coupe de précision de la souris Tranches Lung pour visualiser les cellules vivantes pulmonaire dendritiques

L'objectif général de cette méthode est d'utiliser des tranches pulmonaires découpées avec précision, ou PCLS, afin de visualiser la localisation et le trafic de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que la localisation et les schémas de migration des cellules immunitaires dans le poumon. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer plusieurs interactions dans un tissu vivant ex vivo qui conserve l'architecture tridimensionnelle du poumon.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur la localisation et le trafic des cellules immunitaires pendant l'inflammation, elle peut également être utilisée pour visualiser la contraction des voies respiratoires et du tissu musculaire lisse. Pour prélever le tissu pulmonaire, utilisez d'abord des ciseaux pour ouvrir la peau et le péritoine depuis le milieu de l'abdomen jusqu'à la mâchoire d'une souris âgée de six à douze semaines, puis déplacez les intestins sur le côté de la cavité abdominale. Incisez la veine cave inférieure afin d'évacuer le sang des poumons, et utilisez la pointe effilée des ciseaux pour percer le diaphragme afin de permettre l'expansion de la cage thoracique.

Ensuite, utilisez une pince pour retirer manuellement les glandes salivaires et les autres tissus de la trachée, puis utilisez une pince fine pour pratiquer une incision sur la face antérieure de la bande de cartilage la plus épaisse, suffisamment grande pour permettre à une aiguille de calibre 20 de pénétrer. Faites maintenant glisser une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce sur un tronçon de tubulure en polyéthylène, et coupez la tubulure selon un angle d'environ 45 degrés. Fixez l'aiguille à une seringue d'un millilitre, puis aspirez 0,8 millilitre d'agarose à point de fusion basse à 2 %, à 40 degrés Celsius, dans la seringue.

Lorsque tout l'agarose a été chargé, insérez l'extrémité biseautée du tube dans l'incision et injectez lentement l'agarose dans les poumons. Sans déplacer l'aiguille ni la seringue, fixez la seringue avec du ruban adhésif sur la base en polystyrène afin de maintenir l'aiguille en place dans la trachée, puis placez l'animal au réfrigérateur à 4 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes. Une fois l'agarose solidifié, utilisez des ciseaux pour exciser soigneusement les poumons et placez-les dans une boîte de 3 centimètres contenant du PBS glacé.

Ensuite, tournez le lobe destiné à la découpe tissulaire de manière à ce que la section interne du poumon, qui se connecte à la trachée, soit orientée vers le bas. Pour découper le tissu pulmonaire, déposez d'abord une petite goutte de colle superglue All Purpose No Run sur le piston métallique d'une seringue, puis étalez la colle en effectuant un mouvement circulaire. Une fois toute la colle appliquée, utilisez une pince pour saisir immédiatement, mais délicatement, le lobe excisé par le côté de la trachée orienté vers le bas, puis tamponnez le lobe sur un morceau de papier pour éliminer l'excès de liquide.

Placer soigneusement le lobe séché sur le piston et couper tout tissu excédentaire qui dépasse du bord du piston. Abaisser le piston afin que les côtés de la seringue métallique remontent par-dessus le tissu, formant une cavité avec le poumon au fond de la tige de la seringue, d'une profondeur ne dépassant pas plusieurs centimètres. Fixer avec du ruban adhésif autour de la base de la seringue pour maintenir le piston en place.

Ensuite, versez soigneusement 40 degrés Celsius d'agarose à faible fusion à 2 % dans la seringue afin qu'elle recouvre juste le sommet du lobe, puis entourez la seringue métallique avec un bloc de refroidissement glacé. Après une à deux minutes, insérez la seringue contenant l'échantillon dans le coupeur automatisé et alignez la lame neuve. Ensuite, remplissez le réservoir de tampon avec du PBS glacé.

Alignez l'entraînement du moteur pas à pas avec la seringue contenant l'échantillon, puis retirez le ruban adhésif. Mettez l'interrupteur en position avance rapide, jusqu'à ce que l'entraînement du moteur pas à pas touche légèrement l'arrière du piston. Réglez l'épaisseur du tissu, le mode de coupe simple continue, l'oscillation et la vitesse sur le microtome.

Ensuite, appuyez sur démarrer et utilisez une spatule fine pour récupérer chaque PCLS au fur et à mesure qu’il tombe dans le réservoir tampon, en plaçant les tranches dans des puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant du PBS glacé. Pour l’imagerie statique des PCLS, transférez les échantillons pulmonaires contenant la région anatomique d’intérêt dans des boîtes individuelles de trois centimètres contenant un millilitre du mélange d’anticorps approprié désiré. Après 30 à 60 minutes sur glace, sous agitation et à l’abri de la lumière, rincez les tranches deux fois avec un millilitre de PBS glacé.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de PBS dans une nouvelle boîte ronde en verre de trois centimètres de diamètre par échantillon, puis transférez rapidement les tranches dans chaque goutte, en manipulant délicatement les fragments de tissu afin qu’ils s’étalent à plat. Aspirez ensuite le PBS à l’aide d’une pipette, déposez une goutte de milieu de montage à température ambiante sur la lame, puis ajoutez une lamelle en verre. Pour imager le tissu, placez la boîte sur la platine d’un microscope confocal sous un objectif 20x, et utilisez l’outil de mosaïquage pour localiser et marquer les bords du tissu dans le réglage d’enveloppe convexe afin de réduire la durée du balayage en mosaïque.

Ensuite, définissez la plage de z-stacks, en veillant à ce que les plages réglées soient adaptées à plusieurs zones de la coupe, en particulier le long des bords. Pour l'imagerie de cellules vivantes, après 30 minutes d'incubation dans le mélange d'anticorps d'intérêt, rincez les tranches deux fois avec un millilitre de Leibovitz 10 froid. Ajoutez ensuite 50 microlitres de Leibovitz 10 frais dans une alvéole de la lame à cavité par échantillon, puis transférez immédiatement chaque PCLS dans le milieu, en manipulant délicatement les tissus jusqu'à ce qu'ils soient complètement à plat.

Ensuite, utilisez une pipette pour aspirer le milieu de chaque chambre et fixer chaque PCLS avec un poids en platine. Ajoutez délicatement, à l’aide d’une pipette, de la matrice extracellulaire fraîchement préparée et refroidie sur glace sur chaque PCLS, en veillant à ce que le gel soit déposé au-dessus des tranches de poumon et que les tranches ne flottent pas au-dessus du gel. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, transférez la lame dans une chambre de microscope confocal préchauffée, réglée à 37 degrés Celsius, sous un objectif 20x.

Ensuite, définir les plages de pile z et de tuiles en fonction de l'intervalle souhaité entre les images, en utilisant l'outil de tuilage pour délimiter la zone d'intérêt dans le tissu, et le paramètre de grille centrée pour centrer l'échantillon dans le champ de vision. Les cellules dendritiques conventionnelles de phénotype CD11b élevé se localisent dans le parenchyme pulmonaire, tandis que les cellules dendritiques conventionnelles positives pour CD103 résident principalement autour des voies respiratoires et dans la région sous-pleurale. Une double coloration pour CD88 et CD172a permet de distinguer les macrophages alvéolaires CD172a négatifs et CD88 positifs des macrophages interstitiels CD172a positifs et CD88 positifs, ces derniers étant préférentiellement localisés dans le parenchyme et non dans la zone sous-épithéliale.

La double marquage pour CD90.2, un marqueur bien connu des lymphocytes T, et la protéine fluorescente TdTomato, un transgène placé sous le contrôle transcriptionnel d'un facteur de transcription maître nécessaire à la lymphangiogenèse, facilite l'identification des structures lymphatiques dans le poumon. Les cellules dendritiques conventionnelles positives pour CD103 se trouvent dans plusieurs régions anatomiques, notamment l'épithélium des voies respiratoires exprimant CD324, les vaisseaux lymphatiques et la région sous-pleurale. Les déplacements cellulaires ainsi que les interactions entre cellules peuvent être enregistrés par imagerie de cellules vivantes, comme vient de l'illustrer la démonstration.

Par exemple, dans l'expérience représentative, 16 heures après l'installation orale d'ova-LPS, des cellules dendritiques positives pour CD103 peuvent être clairement observées interagissant avec des lymphocytes T spécifiques de l'ova transférés de façon adoptive pendant une période de quatre heures. Une fois maîtrisées, la préparation des tissus et les techniques de découpe peuvent être réalisées en deux heures et demie si elles sont effectuées correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien insuffler l'agarose dans les poumons et de maintenir par la suite les tranches pulmonaires délicates aussi plates que possible pour l'imagerie.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, comme le traitement des tranches pulmonaires précisionnées (PCLS) par de l'acétylcholine ou de la méthacholine, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la signalisation calcique et la contractilité des voies respiratoires dans diverses conditions pathologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire des tranches pulmonaires coupées avec précision pour visualiser la localisation, le trafic et les interactions des cellules immunitaires dans le poumon.