Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l'efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées Mycobacterium tuberculosis

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

L’objectif global de cette procédure est de générer de manière reproductible des structures d’agrégats de macrophages infectés par mycobacterium tuberculosis sous forme de plaque à 96 puits pour des tests de sensibilité aux médicaments à l’aide d’un colorant de viabilité. Cette méthode peut améliorer le processus précoce de développement de médicaments pour les composés antituberculeux, qui est entravé par la traduction improductive des composés candidats dans le cadre clinique. Le principal avantage de ce modèle d’infection simple, peu coûteux et compatible BSL two est qu’il récapitule les barrières de pénétration cellulaire physiologiquement pertinentes, qui rappellent les granulomes de la tuberculose.

Cela produit des résultats de sensibilité aux médicaments plus prédictifs de l’efficacité in vivo. Commencez cette procédure en préparant une protéine fluorescente verte exprimant M. tuberculosis MC carré 6206, ci-après appelée MTBGFP, pour l’infection. Gardez à l’esprit qu’il s’agit d’une souche avirulente, de sorte que tous les travaux du protocole décrit ici peuvent être effectués dans une installation de niveau de biosécurité deux.

Pour chaque plaque de 96 puits à installer, centrifuger à 2,8 fois 10 au huitième MTBGFP à 3, 200 fois G pendant cinq minutes dans une centrifugeuse à godets oscillants. Après l’essorage, aspirez le surnageant et ajoutez cinq millilitres de RPMIC pour laver les bactéries. Pipette de haut en bas pour remettre la cellule en suspension.

Puis centrifuger à nouveau. Après le deuxième essorage, versez le surnageant et remettez les cellules bactériennes en suspension dans sept millilitres de RPMIC, puis vortex pendant 10 secondes. Ensuite, pour chaque plaque de 96 puits à installer, centrifugez sept fois 10 à la sixième cellule monocytaire humaine THP1 à 250 fois G pendant cinq minutes.

Après la centrifugation, versez le surnageant et remettez en suspension les cellules THP1 dans sept millilitres de RPMIC. Ensuite, préparez une plaque à 96 puits pour l’infection en ajoutant 200 microlitres d’eau stérile dans les puits des rangées A et H et des colonnes un et 12. Ce rebord d’eau empêchera l’évaporation du milieu de culture.

Ajoutez 200 microlitres de RPMIC à la colonne deux, B deux à G deux, pour le contrôle de l’arrière-plan ou à blanc. Pour infecter le monocyte THP1, utilisez une pipette pour transférer la totalité de la suspension bactérienne MTBGFP préparée dans la suspension cellulaire THP1 et mélangez la volonté en pipetant de haut en bas. La densité finale des cellules THP1 est de cinq fois 10 à cinq par millilitre et la duplicité de puits correspondante de l’infection est de 40.

Ensuite, versez la suspension THP1 MTBGFP dans un réservoir de 25 millilitres, puis à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 200 microlitres de suspension THP1 MTBGFP dans tous les 96 puits restants, E trois à G 11. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, avec 5 % de CO2 pendant sept à 10 jours. Tous les deux jours pendant l’incubation, utilisez une pipette multicanaux pour changer de milieu en retirant lentement 100 microlitres de milieu épuisé du haut de chaque puits et en ajoutant doucement 100 microlitres de RPMIC préchauffé.

Lors du changement de milieu, il est important de veiller à ne pas perturber les agrégats de macrophages MTB au fond des puits. Chaque jour, examinez visuellement les puits à l’aide d’un microscope à fluorescence, équipé d’ensembles de filtres à fond clair et GFP avec un objectif de quatre à 10 X. Notez la taille des agrégats de macrophages MTB et capturez des images si vous le souhaitez.

D’ici le septième au dixième jour, les agrégats de macrophages MTB devraient être suffisamment importants pour être soumis à des tests d’efficacité du médicament, comme décrit plus loin dans la vidéo. Pour le dépistage des drogues, préparez deux médicaments antituberculeux en trois exemplaires sur une nouvelle plaque à 96 puits comme suit. Tout d’abord, ajoutez 125 microlitres de milieu 7H9C aux puits B deux à G 10.

Ensuite, préparez les deux médicaments au double de la concentration finale souhaitée la plus élevée dans un millilitre de 7H9C. À l’aide d’une pipette, ajoutez 250 microlitres de chaque médicament dans les puits B, C et D 11, puis E, F et G 11 respectivement pour les traitements en trois exemplaires. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, diluez en série les médicaments testés deux fois en déplaçant 125 microlitres de B 11 à G 11 dans B 10 à G 10.

Mélanger par pipetage cinq fois à chaque étape. Continuez à déplacer 125 microlitres d’une colonne à l’autre de droite à gauche sur la plaque et arrêtez-vous après la quatrième colonne. Après avoir mélangé la quatrième colonne, jetez 125 microlitres dans un conteneur à déchets.

Les colonnes deux et trois ne doivent pas contenir de médicaments. Cela leur permettra d’être utilisés comme arrière-plan et pour des contrôles de croissance positifs. Ensuite, récupérez la plaque de 96 puits contenant les macrophages infectés par le MTB dans l’incubateur.

Sans incliner la plaque, à l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 150 microlitres de fluide dans les puits B deux à G 11. Inclinez ensuite la plaque comme indiqué ici, insérez les pointes de pipette dans le bord inférieur des puits et retirez le milieu restant, environ 50 microlitres. Comme les agrégats de macrophages MTB adhèrent au fond du puits, aucun matériau ne doit être perdu.

Cependant, l’élimination du fluide doit être aussi douce que possible et des précautions doivent être prises pour éviter la remise en suspension au cours de ce processus. Ajouter doucement 100 microlitres de milieu 7H9C dans les puits B deux à G 11 de la plaque, qui contiennent les agrégats de macrophages MTB. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres du médicament contenant une plaque à 96 puits vers les puits correspondants de la plaque d’infection.

Placez ensuite l’assiette dans un sac scellé et incubez-la pendant trois jours à 37 degrés Celsius. Le dosage de la résazurine s’appuie sur les espèces oxydatives produites par le MTB métaboliquement actif pour convertir la résazurine bleue en résorufine rose fluorescente. Le changement de couleur et de fluorescence peut être utilisé comme marqueur de substitution pour déterminer la quantité de croissance bactérienne.

Préparez une solution mère de résazurine à une concentration finale de 8 milligrammes par millilitre dans l’eau. Filtrer à travers une membrane PVDF de 22 micromètres pour la stérilisation. Préparez une solution de travail dans de la résine en mélangeant la solution mère, l’eau et le Tween-80 dans un rapport de deux à un pour un.

Les concentrations finales sont de 4 milligrammes par millilitre de résazurine et de 5 % de Tween-80. À l’aide d’un lecteur de plaques, mettez en place un programme pour lire la fluorescence à une excitation de 530 nanomètres et une émission de 590 nanomètres pendant 24 heures toutes les 30 minutes à 37 degrés Celsius. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 20 microlitres de solution de travail de résazurine dans les puits B deux à G 11 de la plaque traitée par le médicament. Placez la plaque sur le lecteur et démarrez le programme. Pour confirmer la robustesse de l’adaptation de ce modèle d’infection au format plaque à 96 puits, la sensibilité de la rifampicine MTB RIF dans la moxifloxacine moxy a été évaluée comme décrit dans cette vidéo.

Comme le montre ici, les structures d’agrégats de macrophages MTB ont été générées avec succès dans un format de plaque de 96 puits, permettant ainsi une compatibilité avec les entrées. Pour mesurer quantitativement la conversion de la résazurine en tant qu’indicateur de croissance bactérienne, la fluorescence de puits individuels a été surveillée cinétiquement pendant 24 heures. La présence de cellules MTB viables est déterminée par la conversion du colorant bleu résazurine en sa forme réduite rose, ce qui est quantitativement reflété par les filets z de fluorescence relatifs au point de saturation.

Ces mini-graphiques représentatifs montrent les unités de fluorescence résultantes indiquées sur l’axe Y en fonction du temps indiqué sur l’axe X. Pour générer des courbes de sensibilité aux médicaments, les puits traités à la rifampicine et à la moxifloxacine ont été normalisés à la croissance maximale du MTB sans contrôle médicamenteux à 100 % de survie. Les signaux vides de contrôle d’arrière-plan ont été soustraits de chaque puits d’échantillon.

Le pourcentage de survie a été tracé pour chaque concentration individuelle de traitement médicamenteux afin de générer une courbe de destruction. Ces données montrent que la concentration minimale inhibitrice définit la concentration la plus faible de l’antibiotique à laquelle une inhibition de la croissance de 90 % est observée est supérieure à deux microgrammes par millilitre, pour la rifampicine et la moxifloxacine contre le MTB dérivées de notre modèle d’infection. En tant que tel, la concentration inhibitrice minimale de ces deux médicaments contre le MTB à l’aide de notre modèle d’infection et de notre test reflète davantage l’activité de ces médicaments in vivo.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer de manière fiable et reproductible des structures d’agrégats de macrophages infectés par le MTB pour les tests de sensibilité aux médicaments à l’aide du test de la résazurine. Suite à cette procédure, il est facile de modifier le modèle de médicament de deux médicaments, comme indiqué dans un panel de 58 bibliothèques de médicaments, pour permettre un dépistage de médicaments à haut débit.