Automatisé Contraction L'analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments

L’objectif global de cette technique est de générer du tissu cardiaque tridimensionnel qui peut être utilisé comme plate-forme d’analyse de contraction in vitro pour le dépistage de médicaments et la modélisation de maladies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiaque sur la modélisation des maladies, la pharmacologie de sécurité et les effets des variantes génétiques, ou des médicaments sur la force contractile. Le principal avantage de cette technique est que la force contractile peut être mesurée dans des tissus cardiaques modifiés de différentes espèces dans des conditions stériles, pendant de longues périodes.

Les scientifiques novices dans cette méthode pourraient lutter contre le manque de qualité cellulaire. Ou l’absence d’un dans le médium. Il est important d’optimiser l’auto-préparation et d’éviter les cycles de la Démonstration de cette procédure sera Anika Benzin et Umber Saleem.

Avant de commencer la procédure, ajoutez 1,6 millilitre d’agarose chaud à deux pour cent dans les puits de premiers secours d’une plaque de 24 puits. Et placez immédiatement le polytétrafluoroéthylène dans des entretoises dans l’agarose. Après environ 10 minutes à température ambiante, l’agarose deviendra opaque, ce qui signifie sa solidification.

Retirez les entretoises et placez les racks PDMS dans les pièces moulées de manière à ce que des paires de poteaux de rack atteignent chaque moule d’agarose. Lorsque tous les supports ont été placés, nous suspendons les cardiomyocytes dans un milieu à une concentration minimale de 1,5 fois 10 à sept cellules par millilitre et nous mélangeons 10 à 15 fois avec du fibrinogène avec le fibrinogène jusqu’à ce que le caillot de fibrinogène soit dissous. Vérifiez l’homogénéité du mélange de reconstitution dans la pipette.

Ensuite, pour chaque tissu cardiaque modifié, ou EHT, mélangez 100 microlitres de mélange de reconstitution avec trois microlitres de thrombine dans un tube de 200 microlitres. Et aliquote immédiatement 100 microlitres de ce mélange de thrombine EHT dans les fentes d’agarose. Utilisez un nouveau filtre pour chaque EHT.

Une fois que toutes les fentes ont été remplies de mélange de reconstitution, fermez le couvercle de la boîte de culture cellulaire et incubez les préparations pendant deux heures à 37 degrés Celsius et sept pour cent de dioxyde de carbone. A la fin de l’incubation, placez la plaque dans une hotte stérile et couvrez chaque puits avec 200 à 500 microlitres de milieu. Secouez doucement la plaque et remettez les EHT dans l’incubateur.

Après 10 minutes, transférez soigneusement les grilles dans une nouvelle plaque de 24 puits contenant 1,5 millilitre de milieu EHT par puits et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire dans les conditions de culture appropriées. Alimentation des EHT tous les lundis, mercredis et vendredis, en transférant les supports PDMS sur une deuxième assiette avec un milieu frais. Sept à 10 jours après le plâtre, les EHT doivent présenter des contractions spontanées déviant les montants des supports PDMS.

Pour analyser les contractions de l’EHT, le jour de l’expérience, il faut allumer le dispositif de chauffage de l’instrument d’analyse de l’EHT deux heures avant la mesure. Immédiatement avant l’analyse, allumez les alimentations gaz et électroniques du système d’axe. Pour un enregistrement de base, placez la plaque EHT dans l’instrument d’analyse EHT et démarrez le logiciel d’analyse de contraction conformément aux instructions du fabricant.

À l’aide des instructions du manuel du logiciel pour démarrer une nouvelle exécution, cliquez sur l’onglet protocole pour entrer les informations pertinentes sur l’étude. Ouvrez l’onglet Configuration et choisissez les puits à analyser. En raison de contraintes de temps, cela n’est démontré que pour deux EHT dans cette vidéo.

Cliquez ensuite sur l’onglet Vue de la caméra et démarrez le mode en direct de la caméra avec le mode de détection automatique des figures. Ajustez la position de la caméra avec les coordonnées xyz pour chaque puits sélectionné dans la parabole à 24 puits, en veillant à ce que chaque EHT soit au centre de la fenêtre et net. Assurez-vous que les croix bleues se trouvent aux extrémités supérieure et inférieure de l’EHT et qu’elles se déplacent pour correspondre aux contractions de l’EHT.

Et appuyez sur le bouton de position correcte pour enregistrer les positions configurées de chaque puits. Cliquez maintenant sur l’onglet paramètres pour définir les critères selon lesquels le logiciel identifie un pic de contraction, en marquant les pics avec des carrés verts. Enregistrez tous les paramètres saisis en appuyant sur le bouton d’utilisation des paramètres sur tous les puits.

Cliquez ensuite sur l’onglet automatique et le bouton de démarrage pour enregistrer les contractions EHT de base et calculer la contractilité de base spontanée pour chaque EHT. L’analyse des contractions en direct sera affichée dans l’onglet en temps réel. Assurez-vous que les croix bleues se déplacent uniquement verticalement pour correspondre aux contractions de l’EHT.

Pour analyser les effets d’un médicament d’intérêt spécifique sur les contractions, transférez d’abord une plaque de 24 puits remplie de solution thyroïdienne sans protéines sous une hotte stérile et placez des électrodes de carbone dans les puits. Transférez les EHT dans leurs racks PDMS au-dessus des électrodes et remettez les EHT dans l’incubateur. Après environ une demi-heure, placez les EHT dans l’interlock de l’instrument d’analyse EHT et enregistrez la contractilité spontanée de base pendant 20 secondes par EHT.

Ensuite, connectez les électrodes de carbone au câble de stimulation et commencez à stimuler électriquement les EHT. Enregistrez la ligne de base rythmée pendant 10 secondes par EHT, en veillant à ce que tous les EHT soient correctement rythmés. Le signal de stimulation est maintenant marqué par des lignes verticales bleues, incluses dans la greffe de contraction avant chaque pic.

Après l’enregistrement de base, transférez les électrodes et les racks PDMS sur une nouvelle plaque à 24 puits contenant la première concentration de médicament et remettez immédiatement les EHT dans l’emboîtement de l’instrument d’analyse EHT pour une incubation de 20 minutes. Rebranchez les câbles de stimulation, ajustez la reconnaissance des figures et enregistrez les contractions de l’EHT en réponse à la première concentration de médicament. Une fois que toutes les concentrations de médicament ont été testées, sauvegardez tous les enregistrements PDF résultants et vérifiez chaque enregistrement pour la reconnaissance des figures et le positionnement correct des carrés et des artefacts du pic de contraction.

Pour l’analyse hors ligne, cliquez sur sélectionner exécuter pour l’exécution correspondante dans la base de données des exécutions et, dans l’onglet des paramètres, modifiez le paramètre de l’analyse de contraction. Ensuite, dans l’onglet hors ligne, choisissez l’analyse hors ligne pour réanalyser les vidéos. Pour régler la reconnaissance des figures et enregistrer un nouveau fichier vidéo.

Ajustez la reconnaissance des figures dans l’onglet en temps réel et sélectionnez l’examen de l’échantillon. L’EHT va maintenant être analysé en fonction des nouvelles positions. L’analyse de chaque EHT est basée sur la reconnaissance des figures aux extrémités supérieure et inférieure du tissu.

Les contractions de l’EHT filmées sont ensuite analysées automatiquement par l’algorithme logiciel de l’instrument d’analyse EHT et les pics sont déterminés selon les critères prédéfinis pertinents. La mesure à long terme de l’analyse de la contraction EHT démontre qu’il n’y a pas de changements apparents en fonction du temps de la force de contraction, de la fréquence des battements, des temps de contraction T1 ou des temps de relaxation T2 jusqu’à 20 heures. Indiquant un haut niveau de stabilité pour les constructions.

En effet, les résultats pour chaque signal EHT sont reproductibles avec une faible variabilité. Cependant, l’exposition à un inhibiteur du canal hERG entraîne un allongement significatif du temps de relaxation de T2, à partir de la concentration. Et un battage irrégulier à des concentrations plus élevées.

Une fois maîtrisés, 24 EHT peuvent être générés en 30 minutes si la préparation est effectuée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la modélisation des maladies pour explorer l’effet des variantes génétiques in vitro. La polyvalence de ce modèle lui permet d’être combiné avec des cellules souches induites humaines ou la technologie d’édition du génome.

À la suite de cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que l’histologie ou l’analyse de l’ARN et des protéines peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires sur la transcription et l’expression des gènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de couler et d’analyser les EHT. Si vous avez des questions concernant cette procédure, n’hésitez pas à nous contacter directement.