassé, ce qui convenait aux tests de sensibilité aux médicaments. Ce modèle d’infection est peu coûteux, rapide et, surtout, compatible BSL-2. Ici, nous décrivons les procédures expérimentales pour générer des structures d’agrégats Mtb/macrophages qui produiraient des Mtb passés par les macrophages pour les tests de sensibilité aux médicaments. En particulier, nous démontrons comment ce système d’infection pourrait être directement adapté au format de plaque à 96 puits montrant une capacité de débit pour le criblage de banques de composés contre Mtb. Dans l’ensemble, ce test est un ajout précieux à la boîte à outils de découverte de médicaments Mtb actuellement disponible en raison de sa simplicité, de sa rentabilité et de son évolutivité.

Pour confirmer la robustesse de l&#39; adaptation de ce modèle d&#39;infection à 96 puits format de plaque, nous avons ici examiné la sensibilité aux médicaments de Vtt dérivé de notre 96 puits adapté modèle d&#39;infection à la rifampicine (RIF) et moxifloxacine (Moxi) selon le modèle donné dans la figure 1A. Nous démontrons que la génération de Mtb / structures agrégées macrophage clés pour ce dosage peut être produit de manière fiable dans un format ...

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

L'objectif général de cette procédure est de générer de manière reproductible des structures d'agrégats de macrophages infectés par Mycobacterium tuberculosis dans un format de plaque de 96 puits pour des tests de sensibilité aux médicaments à l'aide d'un colorant de viabilité. Cette méthode peut améliorer le processus précoce de développement de médicaments pour les composés anti-tuberculose, qui est entravé par la traduction infructueuse des composés candidats dans un contexte clinique. Le principal avantage de ce modèle d'infection simple, peu coûteux et compatible avec le niveau de sécurité biologique 2 réside dans sa capacité à reproduire des barrières physiologiquement pertinentes à la pénétration cellulaire, rappelant les granulomes de la tuberculose.Ceci produit des résultats de sensibilité aux médicaments plus prédictifs de l'efficacité in vivo. Commencez cette procédure en préparant la souche de M.tuberculosis MC² 6206 exprimant la protéine fluorescente verte, appelée par la suite MTBGFP, pour l'infection. Gardez à l'esprit qu'il s'agit d'une souche atténuée, donc tous les travaux décrits dans ce protocole peuvent être réalisés dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2.Pour chaque plaque de 96 puits à préparer, centrifuger 2,8 × 10⁸ MTBGFP à 3 200 × g pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à godets oscillants. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et ajouter cinq millilitres de RPMIC pour laver les bactéries. Pippeter plusieurs fois de haut en bas pour resuspendre les cellules.Ensuite, centrifuger à nouveau. Après la deuxième centrifugation, décanter le surnageant et resuspendre les cellules bactériennes dans sept millilitres de RPMIC, puis vortexer pendant 10 secondes. Ensuite, pour chaque plaque de 96 puits à préparer, centrifuger sept fois dix puissance six cellules monocytaires humaines THP1 à 250 ×g pendant cinq minutes.Après la centrifugation, versez délicatement le surnageant et resuspendez les cellules THP1 dans sept millilitres de RPMIC. Préparez ensuite une plaque de 96 puits pour l'infestation en ajoutant 200 microlitres d'eau stérile dans les puits des lignes A et H et des colonnes 1 et 12. Ce bord d'eau empêchera l'évaporation du milieu de culture.Ajoutez 200 microlitres de RPMIC dans la colonne deux, de B deux à G deux, pour le témoin de fond ou blanc. Pour infecter les monocytes THP1, utilisez une pipette pour transférer toute la suspension bactérienne MTBGFP préparée dans la suspension de cellules THP1 et mélangez en pipetant par aspiration et expulsion. La densité finale des cellules THP1 est de cinq fois 10 à la puissance cinq par millilitre et le rapport de multiplicité d'infection correspondant est de 40.Ensuite, versez la suspension de THP1 MTBGFP dans un réservoir de 25 millilitres, puis, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 200 microlitres de suspension de THP1 MTBGFP dans les 96 puits restants, de E3 à G11. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius, avec 5 %CO2, pendant sept à dix jours. Tous les deux jours pendant l’incubation, utilisez une pipette multicanal pour changer le milieu en retirant lentement 100 microlitres de milieu usé depuis le haut de chaque puits et en ajoutant délicatement 100 microlitres de RPMIC préalablement réchauffé.Lors du changement du milieu, il est important de faire attention à ne pas perturber les agrégats de macrophages MTB au fond des puits. Examinez visuellement les puits chaque jour à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de jeux de filtres en champ clair et pour la GFP, avec un objectif de 4 à 10 X. Notez la taille des agrégats de macrophages MTB et capturez des images si souhaité.À partir du jour sept à dix, les agrégats de macrophages MTB devraient être suffisamment développés pour procéder aux tests d'efficacité des médicaments, comme décrit ultérieurement dans la vidéo. Pour les tests médicamenteux, préparez deux médicaments antituberculeux en triplets sur une nouvelle plaque de 96 puits comme suit. Ajoutez d'abord 125 microlitres de milieu 7H9C dans les puits B2 à G10.Préparez ensuite les deux médicaments à deux fois la concentration finale souhaitée la plus élevée, dans un millilitre de 7H9C. À l’aide d’une pipette, ajoutez 250 microlitres de chaque médicament dans les puits B, C et D 11, puis dans les puits E, F et G 11 respectivement, pour les traitements en triplets. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, effectuez une dilution sérielle deux fois par deux des médicaments en cours de test en transférant 125 microlitres du puit B 11 au G 11 vers les puits B 10 à G 10.Mélanger en pipettant cinq fois à chaque étape. Continuer à transférer 125 microlitres d'une colonne à l'autre de droite à gauche à travers la plaque, et s'arrêter après la colonne quatre. Après avoir mélangé la colonne quatre, jeter 125 microlitres dans un contenant de déchets.Les colonnes deux et trois ne doivent contenir aucun médicament. Cela permettra de les utiliser comme fonds et comme témoins positifs de croissance. Ensuite, récupérez la plaque 96 puits contenant les macrophages infectés par le MTB à partir de l'incubateur.Sans incliner la plaque, utilisez une pipette multicanal pour prélever 150 microlitres de milieu des puits B deux à G 11. Ensuite, inclinez la plaque comme indiqué ici, insérez les embouts de pipette le long du bord inférieur des puits et retirez le milieu restant, soit environ 50 microlitres. Étant donné que les agrégats de macrophages MTB adhèrent au fond des puits, aucun matériau ne doit être perdu.Cependant, le retrait du milieu doit être aussi doux que possible et il faut prendre soin d'éviter toute resuspension pendant ce processus. Ajoutez délicatement 100 microlitres de milieu 7H9C dans les puits B de 2 à G 11 de la plaque, qui contiennent les agrégats de macrophages MTB. À l’aide d’une pipette multicanal, transférez 100 microlitres du composé contenant la plaque de 96 puits vers les puits correspondants de la plaque d’infection.Ensuite, placer la plaque dans un sac scellé et l'incuber pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Le test au resazurine repose sur les espèces oxydatives produites par le MTB métaboliquement actif pour convertir la resazurine bleue en résorufine fluorescente rose. Le changement de couleur et de fluorescence peut être utilisé comme marqueur indirect pour déterminer la quantité de croissance bactérienne.Préparez une solution mère de résazurine à une concentration finale de 8 milligrammes par millilitre dans de l'eau. Filtrez à travers une membrane en PVDF de 22 micromètres de diamètre de pore pour la stérilisation. Préparez une solution de travail en résazurine en mélangeant la solution mère, de l'eau et du Tween-80 selon un rapport de deux pour un pour un.Les concentrations finales sont de 4 milligrammes par millilitre de résazurine et de 5 % de Tween-80. À l’aide d’un lecteur de plaques, configurez un programme pour mesurer la fluorescence avec une excitation à 530 nanomètres et une émission à 590 nanomètres pendant 24 heures toutes les 30 minutes à 37 degrés Celsius. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius.À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 20 microlitres de solution de travail de résazurine dans les puits B de 2 à G 11 de la plaque traitée avec le médicament. Placer la plaque sur le lecteur et démarrer le programme. Afin de confirmer la robustesse de l’adaptation de ce modèle d’infection au format de plaque 96 puits, la sensibilité du MTB à la rifampicine (RIF) et à la moxifloxacine (moxy) a été évaluée comme décrit dans cette vidéo.Comme illustré ici, des structures d'agrégats de macrophages infectés par le MTB ont été générées avec succès dans un format de plaque de 96 puits, permettant ainsi une compatibilité avec un traitement à haut débit. Afin de mesurer quantitativement la conversion de la résazurine, indicatrice de la croissance bactérienne, la fluorescence de chaque puit a été suivie de manière cinétique pendant 24 heures. La présence de cellules de MTB viables est déterminée par la conversion du colorant résazurine bleu en sa forme réduite rose, ce qui se traduit quantitativement par les valeurs relatives de fluorescence au moment de la saturation.Ces graphiques miniatures représentatifs montrent les unités de fluorescence résultantes, indiquées sur l'axe des Y, en fonction du temps, indiqué sur l'axe des X. Pour générer les courbes de sensibilité aux médicaments, les puits traités au rifampicine et à la moxifloxacine ont été normalisés par rapport à la croissance maximale de MTB dans le témoin sans médicament, définie comme 100 % de survie. Les signaux du témoin de fond ont été soustraits de chaque puits échantillon.Le pourcentage de survie a été tracé pour chaque concentration individuelle de traitement médicamenteux afin de générer une courbe de destruction. Ces données montrent que la concentration minimale inhibitrice, définie comme la plus faible concentration de l'antibiotique à laquelle une inhibition de croissance de 90 % est observée, est supérieure à deux microgrammes par millilitre, tant pour la rifampicine que pour la moxifloxacine, contre le MTB provenant de notre modèle d'infection. Ainsi, la concentration minimale inhibitrice de ces deux médicaments contre le MTB, déterminée à l'aide de notre modèle d'infection et de notre test, reflète mieux l'activité de ces médicaments in vivo.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer de manière fiable et reproductible des structures d'agrégats de macrophages infectés par le MTB pour des tests de sensibilité aux médicaments en utilisant le test au résazurine. En suivant cette procédure, il est facile de modifier le modèle de médicament, passant de deux médicaments comme indiqué à un panel de bibliothèque de 58 médicaments, afin de permettre un criblage à haut débit des médicaments.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.

Système de culture automatisé destiné à être utilisé dans les essais précliniques de thérapies dirigées par l’hôte pour la tuberculose

La détermination des unités formant des colonies (UFC) est la technique de référence pour quantifier les bactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis qui peut prendre des semaines pour former des colonies visibles. Nous décrivons ici une micro-UFC pour la détermination de l’UFC avec une efficacité accrue en termes de temps, un espace de laboratoire et un coût de réactif réduits, et une évolutivité pour les expériences à moyen et haut débit.

Dosage d’unités formant des microcolonies pour l’évaluation de l’efficacité des vaccins contre la tuberculose

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

Cette étude fournit un protocole pour évaluer l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le capteur microbien SLAMF1. Les tests ont été effectués sur des macrophages dérivés de monocytes humains à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie à fluorescence. Les outils décrits sont pertinents pour étudier les interactions entre les agents pathogènes et les immunorécepteurs.

Tests de fluorescence pour l’étude de l’interaction de Mycobacterium tuberculosis avec le récepteur immunitaire SLAMF1

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Un microréseau d'amplification asymétrique combine l'amplification par PCR et l'hybridation microarray dans une seule chambre, qui simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final. Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de diagnostics des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources.

Faisant preuve d&#39;une multi-résistante<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplification de puces à ADN

Découvrez un test de sensibilité aux médicaments contre Mycobacterium tuberculosis utilisant des agrégats de macrophages infectés en plaque 96 puits. Cette méthode simple, peu coûteuse et compatible BSL-2 améliore le développement précoce de médicaments antituberculeux.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l'efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées

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