Name: La purification de lADN de haut poids moléculaire Génomique de oïdium pour le séquençage de longue Lire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Apprenez à purifier l'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de conidies haploïdes d'oïdium pour le séquençage longue lecture. Cette méthode permet d'étudier les génomes fongiques complexes et les interactions plante-pathogène.

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Ce protocole a été développé à l’appui d’un projet de séquençage conjoint de l’Institut du génome et de la communauté (#1657). Le travail a été soutenu en partie par la Fondation Philomathia, la National Science Foundation (#0929226) et l’Energy Biosciences Institute à S. Somerville ; et par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (#310030_163260) à B. Keller. Nous tenons à remercier nos collègues, M. Figureroa et M. Miller (Université du Minnesota), R. Panstruga (Université RWTH d’Aix-la-Chapelle), C. Pedersen (Université de Copenhague), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Université de Californie à Berkeley), M. Wildermuth (Université de Californie à Berkeley), R. Wise (Université d’État de l’Iowa) et S. Xiao (Université du Maryland) pour leurs généreux conseils et pour avoir offert leurs protocoles lors de l’élaboration du protocole décrit ici.

1. Préparation du matériel Fungal <ol><li> De plus en plus oïdium <ol><li> Faire pousser des plantes dans des chambres de culture avec les conditions suivantes: 22 ° C Température de jour, température de 20 ° C la nuit, 80% d&#39; humidité relative, jour de longueur de 14 h et une intensité lumineuse de 125 uE / m2 / s (fournies par l&#39; éclairage fluorescent ). </li><li> Infectent plants de concombre (Cucumis sativa variété Champion Bush) avec la UCSC1 de souche Golovinomyces comme décrit 18, 29. </li></ol></li><li> La récolte oïdium conidies <ol><li> conidies de récolte de plantes infectées à 7 - 10 jours après l&#39;inoculation au moyen d&#39;un petit aspirateur avec une sur laquelle les conidies accumulent filtre (11 pm) en ligne. En appliquant une légère pression, exécuter la buse d&#39;aspiration le long de la surface de la feuille pour collecter les conidies. NOTE: Le rendement moyen de G. cichoracearum est de 20 mg de conidies à partir d&#39; un très infeDECCT feuille de concombre d&#39;environ 130 cm 2 de surface. </li><li> Brosser environ 150 mg de conidies (environ 375 ul de volume, ou conidies de 7-8 feuilles de concombre infectées) du filtre sur une feuille de papier propre. A partir de là, transférer conidies dans 2 ml cryotubes avec deux 5 / diamètre de 32 pouces pré-refroidie (dans de l&#39;azote liquide) billes de broyage en acier. retourner immédiatement tubes à l&#39;azote liquide. des tubes de conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Briser ouvert conidies par broyage à boulets <ol><li> des plaques d&#39;aluminium gel éclair de broyeur à billes dans de l&#39;azote liquide. Charge cryotubes dans le rack broyeur à boulets. agiter vigoureusement les cryotubes avec des boules de conidies et de l&#39;acier dans le broyeur à boulets pendant 30 s à 30 cycles / s (à température ambiante). Immédiatement recongeler cryotubes dans de l&#39;azote liquide. NOTE: Dans un premier temps, accéder à un échantillon de conidies par microscopie à grossissement 100X pour l&#39;efficacité de la rupture de la paroi cellulaire au cours du broyage. Si nécessaire, rectifier pendant encore 1 - 2 tours de 30 s pour 30 cycles / s, but garder le nombre de tours au minimum. une évaluation systématique de rupture conidies par microscopie à ce stade est inutile une fois que les conditions optimales ont été établies. </li></ol></li></ol> 2. Génomique de purification d&#39;ADN <ol><li> conidies lyse <ol><li> Travailler rapidement pour éviter conidies de décongélation, retirez les billes d&#39;acier de cryoampoules avec un aimant. Ajouter 700 ul 65 ° C tampon de lyse (tableau 1) et vortex 5 - 10 s jusqu&#39;à ce qu&#39;une pâte se forme. </li><li> Ajouter 300 ul préchauffé (65 ° C) 5% (v / v) de sarcosyle et inverser doucement pour mélanger (1 inversion par 3 s) cinq fois. Incuber les tubes pendant 30 minutes à 65 ° C; inverser doucement 3 fois à 10, 20 et 30 min. En utilisant une pointe de pipette de grand diamètre, transfert solution complète au nouveau tube de 2 ml. A toutes les étapes ultérieures, mélanger doucement, l&#39;inversion lente et transférer les solutions contenant de l&#39;ADN avec grand diamètre des embouts de pipette. </li></ol></li><li> Extraction de l&#39;ADN I <ol><li> Ajouter 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24: 1 v / v) à la solution de lyse et inverser doucement pour mélanger cinq fois. Incuber pendant 10 min à température ambiante, en inversant doucement pour mélanger cinq fois au niveau du point à mi-chemin et à nouveau à la fin de l&#39;incubation. Centrifuger à température ambiante pendant 15 min à 14 000 x g. Utilisation de la pointe de pipette de grand diamètre, transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 2 ml; éviter d&#39;inclure du contenu de l&#39;interface. </li></ol></li><li> ADN Précipitations I <ol><li> Ajouter 1 volume température ambiante 100% de l&#39;isopropanol (environ 750 pi) et inverser doucement pour mélanger six fois. Centrifuger à température ambiante pendant 15 min à 14 000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. </li><li> Ajouter 450 ul de pré-refroidie (-20 ° C) 70% d&#39;éthanol. Centrifuger pendant 5 minutes à la température ambiante à 14 000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s, retirez délicatement le surnageant avec une pointe de pipette fine et jeter. Sécher à l&#39;air la pastille pendant 15 min unt température ambiante. Ne pas sécher pendant plus de 15 min. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 300 ul de TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM d&#39;acide ethylene diamine tétra-acétique, pH 8,0). Incuber pendant une nuit à 4 ° C. tapotez doucement pour remettre en suspension tout matériau résiduel qui ne va pas dans la solution. </li></ol></li><li> Pour éliminer la contamination de l&#39;ARN, ajouter 10 pi RNase A (10 mg / ml). Retournez délicatement mélanger trois fois. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s. Incuber à 37 ° C pendant 2 h. </li><li> Extraction de l&#39;ADN II <ol><li> Ajouter 300 ul de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (25: 24: 1 v / v) et inverser doucement pour mélanger cinq fois. Incuber 10 min à température ambiante, en inversant doucement pour mélanger cinq fois à la mi-course et à nouveau à la fin de l&#39;incubation. Centrifuger 15 min à température ambiante à 14 000 x g. En utilisant une pointe de pipette de grand diamètre, transférer le surnageant à nouveau 1,5 ml microtube. </li></ol></li><li> ADN II Précipitations <ol><li> Ajouter 0,01 volume de 3 M à pH 5,2 d&#39;acétate de sodium (approximately 3 ul), inverser doucement pour mélanger cinq fois. Ajouter 2,5 volumes de pré-refroidie (-20 ° C) 100% d&#39;éthanol (environ 750 pi). Retournez délicatement pour mélanger cinq fois. Incuber pendant une nuit à -20 ° C </li><li> Centrifuger 30 min à 4 ° C à 14000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. </li><li> Ajouter 450 ul de pré-refroidie (-20 ° C) 70% d&#39;éthanol. Centrifuger pendant 5 minutes à 4 ° C à 14000 x g. Retirez délicatement le surnageant et le jeter. Centrifuger à 1000 g pendant 3 s. Retirez délicatement le surnageant avec une pointe de pipette fine et défausse. </li><li> Sécher à l&#39;air la pastille pendant 30-60 min à température ambiante. Remettre en suspension le culot dans 27,5 ul de TE. Incuber pendant une nuit à 4 ° C. tapotez doucement pour remettre en suspension tout matériau résiduel qui ne va pas dans la solution. </li><li> Aliquote de 2,5 ul dans 22,5 ul de TE (volume final 25 ul) pour les tests de contrôle de qualité (voir ci-dessous). Des échantillons d&#39;ADN de conserver à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la transmission pour le séquençage. Pour stockage à long terme, des échantillons de magasinà -80 ° C et réduire les cycles de gel-dégel pour éviter le cisaillement. REMARQUE: Faites attention lors de pipetage à cette étape que l&#39;ADN génomique de haut poids moléculaire peut être difficile à pipette, et il est important de veiller à ce que « QC aliquote » est une représentation précise de l&#39;échantillon d&#39;ADN génomique. </li></ol></li></ol> 3. Contrôle de la qualité <ol><li> Pureté échantillon <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un blanc TE, évaluer la pureté de l&#39;échantillon de l&#39;ADN en chargeant 1 pi du QC aliquote sur un spectrophotomètre petit volume. Enregistrez A260 / A280 et A260 / A230. Lectures L&#39;ADN pur aura un rapport A260 / A280 d&#39;environ 1,8 et A260 / A230 rapport entre 1,8 et 2,2. </li></ol></li><li> Quantification de l&#39;ADN génomique <ol><li> Effectuer la quantification de la portion aliquote QC en utilisant un kit de dosage de quantification d&#39;ADN double brin commercial conformément aux instructions du fabricant. </li></ol></li><li> ADN évaluation de la qualité I <ol><li> Charge d&#39;environ 60 ng d&#39;ADN génomique etEchelle d&#39;ADN sur un gel d&#39;agarose à 0,7% en TAE 1X (40 mM de Tris, 20 mM d&#39;acide acétique, et 1 mM d&#39;EDTA, pH 8,0). Appareil de gel de fonctionner à 70 V pendant 40 - 45 min jusqu&#39;à ce que les bandes d&#39;ADN génomique sont d&#39;environ 2 cm de la séparation de puits et la bande de l&#39;échelle est apparente. Ces conditions peuvent devoir être ajustée en fonction de l&#39;appareil d&#39;électrophorèse sur gel disponible. </li></ol></li><li> ADN qualité II Évaluation <ol><li> Charge d&#39;environ 60 ng d&#39;ADN génomique et une échelle d&#39;ADN de poids moléculaire élevé (adapté à l&#39;électrophorèse sur gel en champ pulsé) sur un gel d&#39;agarose à 1% dans 0,5 x TBE (44,5 mM de Tris, d&#39;acide borique 44,5 mM, EDTA 1 mM, pH 8,3) et exécuter dans un tampon de migration 0,5 x TBE en utilisant un 5 - Protocole d&#39;électrophorèse sur gel 80 de forme d&#39;onde kpb en champ pulsé pendant 16 h. </li></ol></li><li> Évaluation des bactéries, des champignons et des contaminants végétaux <ol><li> Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier les espaceurs transcrits internes (ITS) appropriées régions des gènes ribosomiques en utilisant des amorces et des conditions d&#39;amplification listeed dans le tableau 2. Charge: 10 ul de la réaction résultant sur un gel. NOTE: Une bande représentant le oïdium région ITS devrait être amplifié avec les amorces ITS fongiques. L&#39;ADN de ce amplicon et tout amplicon généré avec les bactéries, ou des amorces végétales doivent être séquencés pour déterminer l&#39;origine de la contamination. Seulement oïdium des séquences ITS doit être trouvée dans le amplicon fongique. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Afin d&#39;obtenir de l&#39; ADN pur, génomique de haut poids moléculaire de la obligatoire champignons de l&#39; oïdium biotrophe, une version modifiée de procédés décrits précédemment a été développé 30. Le rendement moyen en utilisant ce protocole optimisé est de 7 pg d&#39;ADN par 150 mg de conidies, un doublement du rendement obtenu avec un protocole antérieur. En outre, la taille moyenne est passée d&#39;environ 20 kbp à plus de 48,5 kbp. Ce protocole a été optimisé dans le système G. c...

<html> Oïdium sont un groupe de plantes fongique biotrophe obligatoire des agents pathogènes qui, lorsqu&#39;ils sont pris ensemble, sont la principale cause de maladies des plantes dans le monde entier 1. Il y a plus de 900 espèces décrites de l&#39; oïdium, qui ont été regroupées en cinq taxonomiquement tribus au sein de la famille Erisyphaceae 2. En raison de leur importance à la fois économique et la relation intime qu&#39;ils développent avec leurs hôtes, les maladies oïdium ont fait l&#39;objet de la recherche pour&gt; 100 ans. Lors de l&#39;infection, l&#39;oïdium provoquent des changements radicaux dans la structure cellulaire, le métabolisme et la biologie moléculaire de leurs hôtes, de bénéficier de ce pathogène. Cependant, l&#39;étude de l&#39; oïdium est particulièrement difficile en raison de leur mode de vie obligatoire, et la croissance du champignon en culture pure n&#39;a pas encore été décrit 3, 4, 5,&quot;xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Fiable, la transformation génétique stable de l&#39; oïdium a pas encore été accompli, bien que la transformation transitoire a été rapportée chez certaines espèces 9, 10. Le séquençage et l&#39;assemblage des génomes oïdium est avéré difficile en raison d&#39;un certain nombre de caractéristiques du génome lui-même. Génomes de l&#39; oïdium sont grandes (120-180 Mbp) par rapport à d&#39; autres génomes fongiques, et se composent de 60 - 90% des éléments répétitifs répartis uniformément 11. Ces éléments comprennent des répétitions terminales non-longues, ainsi que des éléments répétitifs non catégorisés. Deux formae d&#39;une Speciales seule espèce oïdium, Blumeria graminis f. sp. hordei et f. sp. tritici (BGH et Bgt, respectivement), ainsi que l&#39;oïdium de la vigne Erysiphe necator, ont abeillen séquencés, et les projets de génomes pour plusieurs autres ont été réalisées 12, 13, 14. Le caractère répétitif des génomes a fait l&#39; assemblage difficile, et le génome Bgh complété a été assemblé en 6,989 supercontigs avec un L50 de 2 Mb 12. Malgré le grand génome, les oïdium semblent avoir un petit nombre de gènes codant pour des protéines, avec 5,845 et 6.540 gènes prédits dans Bgh et Bgt, respectivement. Les oïdium séquencés semblent également manquer au moins 99 gènes essentiels qui sont essentiels dans d&#39; autres champignons, ce qui est cohérent avec la dépendance des champignons sur leur plante hôte pour la survie 11, 12, 13, 14. séquences répétitives proches de télomères, centromères, ribosomal RNA matrices de gènes et des régions enrichies en éléments transposables sont mal assemblés à partir de stratégies de séquençage courte lecture et sont souvent sous-représentés dans les assemblages de génome 15. Ces régions sont considérées comme responsables de bon nombre des lacunes qui se produisent dans des séquences du génome, et cela vaut pour les oïdium avec leur vaste expansion des éléments répétitifs 16. Très régions du génome plastique sont souvent trouvés dans ces régions répétitives 3. Ils servent un site de réarrangements chromosomiques et encodent souvent des gènes sous forte pression sélective, tels que les gènes codant pour des protéines effectrices et les gènes codant pour des enzymes du métabolisme secondaire. Les progrès des technologies de séquençage à long lecture seule molécule offrent une solution potentielle pour le séquençage à travers les régions répétitives des génomes 15. Par exemple, Faino et al. (2015) ont trouvé que l&#39;inclusion de longue séquence de lecture optique et des technologies mapping leur a permis de produire une séquence du génome de fente inférieure à deux souches de l&#39;agent pathogène des plantes fongique dahlia Verticillium, triplant la proportion de séquences d&#39;ADN répétitives dans le génome, ce qui augmente le nombre d&#39;annotations de gènes (et réduire le nombre d&#39;annotations de gènes partielles ou manquantes ) et le génome révélateur réarrangements 17. Pour utiliser ces technologies de séquençage de longue lecture, de fortes concentrations d&#39;ADN génomique de haute qualité, avec des tailles minimum&gt; 20 kbp, sont nécessaires. Nous décrivons ici nos méthodes de collecte conidies, la purification de l&#39; ADN à haut poids moléculaire de conidies et nos évaluations de contrôle de la qualité en utilisant la cichoracearum de l&#39;espèce de oïdium Cultivé sur le concombre 18. Ce protocole est basé sur un protocole développé dans le groupe B. laboratoire Keller (Université de Zürich, Zürich Suisse) 13, 19et comprend plusieurs modifications qui ont conduit à des rendements accrus d&#39;ADN et une proportion plus élevée d&#39;ADN&gt; 48,5 kpb de taille. Le protocole comprend également des mesures de contrôle de la qualité en fonction des recommandations du ministère américain de l&#39; énergie Joint Genome Institute 20, 21, 22. La fonction de chaque réactif inclus dans le tampon de lyse, et la justification de chaque étape de purification, sont tels que décrits dans Henry (2008) 23. Protocoles publiés disponibles pour l&#39; isolement de l&#39; ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de tissus végétaux et microbiens ont également été consultés lors de la conception de ce protocole 24, 25, 26, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 Broyeur à boulets</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>Ou broyeur à boulets équivalent</td></tr><tr><td>Tubes de 2 mL pour le broyage à boulets</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>Billes de fraisage en acier inoxydable 5/32"</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie 280 contrôlé par microprocesseur Préréglé à 65 &deg ; C&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>ou bain-marie équivalent</td></tr><tr><td>Bain-marie 280 contrôlé par microprocesseur Préréglé à 37 &deg ; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>Ou équivalent à bain d’eau</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R microcentrifugeuse réfrigérée</td><td>Krakeler Scientific&nbsp ;</td><td>38-022621807</td><td>ou microcentrifugeuse équivalente</td></tr><tr><td>Chlorform :IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>C0549</td><td>Dangereux en cas de contact cutané ou d’inhalation. Porter des gants en nitrile, des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et travailler avec une cagoule chimique</td></tr><tr><td>Phénol :Chloroforme :IAA (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Dangereux en cas de contact avec la peau ou d’inhalation. Portez des gants en nitrile, des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et travaillez avec une cagoule</td></tr><tr><td>chimique 100 % Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100 % éthanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>34923</td><td>Refroidir à -20 &deg ; C utilisation antérieure</td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, sans Dnase (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Métabisulfite de potassium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Laurylsacroinate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>Ou lunettes équivalentes</td></tr><tr><td>Gants en nitrile High Five COBALT, LARGE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>Ou gants équivalents</td></tr><tr><td>GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000x dans l’eau</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Dangereux en cas de contact avec la peau. Porter des gants en nitrile et des lunettes de protection</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Échelle d’ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb Normes de taille d’ADN CHEF</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>Ou équivalent en gel à champ pulsé aparatus</td></tr><tr><td>Papier filtre qualitatif Whatman, Grade 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>WHA1001042</td><td>Ou chambre de croissance équivalente</td></tr><tr><td>Chambre de croissance Percival</td><td></td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>Ou spectrophotomètre équivalent</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Diluer 1/50 avec de l’eau avant utilisation (à 1x)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA, 10x Solution (Électrophorèse)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Diluer 1/10 avec de l’eau avant utilisation (à 1x)</td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td> liquide <td>Azote liquide (-196 &deg ; C) est un risque de gel. Il se dilatera également rapidement lors du réchauffement et ne doit pas se conserver dans un récipient hermétiquement fermé</td></tr></tbody></table>

la purification de l&#39;adn de haut poids moléculaire génomique de oïdium pour le séquençage de longue lire

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Les champignons oïdium sont un groupe d&#39;agents pathogènes des plantes fongiques économiquement importantes. On sait peu de choses sur la biologie moléculaire et de la génétique de ces agents pathogènes, en partie en raison d&#39;un manque de ressources génétiques et génomiques bien développées. Ces organismes ont de grands génomes répétitifs, qui ont fait le séquençage du génome et de l&#39;assemblage prohibitive difficile. Nous décrivons ici les méthodes de collecte, de l&#39; extraction, la purification et l&#39; évaluation du contrôle de la qualité de l&#39; ADN génomique de haut poids moléculaire d&#39;une espèce de oïdium, Golovinomyces cichoracearum. Le protocole décrit comprend une rupture mécanique de spores suivi d&#39;un phénol optimisé / chloroforme extraction de l&#39;ADN génomique. Un rendement typique était de 7 pg d&#39;ADN par 150 mg de conidies. L&#39;ADN génomique est isolé en utilisant cette procédure est appropriée pour le séquençage de longue lecture ( par exemple,&gt; 48,5 kpb). mesures de contrôle de la qualité pour assurer la taille, le rendement et la pureté de l&#39;ADN génomique sont égalementdécrit dans le présent procédé. Le séquençage de l&#39;ADN génomique de la qualité décrite ici permettra l&#39;assemblage et la comparaison des génomes multiples de l&#39;oïdium, qui à son tour conduire à une meilleure compréhension et un meilleur contrôle de ce pathogène agricole.

Un exemple représentatif de 60 ng d&#39; ADN génomique purifié à partir de G. cichoracearum sur un gel d&#39; agarose en utilisant une électrophorèse sur gel et par électrophorèse sur gel en champ pulsé sont représentés sur les figures 1 et 2, respectivement. Des préparations d&#39;ADN génomique qui passent, passent légèrement et échouent le contrôle de la qualité sont représentés. Des préparations d&#39;ADN génomique qui passen...

décrit ici une méthode d’extraction, de purification et de contrôle de la qualité de l’ADN génomique de l’agent pathogène fongique biotrophe obligatoire, l’oïdium, pour une utilisation dans le séquençage du génome à lecture longue.

La purification de l&#39;ADN de haut poids moléculaire Génomique de oïdium pour le séquençage de longue Lire

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

L'objectif général de ce protocole est d'isoler de l'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de conidies haploïdes d'oïdium pour un séquençage génomique en longues lectures. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des champignons phytopathogènes, telles que la structure et la composition de génomes difficiles à étudier. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'extraction d'ADN génomique de haute qualité à partir d'un agent pathogène difficile à manipuler.Pour commencer l'expérience, retirez rapidement les billes d'acier des cryotubes contenant les conidies à l'aide d'un aimant. Ajoutez 700 microlitres de tampon de lyse à 65 degrés Celsius et vortexez la solution pendant cinq à dix secondes. Après cinq à dix secondes, une suspension est formée.Ajouter 300 microlitres de sarkosyl à 5 % volume/volume préchauffé à 65 degrés et retourner doucement cinq fois. Incuber les tubes pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette à embout large, transférer toute la solution dans un nouveau tube microcentrifuge de deux millilitres.Ajouter un volume de chloroforme isoamylique à la solution de lyse et retourner doucement le tube cinq fois pour mélanger. Incuber une durée de 10 minutes à température ambiante. Retourner doucement le tube cinq fois au point médian, puis à nouveau à la fin de l'incubation.Ensuite, centrifuger à température ambiante pendant 15 minutes. À l’aide d’une pipette munie d’une pointe large, transférer soigneusement la phase aqueuse dans un nouveau tube microcentrifuge de deux millilitres, en évitant d’inclure le matériau provenant de l’interface. Ajouter un volume de 750 microlitres d’isopropanol 100 % à température ambiante et retourner délicatement le tube six fois.Ensuite, centrifuger le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. Retirer soigneusement le surnageant et le jeter. Ajouter 450 microlitres d'éthanol à 70 % prérefroidi.Centrifuger le mélange pendant cinq minutes à température ambiante. Retirer soigneusement le surnageant et le jeter. Centrifuger à 1000 × g pendant trois secondes.Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette fine et jetez le surnageant. Séchez le culot à l’air pendant 15 minutes à température ambiante. Resuspendez le culot dans 300 microlitres de tampon TE. Incubez l’ADN toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain matin, agiter doucement pour resuspendre tout l'ADN qui n'est pas passé en solution. Pour éliminer la contamination par l'ARN, ajouter 10 microlitres d'ARNase. Retourner doucement le tube trois fois et centrifuger l'ADN à 1000 ×g pendant trois secondes.Incubez ensuite l'ADN à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez 300 microlitres de phénol-chloroforme-alcool isoamylique et inversez doucement cinq fois pour mélanger, puis incubez l'ADN pendant 10 minutes à température ambiante. Inversez doucement le tube pour mélanger l'ADN cinq fois à mi-incubation, puis à nouveau à la fin de l'incubation.Ensuite, centrifuger le tube pendant 15 minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette à embout large, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajouter trois microlitres d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2, puis inverser doucement le tube cinq fois.Ajouter 750 microlitres d'éthanol à 100 % prérefroidi et retourner doucement le tube cinq fois. Incuber une nuit à 20 degrés Celsius. Le lendemain matin, centrifuger le tube pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Retirez soigneusement et jetez le surnageant. Ajoutez 450 microlitres d'éthanol à 70 % prérefroidi. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir mis en pellet l'ADN, retirez soigneusement le surnageant. Faites une nouvelle centrifugation du tube à 1000 ×g pendant trois secondes afin de ramener le surnageant résiduel. Retirez le surnageant résiduel à l’aide d’une pipette à embout fin.Laisser sécher l'air du culot pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Après le séchage à l'air, resuspendre le culot dans 27,5 microlitres de TE. Le lendemain, retourner doucement pour resuspendre tout matériau résiduel qui ne s'est pas dissous. Prélever une aliquote de 2,5 microlitres dans 22,5 microlitres de TE pour les tests de contrôle qualité.Conserver les échantillons d'ADN à quatre degrés Celsius jusqu'à leur envoi pour séquençage. Pour une conservation à long terme, stocker les échantillons à 80 degrés Celsius et minimiser les cycles de congélation-décongélation afin d'éviter le cisaillement. À l'aide du protocole, de l'ADN génomique purifié a été utilisé pour réaliser une électrophorèse sur gel, permettant d'obtenir de l'ADN ayant passé le contrôle de qualité avec une bande unique intense supérieure à 20 kbp et une traînée minimale, de l'ADN donnant un résultat limite avec une bande unique supérieure à 20 kbp, et un résultat échoué présentant une traînée sous 20 kbp et incluant des fragments de 100 pb.Une électrophorèse sur gel en champ pulsé, ou PFGE, a été réalisée afin de distinguer un échantillon d'ADN acceptable, dont la majeure partie de l'ADN est supérieure à 48,5 kpb, d'un échantillon d'ADN marginal, dont la majeure partie de l'ADN se situe entre 20 et 48,5 kpb. Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que le séquençage à lecture longue sur molécule unique, peuvent être mises en œuvre pour répondre à des questions supplémentaires concernant le génome de l'oïdium.

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Apprenez à purifier l'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de conidies haploïdes d'oïdium pour le séquençage longue lecture. Cette méthode permet d'étudier les génomes fongiques complexes et les interactions plante-pathogène.

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