Utilisation d'une méthode immunohistochimique intégrale pour étudier l'inervation du tractus biliaire dans Suncus murinus

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la coloration immunohistochimique de l’ensemble du mont pour la visualisation de la distribution nerveuse dans les voies biliaires de Suncus murinus. Cette méthode peut être utilisée pour analyser la distribution nerveuse des organes viscéraux de nombreuses espèces, en particulier les organes irréguliers ou petits qui sont difficiles à évaluer par des méthodes standard. Les principaux avantages de cette technique sont que l’utilisation est simple.

Il ne nécessite pas de procédures compliquées et il a un taux de réussite élevé. Yidan Dai, un étudiant diplômé, et Shuang-Qin Yi, un chercheur de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi. Commencez par rincer l’animal avec des perfusions individuelles de PBS et de paraformaldéhyde à 4 % dans une sorbonne.

Injectez ensuite deux à trois millilitres de latex de néoprène blanc à travers le cathéter de perfusion dans l’aorte abdominale pour marquer les vaisseaux sanguins. Et lorsque tous les tissus d’intérêt ont été marqués, extrayez les organes abdominaux et leurs nerfs et vaisseaux associés. Ensuite, injectez environ 0,1 millilitre de latex de néoprène bleu dans la vésicule biliaire pour marquer le système biliaire et post-fixez les tissus dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit à quatre degrés Celsius pour une immunocoloration complète.

Le lendemain matin, transférez l’échantillon dans un flacon en verre pour quatre lavages d’une heure à température ambiante dans de l’eau distillée sur un nutator. Après le dernier lavage, incubez les tissus dans de l’acide orthopériodique à 1 % fraîchement préparé pendant 20 minutes à température ambiante pour éviter toute réaction intrinsèque de peroxydase. Ensuite, lavez l’échantillon dans de l’eau distillée pendant 10 minutes à température ambiante, suivi d’une incubation dans du papillon à 0,004 % fraîchement préparé pendant deux heures dans un bain-marie à température constante de 37 degrés Celsius avec un léger balancement.

À la fin de l’incubation, laver l’échantillon à l’eau distillée pendant 50 à 60 minutes. Conservez ensuite les mouchoirs dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, laver l’échantillon dans de l’eau distillée comme nous venons de le démontrer, suivi d’une autre incubation de deux heures dans un papillon fraîchement préparé.

Lavez l’échantillon pendant encore 50 à 60 minutes dans de l’eau distillée, puis fixez-le pendant une nuit dans du paraformaldéhyde à 4 %. Le troisième matin, laver les tissus quatre fois dans de l’eau distillée, puis les immerger dans trois incubations successives ascendantes de 30 minutes de saccharose. Congelez ensuite l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes, puis décongélation complète à température ambiante.

Après le troisième cycle de congélation-décongélation, transférez l’échantillon dans du Triton X-100 à 2 % pour une incubation de quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, transférez l’échantillon dans un récipient contenant l’anticorps primaire d’intérêt pour le balancer doucement sur le nutateur à quatre degrés Celsius pendant trois à six jours selon la taille de l’échantillon. Après la période de marquage appropriée, retirer l’anticorps primaire non lié en quatre lavages d’une heure dans du PBS à température ambiante et étiqueter l’échantillon avec l’anticorps secondaire approprié pendant trois jours en le balançant doucement à quatre degrés Celsius.

À la fin de la période de marquage secondaire des anticorps, laver l’échantillon quatre fois dans du PBS. Ensuite, incubez les tissus dans 10 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % dans 100 millilitres de solution de coloration à 0,002 % DAB fraîchement préparée à quatre degrés Celsius pendant 16 à 72 heures avec un léger balancement. Lorsque l’intensité de coloration optimale a été atteinte, transférez l’échantillon dans de l’azoture de sodium à 0,04 % dans du PBS pour arrêter la réaction de coloration.

Ensuite, plongez soigneusement l’échantillon dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du PBS frais et capturez des images montées entières des tissus à l’aide d’une caméra montée sur un stéréomicroscope. En plus de la visualisation de l’innervation des voies biliaires extrahépatiques, le marquage avec des anticorps contre les fibres nerveuses positives aux neurofilaments permet également d’identifier sans ambiguïté la densité de course et de distribution du nerf vague le long de l’œsophage et dans l’estomac. Le marquage des vaisseaux sanguins de la vésicule biliaire avec du latex de néoprène blanc révèle une fibrose nerveuse mince en fort contraste avec les tissus environnants avec une densité d’innervation plus élevée observée dans le col de la vésicule biliaire que dans le fond d’œil.

Dans le canal biliaire supérieur, deux types de faisceaux nerveux sont marqués, les faisceaux nerveux fins qui forment un réseau irrégulier et dense de nerfs et courent de manière adhésive résidant sur et dans les voies biliaires et les faisceaux neuraux plus épais qui sont répartis parallèlement à la surface des voies biliaires. L’étiquetage du canal cholédoque avec du latex de néoprène bleu et des vaisseaux avec du latex de néoprène blanc permet de visualiser les fines fibres nerveuses à l’extrémité du canal cholédoque et la zone de la papille duodénale. Avant d’essayer cette procédure, assurez-vous de jouer le calendrier de chacune des expériences, car l’ensemble du processus nécessite deux à trois semaines pour être terminé.

Pour éviter d’endommager l’échantillon lors du changement des solutions, versez toujours les solutions au lieu de retirer l’échantillon avec une pince. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’appliquer cette technique à l’étiquetage d’une gamme de nerfs au sein de divers organes viscéraux.