Utilisation d'une méthode immunohistochimique intégrale pour étudier l'inervation du tractus biliaire dans

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une coloration immunohistochimique sur coupe entière pour visualiser la distribution des nerfs dans le tractus biliaire de Suncus murinus. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la distribution nerveuse des organes viscéraux de nombreuses espèces, en particulier des organes irréguliers ou de petite taille difficiles à évaluer par des méthodes classiques. Les principaux avantages de cette technique sont la simplicité de l'opération.

Elle ne nécessite pas de procédures compliquées et présente un taux de réussite élevé. Yidan Dai, étudiante diplômée, et Shuang-Qin Yi, chercheuse associée, tous deux de mon laboratoire, vont démontrer la procédure avec moi. Commencez par perfuser l'animal avec du PBS individuel et du paraformaldéhyde à 4 % dans une hotte aspirante.

Ensuite, injecter deux à trois millilitres de latex de néoprène blanc par le cathéter de perfusion dans l'aorte abdominale afin de marquer les vaisseaux sanguins. Une fois que tous les tissus d'intérêt ont été marqués, extraire les organes abdominaux ainsi que les nerfs et vaisseaux associés. Puis, injecter environ 0,1 millilitre de latex de néoprène bleu dans la vésicule biliaire pour marquer le système biliaire et effectuer une post-fixation des tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant toute la nuit à quatre degrés Celsius en vue d'une immunomarquage en montage entier.

Le lendemain matin, transférez l'échantillon dans un flacon en verre pour quatre lavages d'une heure à température ambiante dans de l'eau distillée sur un agitateur rotatif. Après le dernier lavage, incubez les tissus dans de l'acide orthopériodique fraîchement préparé à 1 % pendant 20 minutes à température ambiante afin d'éviter toute réaction peroxydasique intrinsèque. Ensuite, lavez l'échantillon dans de l'eau distillée pendant 10 minutes à température ambiante, puis incubez-le dans du papillon fraîchement préparé à 0,004 % pendant deux heures dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec un mouvement doux de basculement.

À la fin de l'incubation, laver l'échantillon avec de l'eau distillée pendant 50 à 60 minutes. Ensuite, conserver les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, laver l'échantillon dans de l'eau distillée comme vient de l'être démontré, suivi d'une autre incubation de deux heures dans du papillon fraîchement préparé.

Lavez l'échantillon pendant encore 50 à 60 minutes dans de l'eau distillée, puis fixez-le toute la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 %. Le troisième jour au matin, lavez les tissus quatre fois dans de l'eau distillée, puis immergez-les dans trois incubations successives de saccharose à durée croissante de 30 minutes chacune. Ensuite, congélez l'échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes, puis décongelez-le complètement à température ambiante.

Après le troisième cycle de congélation-dégel, transférez l'échantillon dans du Triton X-100 à 2 % pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, transférez l'échantillon dans un récipient contenant l'anticorps primaire d'intérêt et agitez doucement sur un nutateur à quatre degrés Celsius pendant trois à six jours, selon la taille du spécimen. Après la période d'étiquetage appropriée, éliminez l'anticorps primaire non lié par quatre lavages d'une heure chacun dans du PBS à température ambiante, puis étiquetez le spécimen avec l'anticorps secondaire approprié pendant trois jours, en agitant doucement à quatre degrés Celsius.

À la fin de la période de marquage par l'anticorps secondaire, laver l'échantillon quatre fois dans du PBS. Incuber ensuite les tissus dans 10 microlitres de peroxyde d'hydrogène à 30 % dans 100 millilitres de solution de coloration DAB à 0,002 % fraîchement préparée, à quatre degrés Celsius pendant 16 à 72 heures sous agitation douce. Lorsque l'intensité de coloration optimale est atteinte, transférer l'échantillon dans du PBS contenant de l'azoture de sodium à 0,04 % pour arrêter la réaction de coloration.

Ensuite, immergez soigneusement l'échantillon dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du PBS frais et capturez des images en montage complet des tissus à l’aide d’une caméra montée sur un microscope stéréo. En complément de la visualisation de l’innervation du conduit biliaire extra-hépatique, le marquage par un anticorps dirigé contre les fibres nerveuses positives pour les neurofilaments permet également l’identification sans ambiguïté du trajet et de la densité de distribution du nerf vague le long de l’œsophage et jusqu’à l’estomac. Le marquage des vaisseaux sanguins de la vésicule biliaire avec du latex néoprène blanc révèle des fibres nerveuses minces en fort contraste avec les tissus environnants, une densité d’innervation plus élevée étant observée au niveau du col de la vésicule biliaire par rapport au fondus.

Dans le cholédoque supérieur, deux types de faisceaux nerveux sont mis en évidence : les fins faisceaux nerveux qui forment un réseau nerveux irrégulier et dense, s'étendant de manière adhérente sur et dans les voies biliaires, et les faisceaux nerveux plus épais, distribués parallèlement à la surface des voies biliaires. La coloration du cholédoque avec un latex néoprène bleu et des vaisseaux avec un latex néoprène blanc permet de visualiser les fines fibres nerveuses au niveau de l'extrémité du cholédoque et de la région de la papille duodénale. Avant de réaliser cette procédure, veillez à planifier attentivement le déroulement temporel de chaque expérience, car l'ensemble du processus nécessite deux à trois semaines pour être achevé.

Pour éviter d'endommager l'échantillon lors du changement des solutions, versez toujours les solutions au lieu de retirer l'échantillon avec des pinces. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'appliquer cette technique au marquage d'une variété de nerfs dans divers organes viscéraux.