Name: Automatisé Contraction Lanalyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Découvrez l'analyse automatisée des contractions de tissus cardiaques humains générés à partir de cellules iPS pour le dépistage de sécurité des médicaments. Cette méthode permet d'évaluer les effets pharmacologiques sur la force contractile in vitro.

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Les auteurs remercient Alessandra Moretti et Dennis Schade pour leur contribution type de matériel. Nous reconnaissons le grand soutien du groupe de travail iPS et EHT au Département de pharmacologie et de toxicologie expérimentale de l&#39;UKE. Le travail des auteurs est pris en charge par des subventions du DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) et le ministère allemand de l&#39;éducation et de la recherche (BMBF), la Fondation allemande pour la recherche (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centre national britannique pour le remplacement Raffinement et réduction des animaux en recherche (NC3Rs CRACK-IT accorde 35911-259146), la British Heart Foundation RM / 13/30157, le Conseil européen de la recherche (Advanced Grant IndivuHeart), la Fondation allemande du cœur et la ville libre et hanséatique de Hambourg.

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<li>Godier-Furnémont, A. F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+force-frequency+response+in+engineered+heart+muscle+by+electromechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation.</a> Biomaterials. 60, 82-91 (2015).</li>
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<li>Huebsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+iPS-Cell-Derived+Cardiac+Muscles+for+Physiologically+Relevant+Drug+Response+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses.</a> Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
</ol>

IM, TE et AH sont co-fondateurs de EHT Technologies GmbH, Allemagne.

tissu cardiaque conçu offre une option valable à la boîte à outils de la recherche cardiovasculaire. HASTI dans le format de 24 puits se sont révélés utiles pour la modélisation de la maladie 8, 14, le dépistage de l&#39; innocuité des médicaments 7, 8, 10, 11, 15, ou la recherche cardiovasculaire de ...

effets secondaires cardiaques tels que le syndrome du QT long induite par le médicament ont conduit à des retraits du marché au cours des dernières années. Les statistiques indiquent qu&#39;environ 45% de tous les prélèvements sont dus à des effets indésirables sur le système cardio - vasculaire 1. Cette défaillance du médicament après le processus de développement coûteux et l&#39;approbation est le pire scénario pour les entreprises pharmaceutiques. services de recherche et de développement se concentrent donc sur la détection de ces effets cardiovasculaires indésirables tôt. Pour des questions économiques et éthiques, les efforts visant à réduire l&#39; expérimentation animale et les remplacer par de nouveaux tests de dépistage in vitro sont en cours. Un ensemble de tests établis sont inclus dans les lignes directrices et des aliments aux États-Unis Drug Administration (FDA) et l&#39; Agence européenne des médicaments (EMA) pour l&#39; évaluation préclinique des effets des médicaments proarythmiques 2. La technologie de cellules somatiques suivi reprogrammation par la différenciation desLes cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) stimulé ce champ de recherche 3. Il offre maintenant la possibilité de dépister de nouveaux médicaments candidats sur cardiomyocytes humains in vitro et évite les problèmes avec des différences entre espèces. Protocoles de différenciation cardiaques récents 4, 5 fournissent l&#39; offre illimitée de cardiomyocytes sans souci éthique. Cependant, la mesure de la force contractile, le plus important et le mieux caractérisé en ce paramètre vivo de cardiomyocytes, est pas bien établie. Ceci est lié à la relative immaturité 6 des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) par rapport à la cardiomyocytes adulte. Un progrès possible est de concevoir trois dimensions du tissu cardiaque à partir de cellules individuelles 7 (ingénierie tissulaire cardiaque, EHT). Le protocole EHT est basée sur l&#39; incorporation des cardiomyocytes humains ou murins unique 8 </sup&gt;, 9, 10 en hydrogel de fibrine entre deux postes polydiméthylsiloxane flexible (PDMS) 11 en format 24 puits. En quelques jours, les cardiomyocytes commencent à se contracter spontanément comme des cellules individuelles et commencent à former des réseaux cellulaires. Après 7-10 jours, les contractions macroscopiques du tissu entier sont visibles. Au cours de ce processus est remodelé la matrice extracellulaire, ce qui conduit à une diminution du diamètre et de la longueur. Le raccourcissement des résultats EHT en flexion des PDMS même post pendant le repos, la soumission cardiomyocytes dans le développement EHT à la charge continue. HASTI continuent d&#39;effectuer des contractions musculaires auxotonique pendant plusieurs semaines. HASTI humains montrent des réponses à la stimulation physiologique et pharmacologique indiquant leur aptitude à modéliser le dépistage des drogues et de la maladie 7. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole robuste et facile pour les generatisur de EHT humain, et l&#39;analyse de la contractilité automatisée des changements dépendant de la concentration du motif de contraction en présence d&#39;inhibiteurs du canal hERG.

<table><tbody><tr><td>Instrument d’analyse EHT</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Le logiciel est inclus</td></tr><tr><td>EHT PDMS rack</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE spacer</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>EHT</td><td>electrode EHT Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT pace adaptateur/câble</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire à 6 puits</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>tube de faucon de 15 mL, gradué.</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Racleur à cellules</td><td>Sarstedt</td><td>831,830</td><td></td></tr><tr><td>Fiole tournante</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur Variomag/ Cimarec Biosystem Direct&nbsp ;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>Régler la vitesse du rotor à 40 tr/min</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T175&nbsp ;</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>831 812 002</td><td></td></tr><tr><td>Crémaillère de sédimentation en V</td><td>Fabriqué sur mesure chez UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10& fois ; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycérol&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Acide 2-phospho-L-ascorbique sel trisodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activine-A&nbsp ;</td><td>R& D systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS insuline&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase II&nbsp ;</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNase II, type V (à partir de la rate bovine)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphine&nbsp ;</td><td>abcam</td><td>AB120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène (bovin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Pour l’enrobage : dilution 1:200</td></tr><tr><td>HBSS sans Ca2+/Mg2+s ;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval</td><td>Technologies de la vie</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Pour EHT reconstitutionmix.</td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-Toluènesulfonamide</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Fabriqué sur mesure à l’UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell cardiomyocytes</td><td>kit Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte cardiomyocyte</td><td>kit Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes</td><td>kit Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis cardiomyocytes</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisé contraction l&#39;analyse des tissus humains engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

ingénierie de tissu cardiaque décrit des techniques pour constituer trois forces génératrices de dimensions tissus d&#39;ingénierie. Pour la mise en œuvre de ces procédures dans la recherche fondamentale et le développement préclinique de médicaments, il est important de développer des protocoles pour la production et l&#39;analyse automatisée dans des conditions normalisées. Nous présentons ici une technique pour générer du tissu cardiaque Engineered (EHT) de cardiomyocytes de différentes espèces (rat, souris, humaines). La technique repose sur l&#39;assemblage d&#39;un gel de fibrine contenant des cardiomyocytes dissociées entre les postes polydiméthylsiloxane élastique (PDMS) dans un format à 24 puits. En trois dimensions, HASTI produisant une force constituent dans les deux semaines après la coulée. Cette procédure permet la génération de plusieurs centaines de HASTI par semaine et est techniquement limitée que par la disponibilité des cardiomyocytes (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluation des contractions musculaires auxotonique est effectuée dans une chambre d&#39;incubation modifié avec un mécaninterlock ical pour plaques à 24 puits et une caméra placée au-dessus de cette enceinte. Un logiciel commande une caméra déplacée sur un système d&#39;axes XYZ de chaque EHT. contractions EHT sont détectées par un algorithme de reconnaissance automatique de la figure, et la force est calculée sur la base de raccourcissement de la EHT et la propension élastique et la géométrie des postes de PDMS. Cette procédure permet une analyse automatisée des nombres élevés de EHT dans des conditions normalisées et stériles. La détection fiable des effets des médicaments sur la contraction des cardiomyocytes est crucial pour le développement de médicaments et la pharmacologie cardiaque de sécurité. Nous démontrons, avec l&#39;exemple du système E-4031, que le EHT humain inhibiteur du canal hERG reproduit les réponses des médicaments sur la cinétique de contraction du cœur humain, ce qui indique qu&#39;il est un outil prometteur pour le dépistage cardiaque de l&#39;innocuité des médicaments.

Différenciation cardiaque et préparation de EHT HiPSC ont été étendus sur le facteur de croissance réduite matrice de la membrane basale, dissociées avec EDTA et corps embryoïdes (EbS) formés dans des flacons spinner pendant la nuit. Après l&#39;induction mésodermique pendant trois jours, la différenciation cardiaque a été initiée avec l&#39;inhibiteur Wnt. Après ~ 17 jours de protocole de différenciation, en battant EB ont été d...

Ici, nous montrons la génération de tissu cardiaque humain conçu à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) cardiomyocytes dérivée de. Nous présentons une méthode pour analyser la force de contraction et de modification à titre d&#39;exemple de configuration de contraction de l&#39;inhibiteur du canal hERG E-4031. Cette méthode montre haut niveau de robustesse et l&#39;aptitude pour le dépistage des drogues cardiaque.

Automatisé Contraction L&#39;analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

L'objectif général de cette technique est de générer un tissu cardiaque ingénierisé tridimensionnel pouvant être utilisé comme plateforme d'analyse de la contraction in vitro pour le criblage de médicaments et la modélisation de maladies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiaque concernant la modélisation des maladies, la pharmacologie de sécurité, ainsi que les effets de variants génétiques ou de médicaments sur la force contractile. Le principal avantage de cette technique est que la force contractile peut être mesurée sur des tissus cardiaques ingénierisés provenant d'espèces différentes, en conditions stériles et pendant de longues périodes.Les scientifiques novices dans cette méthode pourraient éprouver des difficultés dues à une mauvaise qualité cellulaire ou à l'absence d'un composant dans le milieu. Il est important d'optimiser la préparation du milieu et d'éviter les cycles du processus. Cette procédure sera démontrée par Anika Benzin et Umber Saleem.Avant de commencer la procédure, ajouter 1,6 millilitre d'agarose à deux pour cent tiède dans les puits du plateau de secours d'une plaque de 24 puits. Et placer immédiatement des entr

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Ce manuscrit décrit la création de tissus cardiaques modifiés définis à l’aide de l’expression de marqueurs de surface et du tri cellulaire. Les tissus définis peuvent ensuite être utilisés dans un bioréacteur multi-tissus pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque afin de fournir un système modèle fonctionnel, mais contrôlé, du cœur humain.

Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Contractant spontanément syncytiums de cardiomyocytes dérivés de pluripotentes induites par l’homme les cellules souches sont des modèles utiles de la physiologie cardiaque humaine et de la pharmacologie. Nous présentons ici un système de criblage à haut débit afin de quantifier les effets des composés exogènes sur les coups de fréquence, à l’aide d’un colorant fluorescent Ca sensible et un lecteur de plaque multipuits imagerie thermorégulées.

Contractions de syncytiums Cardiomyocyte iPSC-anthropique mesurées avec un colorant Fluorescent Ca sensible dans le contrôle de la température des plaques 384 puits

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de...

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.

Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

L’analyse des changements dans la fonction contractile et l’intégrité cellulaire des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC est d’une importance capitale pour le développement de médicaments non cliniques. Un système hybride d’analyse cellulaire à 96 puits aborde les deux paramètres en temps réel et de manière physiologique pour obtenir des résultats fiables et pertinents pour l’homme, nécessaires à une transition sûre vers les stades cliniques.

Système d’analyse cellulaire hybride pour évaluer les changements structurels et contractiles de cardiomyocytes humains dérivés de CSPi pour l’évaluation préclinique du risque cardiaque

Les tissus cardiaques tridimensionnels issus de la bio-ingénierie à l’aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches sont apparus comme des modèles prometteurs pour l’étude in vitro du myocarde humain sain et malade, tout en récapitulant les aspects clés de la niche cardiaque native. Ce manuscrit décrit un protocole de fabrication et d’analyse de tissus cardiaques artificiels à haut contenu générés à partir de cardiomyocytes induits pluripotents dérivés de cellules souches humaines.

Conception d’un bioréacteur pour améliorer l’acquisition de données et modéliser le débit des tissus cardiaques modifiés

Ce protocole décrit comment mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes provenant de cœurs de donneurs avec le système MyoBLAZER, une plate-forme fiable pour évaluer les changements de contractilité induits par les médicaments au cours du développement préclinique.

Mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés

Ce protocole fournit des méthodes pour générer des tissus cardiaques et musculaires squelettiques modifiés en 3D et décrit leur utilisation dans les modalités de dépistage préclinique des médicaments. Les méthodes décrites utilisent un système de détection magnétique pour faciliter l’évaluation simultanée de 24 tissus en parallèle.

Tests précliniques de médicaments dans des tissus musculaires 3D évolutifs

Ici, nous démontrons une méthode non invasive d’évaluation de la contractilité des dispositifs médicaux cardiaques utilisant des monocouches 2D de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM), plaquées sur un substrat flexible, couplées à une microscopie vidéo. Cet outil sera utile pour l’évaluation in vitro des propriétés contractiles des appareils d’électrophysiologie cardiaque.

Évaluation de la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes 2D dérivés de cellules souches humaines

Une méthode reproductible est présentée pour générer des tissus myocardiques 3D combinant l’écriture par électrofilage fondu (MEW), des échafaudages de polycaprolactone (PCL) et des hydrogels de fibrine avec des cardiomyocytes et des fibroblastes dérivés de hiPSC. Cette technique offre un contrôle précis de l’architecture de l’échafaudage et peut être appliquée dans les tests précliniques de médicaments et la modélisation des maladies cardiaques.

Génération 3D de tissu myocardique humain à l’aide de l’écriture électrofilée à l’état fondu d’échafaudages de polycaprolactone et de cellules cardiaques dérivées de hiPSC

Découvrez l'analyse automatisée des contractions de tissus cardiaques humains générés à partir de cellules iPS pour le dépistage de sécurité des médicaments. Cette méthode permet d'évaluer les effets pharmacologiques sur la force contractile in vitro.

Automatisé Contraction L'analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

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