Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

L’objectif général de ces procédures est d’étudier comment les changements dans l’expression des gènes, que ce soit dans les cellules en développement ou dans leur environnement, influencent les processus temporels au cours du développement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés, telles que la question de savoir si le moment de la spécification du destin est contrôlé par des gènes exprimés de manière autonome dans une cellule ou de manière non autonome dans les cellules voisines. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à suivre des cellules progénitrices individuelles chez un vertébré in vivo, car les cellules se développent dans des environnements génétiquement distincts.

Stefanie Dudczig, une assistante de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir préparé des embryons de poisson-zèbre, ainsi que des aiguilles de micro-injection avec des Morpholinos, ou ARNm, selon le protocole de texte, plongez la pointe de l’aiguille dans une goutte d’huile minérale dans un plat. Mesurez le volume d’injection en appuyant sur la pédale et ajustez la pression du gaz et/ou la durée jusqu’à ce que le volume d’injection soit équivalent à un nanolitre, mesuré avec une glissière micrométrique, ou alternativement, avec le réticule de l’oculaire.

Placez une lame de microscope dans une boîte de Pétri et, à l’aide d’une pipette de transfert, déposez des embryons au stade unicellulaire le long du bord de la lame. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert fine, prélevez le plus de liquide possible pour éviter les mouvements lors des injections. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette Microloader avec la moitié de la pointe fine coupée, alignez les embryons en une seule colonne.

Ensuite, abaissez l’aiguille vers un embryon au stade unicellulaire et pénétrez le chorion et le jaune d’un seul coup doux. Une fois que la pointe de l’aiguille est centrée dans le jaune, appuyez une fois sur la pédale et microinjectez un nanolitre d’ARNm H2AGFP ou H2BRFP dans le jaune de l’embryon à un stade. Retirez l’aiguille d’injection, déplacez la boîte contenant les embryons pour mettre l’embryon suivant en position et continuez à injecter jusqu’à ce que toute la colonne d’embryons soit injectée.

Après avoir injecté tous les embryons, inclinez la boîte à un angle de 30 à 45 degrés et utilisez un léger jet de milieu E3 dans un flacon compressible pour transférer les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Pétri propre. Trois heures après la fécondation, sous un microscope fluorescent à un grossissement de 2X à 5X, utilisez un filtre RFP pour vérifier le signal de marquage des embryons du donneur. Sélectionnez des embryons bien développés avec un fort signal fluorescent

Après avoir préparé les plaques d’injection et les boîtes de Pétri conformément au protocole de texte, coupez l’extrémité d’une pipette Pasteur à pointe de verre de forme longue et finement tirée à une longueur qui permet une manœuvre confortable en utilisant un couteau diamanté pour gratter l’aiguille tout en la faisant pivoter jusqu’à ce que la pointe tombe. Assurez-vous que la coupe est droite. Ensuite, afin de ne pas endommager les embryons déchorionnés, polissez au feu la pipette de transfert en verre en faisant pivoter la surface coupée dans un bec Bunsen pour générer des extrémités lisses.

Pour déchotionner les embryons, placez les embryons hôtes et donneurs bien développés dans deux béchers en verre Erlenmeyer séparés de 10 millilitres et retirez autant de liquide que possible. Ajoutez 5 millilitres de la solution de protéase de 0,5 milligramme par millilitre précédemment préparée dans chaque bécher et faites doucement tourner les embryons tout en les regardant au microscope de dissection. Tout en continuant à tourbillonner, dès que le premier embryon est sorti du chorion, utilisez le milieu E3 pour effectuer trois rinçages rapides afin d’éliminer la solution de protéase en versant la majeure partie du liquide, et remplissez le bécher en versant doucement de l’E3 sur le côté.

Arrêtez la déchérionation enzymatique par un rinçage rapide mais doux dès que les premiers embryons déchotionnés peuvent être observés. Pour les transplantations, choisissez uniquement des embryons déchorionnés qui ont une masse cellulaire symétrique et sans déformations évidentes ou dommages au vitellus. Pour effectuer une transplantation de blastula, montez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez-la au tube de la plate-forme de transplantation.

Testez l’étanchéité en actionnant manuellement la seringue pour aspirer le liquide à l’intérieur et à l’extérieur de l’aiguille. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre, transférez les embryons du donneur dans la première colonne du moule d’agarose. Transférez ensuite les embryons hôtes dans les colonnes deux à six du moule d’agarose.

Posez doucement l’aiguille de transplantation sur les cellules de blastomère d’un embryon de donneur et aspirez lentement environ 20 à 50 cellules dans l’aiguille de transplantation. Évitez de prélever le jaune. À l’aide du micromanipulateur, soulevez l’aiguille de transplantation de l’embryon du donneur.

Déplacez la boîte d’injection vers la gauche et insérez la pointe de l’aiguille de transplantation à travers le côté de la masse cellulaire, dans le pôle animal du premier embryon hôte. Déposer cinq à 10 cellules près de la surface selon une cartographie du destin montrant que cette zone donne naissance au champ oculaire du cerveau antérieur. Pour monter les embryons pour l’imagerie, aspirez un maximum de cinq embryons dans une pipette de transfert en plastique et laissez les embryons s’accumuler dans la pointe par gravité.

Touchez la pipette de transfert sur la surface d’un tube en plastique préalablement préparé contenant 1 % d’agarose à bas point de fusion, permettant aux embryons de s’enfoncer dans le tube tout en limitant la quantité de transfert d’E3. Ensuite, transférez les cinq embryons du tube en plastique d’agarose dans une boîte de Pétri avec 0,5 à un millilitre d’agarose, et à l’aide de la même pipette de transfert, retirez l’excès d’agarose de sorte qu’il ne reste qu’une petite goutte. À l’aide d’une pipette de micro-charge dont l’extrémité est cassée, alignez les embryons latéralement, jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.

Continuez ensuite à monter jusqu’à cinq embryons à la fois, en gouttes d’agarose individuelles. Si vous effectuez une imagerie avec un microscope droit, évitez de placer les embryons à moins d’un centimètre de la circonférence de la boîte de Pétri. Utilisez 1 % d’agarose à bas point de fusion supplémentaire pour joindre les gouttes d’agarose les unes aux autres sur le côté de la boîte afin d’éviter tout délogement et mouvement latéral pendant l’imagerie.

Choisissez des embryons qui ont le bon angle de montage et un rythme cardiaque fort, et quelques cellules de donneur transplantées principalement dans le quadrant ventral antérieur de la rétine en développement où la vague d’expression génique commence. Effectuer l’imagerie selon le protocole texte. Comme le montre cette figure, la micro-injection d’un nanolitre d’ARNm dans le jaune d’embryons au stade unicellulaire entraîne l’expression de la protéine rapporteure fluorescente trois heures après la fécondation, stade auquel les donneurs les plus brillants sont sélectionnés.

24 heures après la fécondation, les embryons avec des cellules de donneur transplantées dans les endroits rétiniens pertinents ont été soumis à une imagerie en accéléré pendant 16 à 24 heures. Cette image confocale d’une seule section Z optique montre la superposition du champ clair dans les canaux rouges au niveau de l’œil en développement, avec quelques cellules donneuses marquées en rouge dans un environnement hôte autrement non marqué. Ces micrographies proviennent de l’imagerie en accéléré des cellules de donneurs de type sauvage en développement à partir d’embryons transgéniques atoh7 :gapGFP transplantés dans un hôte de type sauvage non marqué.

Le début de l’expression du transgène est indiqué pour quelques cellules, comme on le voit ici. Une fois maîtrisées, les micro-injections peuvent être effectuées en deux heures, et la sélection, la préparation et la transplantation embryonnaires peuvent être réalisées en trois heures le même jour. À la suite ou en parallèle de ces procédures, nous pouvons également fixer des embryons à des âges spécifiques pour une analyse post-mortem.

Par exemple, nous pouvons quantifier les proportions de cellules de donneurs qui expriment un certain gène ou protéine, qui ont une morphologie spécifique ou qui ont migré vers un certain endroit. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de manipuler génétiquement les embryons de poisson-zèbre et de générer des chimères entre un donneur et un hôte génétiquement distincts. Vous devriez également être en mesure de monter les embryons pour l’imagerie time-lapse in vivo afin de répondre à des questions qui ne peuvent pas être répondues dans les tissus fixés.