Name: Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Découvrez la reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris en cardiomyocytes induits via les facteurs GHMT. Cette méthode permet de générer et quantifier les sous-types cardiaques atrial, ventriculaire et pacemaker.

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A.F.-P. a été soutenu par la bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n° 2015165336. N.V.M a été soutenu par des subventions du NIH (HL094699), du Burroughs Wellcome Fund (1009838) et de la March of Dimes (#5-FY14-203). Nous reconnaissons Young-Jae Nam, Christina Lubczyk et Minoti Bhakta pour leurs importantes contributions au développement de protocoles et à l’analyse des données. Nous remercions également John Shelton pour sa précieuse contribution technique et les membres du laboratoire Munshi pour la discussion scientifique.

Toutes les procédures expérimentales impliquant des pratiques animales ont été approuvées par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;UT Southwestern Medical Center. 1. Isolement de HCN4-GFP E12.5 souris embryonnaires fibroblaste (MEF) <ol><li> Mettre en place des accouplements chronométrés entre homozygotes mâles HCN4-GFP et CD-1 femelles. </li><li> Sacrifiez femme enceinte à E12.5 par le dioxyde de carbone et l&#39;euthanasie dislocation cervicale postérieure. <ol><li> Retirer cornes utérines avec des pinces à dissection comme décrit précédemment 22, 23, et les placer dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une solution saline 1x tampon phosphate (PBS) sans Ca 2+ ou Mg 2+. </li></ol></li><li> Effectuez toutes les étapes ultérieures de la hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile. <ol><li> Retirer les embryons de l&#39;utérus et sac amniotique à l&#39;aide de ciseaux et de pinces à disséquer. Gardez le placenta attaché pour une meilleure manipulation. pregnant CD-1 femelles donnent généralement naissance à entre 10 et 14 chiots. </li><li> Utilisation de pinces à disséquer, prendre les embryons isolés et rapidement les rincer deux fois dans 70% (v / v) EtOH. NOTE: Les lavages doivent être rapides pour réduire au minimum la mort cellulaire. </li><li> Retirez la tête, les membres, la queue et les organes internes, y compris le cœur des embryons isolés. </li><li> Placer le tissu restant dans une boîte de 10 cm avec 1 ml de 1 x PBS et finement hachée à l&#39; aide d&#39; une lame de rasoir stérile à environ 1 mm3 en taille. </li><li> Transfert tissu haché dans un tube de 50 ml conique avec du PBS. </li><li> Spin à 300 xg pendant 3 min. Aspirer soigneusement l&#39;excès de PBS. </li><li> Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA stérile par embryon. Incuber les cellules dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant 15 min. Mélanger délicatement le tube toutes les 4 min. Over-digestion du tissu va réduire considérablement le rendement. </li><li> mélange de cellules de Vortex à vitesse maximale (3.200 rpm) pendant 4 s. </li><li> Ajouter 2 mL de milieu de fibroblaste par embryon et mélanger. Filtre trâce un tamis cellulaire de 100 um à l&#39;aide d&#39;une pipette pour aider les cellules à travers le tamis. Reportez - vous au tableau 1 pour la formulation de tous les supports suivants. </li><li> Spin à 300 xg pendant 4 min. Aspirer soigneusement surnageant. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de fibroblastes frais par 3 embryons et triturer 6-10 fois. </li><li> Plaque les cellules de 1 à 15 cm boîte de culture de tissus pour tous les 3 embryons préparés. Nuit de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Après une nuit d&#39;incubation, remplacer les médias avec des produits frais 30 ml de milieu par plaque. Placez les cellules de nouveau dans l&#39;incubateur pendant une nuit. NOTE: Vérifier HCN4-GFP + contamination des cellules sous un microscope à fluorescence. La culture doit être GFP - et ne deviennent GFP + sur la reprogrammation. </li><li> Le lendemain, les cellules de récolte avec 3 mL de frais préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Comptez et congeler les cellules. En règle générale, le gel des cellules à 3 x 10 6 cellules par ml. La yie attendueld devrait être de 3 x 10 6 cellules par embryon. </li></ol></li></ol> 2. Rétrovirus Production et Reprogrammation Attention: Le protocole suivant nécessite la production et la manipulation des rétrovirus infectieux. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité de niveau 2 en vertu de BSL-2 des lignes directrices et une technique stérile. Utilisez l&#39;eau de Javel à 10% de disposer de tous les matériaux exposés à des retrovirus. <ol><li> La production de retrovirus et de préparation MEFs NOTE: Le protocole suivant est pour la production rétrovirale dans des plaques 6 puits et de l&#39;infection MEF dans des plaques à 24 puits. Pour les autres formats, se reporter au tableau 2. MEFs sont étalées à jour -1, de sorte que le calendrier devra être coordonné de manière appropriée pour chaque expérience ( Se reporter à la section 2.3 et à la figure 2). <ol><li> Maintenir les cellules selon les recommandations du fabricant Plat-E (PE). En bref, la culture de cellules PE dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1 pg / ml puromycin, 10 pg / ml de blasticidine, de la pénicilline et de la streptomycine. cellules Passage 1: 4 tous les deux jours lorsque la culture atteint 70-90% de confluence. </li><li> Jour -2: Le jour avant la transfection, les cellules ensemencer Plat-E à 1 x 10 6 cellules / puits sur une plaque de 6 puits dans les milieux de transfection. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence au moment de la transfection. </li></ol></li><li> Transfection en utilisant un agent de transfection commercial. NOTE: Les réactifs commerciaux doivent être à température ambiante (TA) avant la transfection. Pour la transfection d&#39;ADN, ajouter chaque ADN plasmidique retroviral individuellement (G, H, M et T) pour former un cocktail de GHMT 9. <ol><li> Jour -1: Dans un tube en polystyrène de 15 ml conique, mélanger 60 ul de milieu de sérum réduit avec 6 ul de réactif de transfection par réaction d&#39;un format de plaque à 6 puits. Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante. NOTE: Étant donné que le réactif de transfection utilisé ici se lie aux plastiques, undd directement au milieu de sérum réduit afin d&#39;éviter toute diminution de l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Ajouter un total de 2 pg de GHMT cocktail par réaction et appuyez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. Laisser incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Ajouter le mélange de l&#39;étape 2.2.3 pour les cellules PE d&#39;une manière sage de chute. </li><li> Incuber les cellules transfectées Plat-E pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Noter le temps de transfection. </li></ol></li><li> Ensemencement des fibroblastes embryonnaires HCN4-GFP souris. <ol><li> 1 h avant l&#39;étalement MEF, préparer une plaque de 24 puits pour immunocytochimie. <ol><li> Ajouter un fibronectine lamelle de 12 mm par puits. </li><li> Revêtir les puits avec 300 ul d&#39; une solution de collagène bovin (par exemple, surecoat) et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h. </li><li> Solution de revêtement Aspirer juste avant le placage MEF. </li></ol></li><li> Décongeler une fiole congelée de HCN4-GFP MEFs et laver x1 avec fibrobl préchaufféemédias ast à 500 xg pendant 5 min. </li><li> Déterminer la viabilité des cellules en utilisant l&#39;exclusion du bleu trypan ou des colorants similaires. Calculer le nombre de cellules viables par millilitre de culture à l&#39;aide de la formule suivante: de cellules viables% = [1,00 - (Nombre de cellules bleues / Nombre de cellules totales)] x 100 <ol><li> Calculer le nombre total de cellules viables en utilisant la formule suivante: des cellules viables de cellules viables =% x facteur de dilution x 10 000 x volume total de la suspension cellulaire </li></ol></li><li> Seed 3 x 10 4 cellules par puits sur une plaque de 24 puits avec préalablement préparé collagène bovin solution fibronectine lamelle. </li></ol></li><li> Transduction et la reprogrammation de MEFs NOTE: Selon les notes du fabricant, bien entretenu cellules Plat-E produisent un titre moyen de 1 x 10 7 unités d&#39;infection / mL. Bien que le titre ne soit pas directement mesurée pour chaque expérience, un témoin GFP est toujours inclus en tant que substitut pour l&#39;efficacité de l&#39;infection.Une expression élevée de la GFP et de l&#39; intensité (GFP +&gt; 95%) corrélé avec succès de la production d&#39;GHMT à médiation iCLMs. <ol><li> Jour 0: 24 h post-transfection, filtrer le milieu rétroviral de PE par un pm à pores de taille cellulose filtre d&#39;acétate 0,45 sans tensioactif et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 pg / ml. reconstituer soigneusement les cellules avec 2 ml de milieu de transfection frais. NOTE: Les cellules se détachent facilement de la plaque si le support est changé trop rapidement. </li><li> Aspirer le milieu des MEFs cultivées et ajoutez le moyen rétroviral fraîchement prélevé; il devrait donner 1,7 mL de milieu par puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ajouter ~ 800 ul par puits d&#39;une plaque de 24 puits. Retour plaque MEF à l&#39;incubateur et incuber pendant la nuit. </li><li> Jour 1: Répétez les étapes 2.4.1 et 2.4.2. Jeter les cellules après la collection de virus 2 ème. Retour MEFs infectés à l&#39;incubateur et laisser reposer toute la nuit. </li><li> Jour 2: 48 h après l&#39;induction, aspirez la cellule conditionné médias et lavage x1 avec PBS 1x. Ajouter 500 ul préchauffé médias ICLM par puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Remplacer les médias ICLM tous les 2 - 3 jours. Plaque de 14 jours après l&#39;induction virale pour immunocytochimie (ICC) analyse de reprogrammation cardiaque. </li></ol></li></ol> 3. Immunomarquage de MEFs reprogrammée <ol><li> 14 jours après l&#39;induction, aspirer soigneusement les médias. </li><li> Rincer chaque puits avec 300 pi de glace-froid 1x PBS. Aspirer l&#39;excès de solution. </li><li> Fixer les cellules avec 250 pi de paraformaldehyde (PFA) solution à 4% par puits d&#39;une plaque de 24 puits. Incuber 15 min à température ambiante. NOTE: les cellules fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C pendant 1 - 2 semaines avant la coloration. </li><li> cellules perméabiliser par puits de lavage x3 avec 300 ul de 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l&#39;excès de solution après le dernier lavage. </li><li> Bloc 10min à température ambiante avec 1x tampon Bloc universel à 300 pl / puits. </li><li> Préparer (CPI) tampon de coloration: Ajouter 1: 1 de PBS 1x et 1x Universal tampon de blocage. Diluer anticorps primaires dans un tampon de coloration de la CPI et incuber des anticorps nuit à 4 ° C. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées. <ol><li> Colorer une paire de diapositives avec α-actinine souris, αGFP de poulet et de lapin NPPA pour iPM et identification iAM. </li><li> Colorer une paire de diapositives avec la souris α-actinine, αGFP de poulet et de lapin Myl2 pour LID et GIV identification. </li></ol></li><li> Le lendemain, lavez les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l&#39;excès de solution après le dernier lavage. </li><li> Préparer les dilutions d&#39;anticorps secondaires dans un tampon ICC de coloration. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées. Incuber Anticorps secondaires 1 h à température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. <ol><li> Colorer toutes les diapositives avec le antibodie secondaire suivants: la souris Alexa-555, poulet Alexa-488, et le lapin Alexa-647. </li></ol></li><li> Laver les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Protéger de la lumière. </li><li> Ajouter 2,4 ul de milieu de montage contenant 1,5 pg / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur une lame de microscope en verre. Retirez délicatement la lamelle du puits de la plaque de 24 puits, enlever l&#39;excès de solution, et transfert à la lame de verre avec les médias de montage. Appuyez doucement sur la lamelle pour enlever un excès de volume et de l&#39;air. </li><li> diapositives Seal avec vernis à ongles préféré ou d&#39;étanchéité en plastique. Magasin diapositives montées à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> 4. Identification des cardiaques sous-types utilisant la microscopie confocale NOTE: Pour l&#39;imagerie, un microscope confocal équipé d&#39;au moins 2 détecteurs fluorescents capables de détection spectrale à 405, 488, 555, et 639 longueurs d&#39;onde nm est nécessaire afin d&#39;identifier IPMS, Iams et MVI. Imagcellules e en utilisant un objectif Plan-Apochromat 20X / 0,75 ou mieux. En utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image du fabricant, la numérisation des images de zoom peut atteindre 40X-huile des images de qualité d&#39;immersion. <ol><li> Bibliothèque d&#39;images: prendre des images de 8 bits avec DAPI, Alexa-488, Alexa-555 et Alexa-647 canaux (ch.). Pixel temps de séjour de 6 s, 1024 taille de l&#39;image, l&#39;étape de ligne à 2, et une moyenne de 2 est suffisante pour des images haute résolution. </li><li> Pour chaque diapositive, démarrer à partir d&#39; un bord et commencer à numériser haut et en bas dans le canal rouge fluorescent (ch.) Pour α-actinine + Sarcomère cellules + (Reportez - vous à la figure 3 et la figure 5A pour des exemples). striures Sarcomère sont plus faciles à identifier visuellement la longueur d&#39;onde de 555 nm. <ol><li> Une fois qu&#39;une α-actinine + cellule Sarcomère + a été identifié, passer à la ch vert. et de garder la note si elle est positive (LAI). Basculer vers l&#39;ordinateur pour évaluer le bien-rouge 647 ch. (IAM ou iVM). NOTE: Les cellules qui sontα-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - sont désignés comme IPMS. L&#39; expression de GFP sera vu dans toute la cellule (figure 4A). </li><li> diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), NPPA (lapin-Alexa647) et DAPI. Les cellules qui sont α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + sont iAM. NPPA coloration apparaît périnucléaire et punctiformes (figure 4B). </li><li> diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), Myl2 (lapin-Alexa647). Les cellules positives pour α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sont MVI. Myl2 coloration présentera une forme striée le long du filament de sarcomère. En raison des variations dans la qualité de la coloration et le plan Z, striations ne peuvent pas toujours être facilement visibles (figure 4C). </li></ol></li></ol> NOTE: Afin d&#39;évaluer le nombre réel de MEFs potentiellement reprogrammées, 2 puits d&#39;une plaque de 24 puits sont ensemencées en parallèle aux puits expérimentaux et sont récoltés un jour après placage. Le nombre total de cellules ensemencées est alors déterminée en calculant la moyenne des deux puits. Cela devient les cellules totales réelles plaquées (Un total). <ol><li> Sarcomère + <ol><li> Inspecter visuellement chaque cellule sur une lamelle pour le bon α-actinine + / Sarcomère + (panneaux de droite Figure 3) et enregistrer (figure 5B-i). </li><li> Tabulez le nombre total d&#39;α-actinine + / Sarcomère + sur chaque lamelle et diviser par les cellules totales réelles plaquées ( Un total) (figure 5B-iii). Par exemple, si = 12.500 cellules Un total et 100 cellules ont été a-Actinin + / Sarcomère + puis, 0,8% des MEFs plaqués ont été reprogrammée. Une moyenneexpérience reprogrammant donnera 1% a-actinine + / Sarcomère + cellules (Figure 5C). </li></ol></li><li> Sous + NOTE: Pour les étapes suivantes, reportez - vous à la figure 5B / C pour une ICLM quantification représentant workflow. En bref, pour chaque sarcomère + cellule, tabuler si elle est unique pour les deux sous - type (figure 5B-i). Calculer% Subtype (figure 5B-iii) en divisant le nombre de sous - type + cellules sur sarcomère moyenne + cellules x 100 (figure 5B-i). Pour calculer l&#39;efficacité absolue% du sous - type (figure 5B-iv), diviser le nombre de sous - type + cellule à partir de la figure 5B-i par le nombre total de cellules ensemencées x 100 (figure 5B-ii). <ol><li> Pour chacun des α-actinine cellules + / Sarcomère +, d&#39; évaluer si elles sont GFP +, NPPA + ou Myl2 <sup&gt; +. </li><li> Tabulez nombre total d&#39;α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + et α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / + Myl2 cellules (figure 5B-I). </li><li> Pour calculer le pourcentage de chaque sous - type, il faut diviser le nombre de sous - type + cellules par le nombre total d&#39;α-actinine + / Sarcomère + cellules dans ce puits et multiplier par 100. GHMT génère IPMS, Iams et iVMS ratios à peu près égales (Figure 5B-iii). </li><li> Pour calculer le nombre absolu de sous - type + cellules, diviser le nombre total de sous - type + cellules pour la condition expérimentale par Un total et multiplier par 100 (figure 5B-ii). Sur IPMS moyenne représentent 0,3% de la population totale de cellules infectées, Iams 0,3%, etiVMS 0,25% (figure 5B-iv). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La présente étude fournit une stratégie directe reprogrammation pour la conversion de MEFs dans un ensemble diversifié de sous-types cardiaques via l&#39;expression de retrovirus de la transcription cardiaque Facteurs Gata4, MEF2C, Tbx5 et Hand2 (GHMT). En utilisant une approche d&#39;immunocoloration multiplex en combinaison avec une souris reporter PM-spécifique, nous sommes en mesure d&#39;identifier iAM, IVM, et IPMS à la résolution d&#39;une seule cellule. Un tel essai permet une expérimentation dans le sy...

Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l&#39;embryon 1, 2. En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l&#39;oxygène, des nutriments, et un mécanisme d&#39;élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l&#39;insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un potentiel de régénération cardiaque, le cœur de mammifère adulte est plus limitée 3, 5, 6. Ainsi, compte tenu de la fonction critique du cœur, il est pas étonnant que la maladie cardiaque est la principale cause de décès dans le monde, ce qui représente 600.000 décès aux Etats-Unis seulement 7. lerefore, les thérapies à base de cellules pour réparer ou remplacer efficacement le myocarde blessés sont d&#39;un grand intérêt clinique. L&#39;étude séminal Yamanaka et ses collègues 8 montré que l&#39; expression forcée de quatre facteurs de transcription est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes complètement différenciées des cellules souches pluripotentes. Cependant, la capacité tumorigène de toutes les stratégies de cellules souches pluripotentes a été une préoccupation critique dans leur utilisation à des fins thérapeutiques. Ceci a motivé le domaine scientifique à la recherche de méthodes alternatives pour transdifférencier cellules tout en évitant une étape pluripotentes. Récemment, plusieurs groupes ont montré la faisabilité de cette stratégie en affichant la conversion directe de fibroblastes de souris aux cellules analogues à des cardiomyocytes induites (iCLMs) avec l&#39;expression ectopique de facteurs de transcription Gata4, MEF2C, Tbx5, et plus tard, Hand2 (GMT et GHMT , respectivement) , 9, 10. Furthermore, la même stratégie peut être réalisée in vivo et dans des tissus d&#39; origine humaine 9, 11, 12. Des études récentes ont mis en évidence des facteurs supplémentaires ou les voies de signalisation qui peuvent être modulées pour améliorer encore l&#39; efficacité de reprogrammation cardiaque 13, 14, 15. Pris ensemble, ces études démontrent le potentiel de transdifférenciation dirigé pour les thérapies régénératrices. Cependant, la faible efficacité de CM reprogrammation, les mécanismes moléculaires inconnus, reproductibilité incompatibles en raison des différences méthodologiques 16, et de la nature hétérogène de iCLMs restent sans réponse. Afin d&#39;évaluer directement ICLM hétérogénéité, nous avons conçu un essai à cellule unique discrète et robuste pour l&#39;identification du développement des sarcomères et cardiaque lignée specification-deux caractéristiques nécessaires de cardiomyocytes fonctionnels. Il y a au moins trois grands types de CM dans le coeur tel que défini par leur emplacement et les propriétés électriques uniques: auriculaire (AM), ventriculaire (VM) et pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Dans une combinaison orchestrée, ils permettent le bon pompage du sang. Pendant les blessures du cœur, un ou tous les sous-types peuvent être affectés, et le type de thérapie cellulaire devraient être abordées au cas par cas. À l&#39;heure actuelle, la plupart des stratégies axées sur la production globale de cardiomyocytes, alors que peu de travaux sont en cours pour étudier les mécanismes moléculaires qui régule la spécification de sous-type. L&#39;étude suivante détaille comment quantifier correctement sarcomères bien organisés et identifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes. L&#39;utilisation d&#39;un pacemaker (PM) souris rapporteur spécifique de, nous sommes en mesure d&#39;appliquer un iapproche mmunocytochemical de distinguer les myocytes atriaux induites comme (IAM), les myocytes ventriculaires induites comme (IVM), et myocytes PM-like induits (IPMS) 21. Sur la base de nos observations, seules les cellules qui présentent l&#39;organisation sarcomère sont capables de battre spontanée. Cette plate-forme de reprogrammation unique permet d&#39;évaluer le rôle de certains paramètres dans l&#39;organisation du sarcomère, la spécification du sous-type, et l&#39;efficacité de CM reprogrammation à seule cellule de résolution.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Composant des milieux iCLM, Plat-E, fibroblaste et milieu de transfection</td></tr><tr><td>Milieu 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>Composant du milieu iCLM</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Composant du milieu iCLM, du milieu Plat-E, du fibroblaste et du milieu de transfection</td></tr><tr><td>Insuline-Transferrine-Sélénium G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td>Composant du milieu iCLM</td></tr><tr><td>Solution vitaminique MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>Composant du milieu iCLM</td></tr><tr><td>Acides aminés MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>Composant du milieu iCLM</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>Composant du milieu iCLM</td></tr><tr><td>Antibiotiques-antimycosiques</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Composant du média iCLM</td></tr><tr><td>Supplément B-27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Composant du média iCLM Sérum de</td></tr><tr><td>cheval inactivé par la chaleur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-088</td><td>Composant du média iCLM</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>Composant du média iCLM</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1514022</td><td>Composant du milieu Plat-E et du milieu fibroblastique</td></tr><tr><td>Puromycine&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>Composant de Plat-E media</td></tr><tr><td>Blasticidine&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>Composant du média Plat-E</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Composant du média Fibroblaste</td></tr><tr><td>Balayage laser confocal LSM700</td><td>Zeiss Pour l’analyse</td><td></td><td>confocale</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Réactif de transfection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Opti-MEM Sérum Réduit Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Réactif de transfection&nbsp ;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Réactif d’induction. Utilisation à une concentration finale de 8 &mu ; M/mL</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire rétrovirale packagin platinium-E (PE), cellule écotropiqueBiolabs</td><td></td><td>RV-101</td><td>Lignée cellulaire rétrovirale pacaking</td></tr><tr><td>Trypsine 0,25 % EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Pour les MEF et la dissociation Plat-E</td></tr><tr><td>Souris anti &alpha ;-actinine (clone EA-53)</td><td>Anticorps Sigma</td><td>A7811</td><td>pour l’analyse confocale. Utiliser à 1:200</td></tr><tr><td>Poulet anti-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>Anticorps pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA&nbsp ;</td><td>Anticorps AP8534A Abgent</td><td></td><td>pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp ;</td><td>ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>Anticorps pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:200</td></tr><tr><td>Solution Vectashield avec DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)</td><td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>Colorant pour l’analyse confocale</td></tr><tr><td>Lames de microscope Superfrost Plus Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1,0 mm</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectine 12 mm Couvre-objectifs</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>pour l’analyse confocale</td></tr><tr><td>100 &mu ; crépine à cellules m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu ; m Seringues filtres SFCA 25MM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-740-106</td><td>Pour filtration virale</td></tr><tr><td>6 mL Seringues</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>Pour filtration virale</td></tr><tr><td>Chèvre anti-Poulet IgY (H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin A647 IgG(H+L)&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400</td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>Pour la perméabilisation cellulaire&nbsp ;</td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x Réactif de blocage universel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>Diluer à 1x dans H2O</td></tr><tr><td>16 % Solution aqueuse de paraformaldéhyde (PFA)</td>Electro <td>Microscopy Sciences&nbsp ;</td><td>15710</td><td>Utilisation à 4 % diluée dans le dH2O</td></tr><tr><td>Plaques de 6 cm</td><td>Olympus</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Boîtes de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 cm ; Boîtes de culture tissulaire</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes coniques</td><td>Corning</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques</td><td>Corning</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Trypan blue solution</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Pour la viabilité</td></tr><tr><td>Alcool éthylique 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Thermo Fisher Scientifique</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des cardiomyocytes types suivants reprogrammation transcription factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

La reprogrammation directe d’un type de cellule en un autre est récemment apparue comme un paradigme puissant pour la médecine régénérative, la modélisation des maladies et la spécification de lignée. En particulier, la conversion des fibroblastes en myocytes induits de type cardiomyocytes (iCLM) par Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5 (GHMT) représente une voie importante pour générer des myocytes cardiaques de novo in vitro et in vivo. Des preuves récentes suggèrent que la GHMT génère une plus grande diversité de sous-types cardiaques qu’on ne le pensait auparavant, soulignant ainsi la nécessité d’une approche systématique pour mener des études supplémentaires. Cependant, avant que la reprogrammation directe puisse être utilisée comme stratégie thérapeutique, les fondements mécanistes de la conversion de lignée doivent être compris en détail pour générer des sous-types cardiaques spécifiques. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des iCLM par reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) médiée par GHMT. 
Nous décrivons des méthodes pour l’isolement des MEF, la production de rétroviraux et l’infection par les MEF afin d’accomplir une reprogrammation efficace. Pour déterminer l’identité du sous-type des cellules reprogrammées, nous détaillons une approche étape par étape pour effectuer l’immunocytochimie sur des iCLM à l’aide d’un ensemble défini d’anticorps compatibles. Des méthodes de microscopie confocale, d’identification et de quantification des iCLM et des sous-types individuels auriculaires (iAM), ventriculaires (iVM) et stimulateurs cardiaques (iPM) sont également présentées. Enfin, nous discutons des résultats représentatifs d’expériences de reprogrammation directe prototypiques et soulignons les aspects techniques importants de notre protocole pour assurer une conversion efficace de la lignée. Dans l’ensemble, notre protocole optimisé devrait fournir une approche par étapes aux chercheurs pour mener des expériences de reprogrammation cardiaque significatives qui nécessitent l’identification de sous-types individuels de MC.

Profitant de la souris reporter PM-spécifique, nous avons développé une stratégie d&#39;immunocoloration multiplex pour identifier divers myocytes endogènes comme le montre la figure 1. Après les étapes de reprogrammation de la figure 2, l&#39; induction de CMs spécifiques du sous-type peut être détectée dès le jour 4 21, mais à un faible taux. Au jour 14, l&#39;expérience peut être arrêté et évalué pour l&#39; organisation sarcom...

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

L'objectif général de cette procédure est de produire et de quantifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes induits. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales clés concernant la conversion de lignée spécifique aux sous-types lors du reprogrammation cardiaque, telles que les signaux nécessaires qui régulent l'assemblage des sarcomères et la spécification des sous-types. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit une méthode permettant d'évaluer quantitativement les effets sur la spécification des sous-types cardiaques, ce qui est indispensable pour mener des études mécanistiques.Pour commencer, isoler des fibroblastes embryonnaires de souris à partir d'embryons au stade E 12,5. Les conserver dans l'azote liquide comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, récolter les cellules plat-E et les ensemencer à un million de cellules par puits dans une plaque de six puits afin que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80 % en 24 heures.Couvrez les cellules avec le milieu de transfection et incubez-les dans des conditions de culture standard. La veille du jour de l'expérience, prenez un tube conique en polystyrène de 15 millilitres et mélangez 60 microlitres de milieu à faible teneur en sérum avec six microlitres de réactif de transfection par réaction. Incubez le mélange pendant cinq minutes à température ambiante.Étant donné que le réactif de transfection que vous utilisez doit être ajouté directement dans le milieu à sérum réduit afin d'éviter toute diminution de l'efficacité de la transfection. Ensuite, ajoutez un total de deux microgrammes de cocktail GHMT par réaction, puis tapez doucement sur le tube pour mélanger. Incubez la réaction pendant 15 minutes à température ambiante, puis ajoutez le mélange aux cellules plat-E de manière goutte à goutte.Enregistrez la date et l'heure de la transfection. Incubez les cellules plat-E transfectées pendant la nuit. Une heure avant de mettre en place le fibroblaste embryonnaire de souris, préparez une plaque de 24 puits pour l'immunocytochimie en ajoutant d'abord des lamelles de 12 millimètres recouvertes de fibronectine dans chaque puits.Ensuite, ajoutez 300 microlitres de solution de collagène bovin dans chaque puits et incubez la plaque pendant une heure. Vers la fin de l'incubation, décongelez un flacon congelé de fibroblastes embryonnaires de souris HCN4GFP. Décongelez rapidement les cellules, rincez-les une fois avec un milieu pour fibroblastes préchauffé et déterminez la concentration de cellules viables.Ensuite, aspirez la solution d'enduction dans la plaque 24 puits et semez immédiatement 30 000 cellules par puits sur les lamelles recouvertes de collagène et de fibronectine. Vingt-quatre heures après la transfection, filtrez le milieu rétroviral à travers un filtre en acétate de cellulose sans surfactant de 0,45 micron de taille de pore, puis transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez ensuite de la polybrene pour obtenir une concentration finale de huit microgrammes par millilitre.Reconstituez soigneusement les cellules plat-E avec deux millilitres de milieu de transfection frais. Changer le milieu trop rapidement peut provoquer le détachement des cellules. Des cellules plat-E correctement entretenues produisent en moyenne dix millions d'unités infectieuses par millilitre.Une forte expression et intensité de GFP dans plus de 95 % des cellules est généralement corrélée à une génération réussie de myocytes de type cardiomyocyte induits par GHNT. Ensuite, aspirez le milieu des fibroblastes embryonnaires cultivés et ajoutez le milieu rétroviral fraîchement recueilli. Puis remettez la plaque de méthicilline dans l'incubateur et incubez toute la nuit.Le lendemain, transférez à nouveau le milieu des cellules plat-E vers les fibroblastes embryonnaires. Éliminez les cellules plat-E après la deuxième collecte de virus. 48 heures après l'induction, aspirez le milieu conditionné et lavez les cellules une fois avec du PBS.Ensuite, ajouter 500 microlitres de milieu préalablement réchauffé induisant des cellules cardiomycocytaires de type myocyte par puits de la plaque 24 puits. Remplacer le milieu toutes les deux à trois journées pendant les 12 prochains jours. Quatorze jours après l'induction, aspirer soigneusement le milieu et rincer chaque puits avec 300 microlitres de PBS glacé.Ensuite, retirez le PBS et ajoutez 250 microlitres d'une solution de paraformaldéhyde à 4 % par puits, puis incubez les cellules pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, perméabilisez les cellules en lavant les puits trois fois pendant cinq minutes avec 300 microlitres de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS. Aspirez l'excès de solution de perméabilisation après le dernier lavage, puis ajoutez un tampon de blocage universel à raison de 300 microlitres par puits.Bloquer pendant 10 minutes à température ambiante. Colorer une paire de lames toute la nuit avec des anticorps anti-alpha-actinine de souris, anti-GFP de poulet et anti-NPPA de lapin afin d'identifier les myocytes modifiés ressemblant à des cellules pacemaker parmi les myocytes modifiés ressemblant à des cellules auriculaires. Le jour suivant, laver les puits et ajouter l'anticorps secondaire approprié comme décrit dans le protocole accompagnant le texte.Après des lavages supplémentaires, ajouter 2,4 microlitres de milieu de montage sur une lame de microscope en verre. Prendre une lamelle depuis la plaque à 24 puits et éliminer l'excès de solution. Puis la transférer sur la lame de verre contenant le milieu de montage.Pour chaque lame, commencez par un bord et effectuez une analyse de haut en bas dans le canal de fluorescence rouge afin d'identifier les cellules positives pour l'alpha-actinine et les sarcomères. Les stries des sarcomères sont plus faciles à identifier à une longueur d'onde de 555 nanomètres. Une fois identifiées, passez au canal vert et notez si les cellules sont positives.Ensuite, passez à l'ordinateur pour évaluer la longueur d'onde rouge lointain de 647 nanomètres afin de rechercher la coloration de NPPA ou de MYL2. Les cellules positives pour l'alpha-actinine, positives pour les sarcomères, négatives pour Hnc4-GFP et positives pour Nppa sont des myocytes induits de type atrial. La coloration de Nppa apparaîtra paranucléaire et ponctuée.Tout d'abord, compter le nombre de cellules 24 heures après le semis, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, inspecter visuellement chaque cellule sur un lamelle pour une coloration correcte de l'alpha-actinine et des myofibrilles, puis noter le nombre de cellules positivement colorées pour les deux marqueurs. Puis, diviser ce nombre par le nombre total réel de cellules ensemencées.Une expérience moyenne de reprogrammation produira environ un pour cent de cellules exprimant à la fois l'alpha-actinine et les sarcomères. Au jour 14, l'expérience peut être arrêtée et évaluée quant à l'organisation des sarcomères. Ceci est identifié par la coloration positive à l'alpha-actinine, montrée ici en rouge.Seules les cellules présentant une organisation des sarcomères sont capables de battements spontanés, ce qui constitue un bon premier contrôle. On observe ici des cardiomyocytes induits de type cellules marquantes provenant de souris rapporteuses Hcn4-GFP. Trois cellules issues de cette vue présentent une organisation des sarcomères.Trois groupes cellulaires positifs pour Hcn4-GFP sont présents au centre de l'image et peuvent être identifiés comme un type de cellule pacemaker. Une cellule en bas à gauche peut être observée avec une coloration de l'alpha-actinine, mais sans organisation des sarcomères ni marqueur de sous-type identifiable. Dans cette population de cardiomyocytes induits de type ventriculaire, la cellule centrale présente une organisation des sarcomères ; cette cellule est également positive pour le marqueur de la chaîne légère de la myosine MYL-2, qui est un marqueur des cardiomyocytes ventriculaires.Une fois maîtrisées, la mise en culture et la transfection des cellules plat-E peuvent être réalisées en une heure. L'induction des fibroblastes embryonnaires de souris prend une à deux heures, et la quantification myto d'une plaque complète de 24 puits dure environ huit heures. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que des fibroblastes embryonnaires de souris en bonne santé et des virus à haut titre sont essentiels pour une expérience de reprogrammation réussie.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer et de quantifier les sous-types individuels de cardiomyocytes induits.

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Ici, nous présentons une méthode pour exploiter efficacement le potentiel de différenciation cardiaques des jeunes sources de cellules souches mésenchymateuses humaines afin de générer des cellules fonctionnelles, contractants, cardiomyocyte-comme in vitro.

In Vitro Différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en cellules fonctionnelles Cardiomyocyte

Nous présentons ici une méthode robuste pour reprogrammer les fibroblastes embryonnaires primaires dans les cardiomyocytes fonctionnelles par le biais de la surexpression de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 et miR-133 (GHMT2m) aux côtés de l’inhibition de la signalisation TGF-β. Notre protocole génère des cardiomyocytes raclée dès transduction après 7 jours avec jusqu'à 60 % efficacité.

Suppression de la signalisation profibrotiques potentialise médiée par les facteurs reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris dans les Cardiomyocytes induites

Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle...

Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

Découvrez la reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris en cardiomyocytes induits via les facteurs GHMT. Cette méthode permet de générer et quantifier les sous-types cardiaques atrial, ventriculaire et pacemaker.

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

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