Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

L'objectif général de cette procédure est de produire et de quantifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes induits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales clés concernant la conversion de lignée spécifique aux sous-types lors du reprogrammation cardiaque, telles que les signaux nécessaires qui régulent l'assemblage des sarcomères et la spécification des sous-types. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une méthode permettant d'évaluer quantitativement les effets sur la spécification des sous-types cardiaques, ce qui est indispensable pour mener des études mécanistiques.

Pour commencer, isoler des fibroblastes embryonnaires de souris à partir d'embryons au stade E 12,5. Les conserver dans l'azote liquide comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, récolter les cellules plat-E et les ensemencer à un million de cellules par puits dans une plaque de six puits afin que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 % en 24 heures.

Couvrez les cellules avec le milieu de transfection et incubez-les dans des conditions de culture standard. La veille du jour de l'expérience, prenez un tube conique en polystyrène de 15 millilitres et mélangez 60 microlitres de milieu à faible teneur en sérum avec six microlitres de réactif de transfection par réaction. Incubez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante.

Étant donné que le réactif de transfection que vous utilisez doit être ajouté directement dans le milieu à sérum réduit afin d'éviter toute diminution de l'efficacité de la transfection. Ensuite, ajoutez un total de deux microgrammes de cocktail GHMT par réaction, puis tapez doucement sur le tube pour mélanger. Incubez la réaction pendant 15 minutes à température ambiante, puis ajoutez le mélange aux cellules plat-E de manière goutte à goutte.

Enregistrez la date et l'heure de la transfection. Incubez les cellules plat-E transfectées pendant la nuit. Une heure avant de mettre en place le fibroblaste embryonnaire de souris, préparez une plaque de 24 puits pour l'immunocytochimie en ajoutant d'abord des lamelles de 12 millimètres recouvertes de fibronectine dans chaque puits.

Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution de collagène bovin dans chaque puits et incubez la plaque pendant une heure. Vers la fin de l'incubation, décongelez un flacon congelé de fibroblastes embryonnaires de souris HCN4GFP. Décongelez rapidement les cellules, rincez-les une fois avec un milieu pour fibroblastes préchauffé et déterminez la concentration de cellules viables.

Ensuite, aspirez la solution d'enduction dans la plaque 24 puits et semez immédiatement 30 000 cellules par puits sur les lamelles recouvertes de collagène et de fibronectine. Vingt-quatre heures après la transfection, filtrez le milieu rétroviral à travers un filtre en acétate de cellulose sans surfactant de 0,45 micron de taille de pore, puis transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite de la polybrene pour obtenir une concentration finale de huit microgrammes par millilitre.

Reconstituez soigneusement les cellules plat-E avec deux millilitres de milieu de transfection frais. Changer le milieu trop rapidement peut provoquer le détachement des cellules. Des cellules plat-E correctement entretenues produisent en moyenne dix millions d'unités infectieuses par millilitre.

Une forte expression et intensité de GFP dans plus de 95 % des cellules est généralement corrélée à une génération réussie de myocytes de type cardiomyocyte induits par GHNT. Ensuite, aspirez le milieu des fibroblastes embryonnaires cultivés et ajoutez le milieu rétroviral fraîchement recueilli. Puis remettez la plaque de méthicilline dans l'incubateur et incubez toute la nuit.

Le lendemain, transférez à nouveau le milieu des cellules plat-E vers les fibroblastes embryonnaires. Éliminez les cellules plat-E après la deuxième collecte de virus. 48 heures après l'induction, aspirez le milieu conditionné et lavez les cellules une fois avec du PBS.

Ensuite, ajouter 500 microlitres de milieu préalablement réchauffé induisant des cellules cardiomycocytaires de type myocyte par puits de la plaque 24 puits. Remplacer le milieu toutes les deux à trois journées pendant les 12 prochains jours. Quatorze jours après l'induction, aspirer soigneusement le milieu et rincer chaque puits avec 300 microlitres de PBS glacé.

Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 250 microlitres d'une solution de paraformaldéhyde à 4 % par puits, puis incubez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, perméabilisez les cellules en lavant les puits trois fois pendant cinq minutes avec 300 microlitres de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS. Aspirez l'excès de solution de perméabilisation après le dernier lavage, puis ajoutez un tampon de blocage universel à raison de 300 microlitres par puits.

Bloquer pendant 10 minutes à température ambiante. Colorer une paire de lames toute la nuit avec des anticorps anti-alpha-actinine de souris, anti-GFP de poulet et anti-NPPA de lapin afin d'identifier les myocytes modifiés ressemblant à des cellules pacemaker parmi les myocytes modifiés ressemblant à des cellules auriculaires. Le jour suivant, laver les puits et ajouter l'anticorps secondaire approprié comme décrit dans le protocole accompagnant le texte.

Après des lavages supplémentaires, ajouter 2,4 microlitres de milieu de montage sur une lame de microscope en verre. Prendre une lamelle depuis la plaque à 24 puits et éliminer l'excès de solution. Puis la transférer sur la lame de verre contenant le milieu de montage.

Pour chaque lame, commencez par un bord et effectuez une analyse de haut en bas dans le canal de fluorescence rouge afin d'identifier les cellules positives pour l'alpha-actinine et les sarcomères. Les stries des sarcomères sont plus faciles à identifier à une longueur d'onde de 555 nanomètres. Une fois identifiées, passez au canal vert et notez si les cellules sont positives.

Ensuite, passez à l'ordinateur pour évaluer la longueur d'onde rouge lointain de 647 nanomètres afin de rechercher la coloration de NPPA ou de MYL2. Les cellules positives pour l'alpha-actinine, positives pour les sarcomères, négatives pour Hnc4-GFP et positives pour Nppa sont des myocytes induits de type atrial. La coloration de Nppa apparaîtra paranucléaire et ponctuée.

Tout d'abord, compter le nombre de cellules 24 heures après le semis, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, inspecter visuellement chaque cellule sur un lamelle pour une coloration correcte de l'alpha-actinine et des myofibrilles, puis noter le nombre de cellules positivement colorées pour les deux marqueurs. Puis, diviser ce nombre par le nombre total réel de cellules ensemencées.

Une expérience moyenne de reprogrammation produira environ un pour cent de cellules exprimant à la fois l'alpha-actinine et les sarcomères. Au jour 14, l'expérience peut être arrêtée et évaluée quant à l'organisation des sarcomères. Ceci est identifié par la coloration positive à l'alpha-actinine, montrée ici en rouge.

Seules les cellules présentant une organisation des sarcomères sont capables de battements spontanés, ce qui constitue un bon premier contrôle. On observe ici des cardiomyocytes induits de type cellules marquantes provenant de souris rapporteuses Hcn4-GFP. Trois cellules issues de cette vue présentent une organisation des sarcomères.

Trois groupes cellulaires positifs pour Hcn4-GFP sont présents au centre de l'image et peuvent être identifiés comme un type de cellule pacemaker. Une cellule en bas à gauche peut être observée avec une coloration de l'alpha-actinine, mais sans organisation des sarcomères ni marqueur de sous-type identifiable. Dans cette population de cardiomyocytes induits de type ventriculaire, la cellule centrale présente une organisation des sarcomères ; cette cellule est également positive pour le marqueur de la chaîne légère de la myosine MYL-2, qui est un marqueur des cardiomyocytes ventriculaires.

Une fois maîtrisées, la mise en culture et la transfection des cellules plat-E peuvent être réalisées en une heure. L'induction des fibroblastes embryonnaires de souris prend une à deux heures, et la quantification myto d'une plaque complète de 24 puits dure environ huit heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que des fibroblastes embryonnaires de souris en bonne santé et des virus à haut titre sont essentiels pour une expérience de reprogrammation réussie.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer et de quantifier les sous-types individuels de cardiomyocytes induits.