Name: Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de lactivité enzymatique G4 Resolvase1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez une méthode de purification de la G4 Resolvase1 par affinité G-quadruplex ADN utilisant une étape dépendante de l'ATP. Cette technique isole une enzyme catalytiquement active pour divers essais biochimiques in vitro.

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<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
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<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
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<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
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<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole représente une expression, la purification et la quantification schéma très efficace pour l&#39;isolement du produit génique DHX36, G4 Resolvase1 (G4R1, appelé aussi Rhau et DHX36) (figure 1). Ce protocole utilise deux étapes de purification: His-tag purification par affinité sur des billes d&#39;affinité de cobalt et de purification enzymatique sur des billes G4-ADN conjugué. Cette dernière étape est unique en ce qu&#39;il tire parti de l&#39;affinité serré, une spécificité élevée, et l&#3...

structures G4 sont des structures secondaires d&#39;acides nucléiques très stables qui se forment dans les régions riches en guanine de l&#39;ADN et de l&#39;ARN. Structures G4 sont stabilisées par des interactions Hoogsteen-liaison et coordonner la liaison au sein de la cavité centrale avec des cations monovalents (ie. K + et Na +) qui contribuent de manière significative à la stabilité thermique remarquable des structures G4 1, 2. Des études précoces de bioinformatique ont suggéré que le génome humain contient&gt; 375.000 &quot;motifs G4 formation potentiels&quot; 3, 4. Les estimations des études plus récentes indiquent que le nombre de motifs G4 est plus élevé par un facteur de 2 à 5 mai, tandis qu&#39;une autre étude prévoit 716,310 séquences G4 formant potentiels distincts dans le génome humain 6. G4-formation de séquences sont évolutivement conservée et non dispersé de façon aléatoire dansle génome. Motifs G4 sont enrichis dans les régions codantes de gènes, et vers le haut de 40% de tous les promoteurs de gènes contiennent G4 motifs 7. Chose intéressante, le degré d&#39;enrichissement des motifs G4 dans un gène a été démontrée pour suggérer la fonction du gène. Par exemple, les proto-oncogènes et les gènes impliqués dans le développement ont significativement plus enrichissement des structures G4 que les gènes suppresseurs de tumeur 8, 9. Avec stabilités thermiques élevées, une présence presque omniprésente dans tout le génome, et le potentiel d&#39;affecter de manière significative les principaux processus cellulaires, il est surprenant de constater que la cellule a évolué enzymes pour gérer ces structures. Une telle enzyme est G4 Resolvase1 (G4R1; également appelé Rhau et DHX36), que nous caractérisons comme la source de la majorité des activités de résoudre G4-ADN tétramoléculaire dans (HeLa) des cellules humaines 10. Depuis lors, il a été montré that G4R1 étroitement lie et catalytiquement G4-ADN déroule tétramoléculaire et unimoléculaire et G4-ARN avec les plus serrés KD rapportés pour une protéine G4 de liaison 11, 12, 13. En outre, l&#39;activité de G4-résolution des G4R1 a été impliquée dans un large éventail de processus biochimiques et cellulaires, y compris télomère / télomérase biologie 11, 14, 15, 16, de la transcription et de l&#39; épissage 17, 18, 19, 20, le développement 21, de l&#39; hématopoïèse 21 et immunitaire régulation 22, 23. Avec une prépondérance de séquences G4 spécifiquement situé dans le génome et la diversité cellulaire processus que G4R1 a récemment été impliqué d&#39;être impliqué, la capacité d&#39;exprimer et efficacement purifier très actif rG4R1 sera de la plus haute importance pour élucider les mécanismes biochimiques et les comportements de cette protéine. Ici, nous démontrons une expression nouvelle et système de purification (Figure 1) qui tire profit de l&#39;activité dépendant de l&#39; ATP G4-résolution des rG4R1 pour isoler efficacement enzyme active. Ce système pourrait être adapté pour purifier d&#39;autres enzymes d&#39;acide nucléique dépendant de l&#39;ATP pour lequel le produit de la réaction enzymatique est plus un substrat pour la liaison, comme cela est le cas pour G4R1.

<table><tbody><tr><td>Plasmide TriEx4-DHX36</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)plysS cellules compétentes</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Terrific Bouillon</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &micro ; g/mL dans des plaques bactériennes/grandes cultures</td></tr><tr><td>Carbenicilline (culture de cellules végétales testées)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro ; g/mL dans des plaques bactériennes/de grandes cultures</td></tr><tr><td>Isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme (à partir de blanc d’œuf de poule)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td>1963-B</td><td>ou de source standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td>1966</td><td>ou de source standard</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Pour coulée de gel de résolution (pour gel de quantification des protéines) ; D’après la source standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6,8</td><td></td><td></td><td>Pour couler du gel d’empilement (pour le gel de quantification des protéines) ; De source standard</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acétate, pH 7,8</td><td>Universal Scientific Supply Co.</td><td>1981</td><td>ou de source standard</td></tr><tr><td>70 % d’éthanol</td><td></td><td></td><td>De source standard</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (1&nbsp ; M solution)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td>1665</td><td>ou de source standard</td></tr><tr><td>&bêta ;-mercaptoéthanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Hémisulfate de leupeptine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Billes paramagnétiques de streptavidine</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp ;</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td>0718</td><td>ou à partir d’une source standard</td></tr><tr><td>0,2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td></td><td>À partir d’une source standard ; ajustez d’abord le pH avec du NaOH, puis ajustez le pH à la baisse avec du HCl. &nbsp ;</td></tr><tr><td>A-lactalbumine (type 1 du lait de vache)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Perles d’affinité cobalt métal</td><td>Clonetech</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5'-triphosphate (de source bactérienne)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis solution (37.5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>pour faire un gel protéique tampon courant (192 mM de glycine, 25 mM Tris Base, 0.1 % SDS)</td></tr><tr><td>10 % Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp ;</td><td>1667</td><td>pour fabriquer un tampon de gel protéiné (192 mM de glycine, 25 mM de base Tris, 0,1 % SDS) ; ou à partir d’une source standard</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>ou à partir d’une</td></tr><tr><td>base Tris</td> standard <td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>pour fabriquer un tampon de gel protéique (192 mM de glycine, 25 mM de base Tris, 0,1 % SDS) ; De source standard</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Broad Range Protein MW markers</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Z33 oligo (« Z33-Bio »)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GGG GAA TTC GGA CCT-Biotine 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligo (« Z33-TAM »)</td><td>Oligos Etc</td><td></td><td>5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Plaque TLC recouverte de fluor</td><td>Life Technologies</td><td>AM10110</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30 % en H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Lampe</td><td></td><td></td> UV multibande <td>Capable d’émettre de la lumière UV à 365 nm</td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table (avec rotor à godets oscillants)</td><td></td><td></td><td>Capable d’être refroidi à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td>Capable d’être refroidie à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sonificateur numérique</td><td>Branson</td><td></td><td>Ou équivalent capable de fournir des impulsions de sonication (30 % d’amplitude, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &deg ; C bain-marie</td><td></td><td></td><td>Pour la formation de Z33 en quadruplex</td></tr><tr><td>37 &deg ; C incubateur pour bactéries</td><td></td><td></td><td>Pour les transformations bactériennes et la croissance initiale pendant la nuit de grandes cultures de Rosetta2 E. coli transformées avec TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg ; C/14&nbsp ; &deg ; C Incubateur à agitation pour bactéries</td><td></td><td></td><td>Pour la croissance et l’induction protéique de grandes cultures de Rosetta2 E. coli transformées avec le spectrophotomètre</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> TriEx4-DHX36 <td>capable de lire OD600 ; capable de lire les concentrations d’oligomères en fonction de la séquence de base (comme Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td></td><td></td><td>À partir de tubes</td></tr><tr><td></td> de<td>bandelettes PCR</td> de source standard<td></td><td>Tubes à</td></tr><tr><td>centrifuger de source standard 15 et 50 mL (polypropylène)</td><td></td><td></td><td>À partir de source standard</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>À partir de sources standard</td></tr><tr><td>Flacons à centrifuger de 500 mL (polypropylène)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Gamme standard de pointes de pipettes et de pipettes</td><td></td><td></td> sérologiques <td>à partir de source standard</td></tr><tr>Pointes <td></td><td></td><td>de chargement de gel</td><td>de source standard</td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td> à répétition automatique <td>Pour l’aliquotage rapide de rG4R1 ; De source standard</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td>De source standard</td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td> liquide <td>De source standard</td></tr><tr><td>Glace</td><td></td><td></td> carbonique <td>De source standard</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemlli&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Appareil pour l’utilisation de gels de grande taille</td><td>Biorad</td><td></td><td>Nous avons utilisé l’appareil à cellules Protean II xi de Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>Nous utilisons un aimant de One Lambda (maintenant une marque Thermo Fisher Scientific) ; et Life est également une filiale de Thermo, et donc l’aimant répertorié ici devrait être un remplacement approprié</td></tr><tr><td>des</td><td></td><td></td> <td>lames de rasoirDe source standard</td></tr><tr><td>Papier filtre et entonnoir</td><td></td><td></td><td>De source standard</td></tr><tr><td>Cocotte</td><td></td><td></td> en verre <td>De source standard</td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td><td>orbital de source standard</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>De source standard</td></tr><tr><td>Protecteurs</td><td></td><td></td><td>de feuille transparente De source standard</td></tr><tr><td>Scanner et associé Logiciel</td><td></td><td></td> TWAIN <td>À partir d’un logiciel</td></tr><tr><td></td><td></td><td>d’analyse d’images</td> standard <td>tel que Fuji Multiguage, ou équivalent</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>ou équivalent&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

une approche du g-quadruplex adn-affinité pour la purification de l&#39;activité enzymatique g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Ordre supérieur des structures d&#39;acides nucléiques appelés G-quadruplex (G4s, structures G4) peuvent se former dans les régions riches en guanine de l&#39;ADN et l&#39;ARN et sont très stables thermiquement. Il y a&gt; 375.000 putatifs séquences G4 formation dans le génome humain, et ils sont enrichis dans les régions de promoteurs, régions non traduites (UTR), et dans la répétition télomérique. En raison du potentiel de ces structures affectent les processus cellulaires tels que la réplication et la transcription, la cellule a évolué enzymes pour les gérer. Une telle enzyme est une résolvase G4 (G4R1), qui a été co-biochimiquement caractérisée par notre laboratoire et Nagamine et al. et a trouvé à se lier très étroitement à la fois G4-ADN et G4-ARN (K d dans la gamme basse pM). G4R1 est la source de la majeure partie de l&#39;activité de G4 à résolution dans les lysats cellulaires HeLa et a depuis été impliquée pour jouer un rôle dans le métabolisme du télomère, le développement de la lymphe, la transcription des gènes, de l&#39;hématopoïèse et de la surveillance immunitaire. La capacité d&#39;efsamment exprimer et purifier catalytiquement active G4R1 est d&#39;une importance pour les laboratoires intéressés à acquérir un éclairage supplémentaire sur l&#39;interaction cinétique des structures G4 et enzymes G4-résoudre. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour la purification de recombinant G4R1 (rG4R1). Le mode opératoire décrit comprend la traditionnelle purification par affinité d&#39;une histidine enzyme C-terminale exprimée dans des bactéries de codon optimisé pour l&#39;homme avec l&#39;utilisation de la capacité de rG4R1 à se lier et se détendre G4-ADN pour purifier une enzyme hautement actif dans une ATP- étape d&#39;élution dépendante. Le protocole comprend en outre une étape de contrôle de qualité, où l&#39;activité enzymatique de rG4R1 est mesurée en examinant la capacité de l&#39;enzyme purifiée pour dérouler l&#39;ADN-G4. Un procédé est également décrit qui permet la quantification de rG4R1 purifié. adaptations alternatives de ce protocole sont discutées.

Ce protocole (figure 1) , on obtient couramment à peu près pur, rG4R1 catalytiquement active. En tant que mesure de l&#39; activité enzymatique, il est généralement observé que 50% de 0,2 pmol d&#39;ADN-G4 tétramoléculaire TAMRA marqué est transformé en monomères à l&#39;intérieur de la 0,2 - Gamme 0,013 ul de rG4R1, telle que déterminée par l&#39;essai d&#39;activité G4 décrite ci - dessus (fig 2). Coomassie de purifiée rG4R1 indique une seule bande au 120 taille kDa attendue, avec une...

G4 Resolvase1 se lie à G-quadruplex (G4) structures avec le plus serré affinité rapportée pour une protéine G4 contraignante et représente la majorité de l&#39;activité de déroulage G4-ADN dans les cellules HeLa. Nous décrivons un nouveau protocole qui tire parti de l&#39;affinité et de l&#39;activité ATP-dépendante dévidage de G4-Resolvase1 pour purifier spécifiquement G4R1 recombinante catalytiquement active.

Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l&#39;activité enzymatique G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

L'objectif général de cette méthode est d'isoler la protéine hélicase G-quadruplex G4 Resolvase1 à partir d'un système d'expression bactérien, en utilisant une étape de purification originale dépendante de l'ATP permettant d'obtenir une enzyme quasiment pure et catalytiquement active. Cette méthode peut aider les chercheurs à obtenir une protéine recombinante G4 Resolvase1 quasiment pure et catalytiquement active, utilisable dans de nombreux essais biochimiques in vitro. Le principal avantage de cette technique est qu'elle exclut les enzymes mal repliées ou autrement inactives sur le plan catalytique de la préparation protéique.L'idée d'utiliser l'ATP pour éluer l'hélicase en forme de G-quadruplexe est née de l'impossibilité d'éluer l'enzyme catalytiquement active des billes G4, même à des concentrations de sel exceptionnellement élevées. Préparez et faites croître de grandes cultures bactériennes exprimant la Résolvase1 en forme de G-quadruplexe ou G4R1 comme décrit dans le protocole écrit. Décongelez le culot bactérien dans trois millilitres de tampon TN à température ambiante.Tenez les bouteilles à la main et agitez-les doucement pour décongeler et remettre en suspension le culo

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Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l'interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l'ADN double brin pour la co-cristallisation...

Itératif d&#39;optimisation des duplex d&#39;ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

Nous décrivons des tests discontinus sensibles à base de gel pour examiner la cinétique de l’initiation des brins retardés à l’aide des protéines de réplication du bactériophage T7.

Cinétique de Lagging brin Synthèse de l&#39;ADN<em&gt; In vitro</em&gt; Par les protéines de réplication bactériophage T7

Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.

Manipulation de molécules simples de G-quadruplexes par pinces magnétiques

Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.

Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes

Les bis-3-chloropipéridines (B-CePs) sont des sondes chimiques utiles pour identifier et caractériser les structures G-quadruplex dans les matrices d’ADN in vitro. Ce protocole détaille la procédure permettant d’effectuer des réactions de sondage avec des B-CeP et de résoudre les produits de réaction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à haute résolution.

In vitro Cartographie chimique des structures de l’ADN G-quadruplex par Bis-3-chloropipéridines

Un obstacle important aux technologies comme CRISPR est les événements hors cible qui peuvent perturber les gènes vitaux. La « circularisation pour la notification in vitro des effets de clivage par séquençage » (CIRCLE-seq) est une technique conçue pour identifier les sites de clivage non intentionnels. Cette méthode cartographie l’activité à l’échelle du génome de CRISPR-Cas9 avec une sensibilité élevée et sans biais.

CIRCLE-Seq pour l’interrogation de l’édition de gènes hors cible

Ce protocole démontre la réalisation d’un test sur une seule molécule pour la visualisation en direct du déroulement de l’ADN par l’hélicase CMG. Il décrit (1) la préparation d’un substrat d’ADN, (2) la purification de l’hélicase CMG de Drosophila melanogaster marquée par fluorescence, (3) la préparation d’une cellule d’écoulement microfluidique pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et (4) le test de déroulement de l’ADN à molécule unique.

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Ce protocole décrit un test de réplication de l’ADN à molécule unique basé sur la microscopie à fluorescence, permettant de visualiser en temps réel les interactions entre les ADN polymérases et les obstacles tels que les structures G-quadruplex.

Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes

Un protocole pour la production, la purification et l’utilisation de vésicules de membrane externe emballées d’enzymes (OMV) offrant une stabilité enzymatique améliorée pour une mise en œuvre dans diverses applications est présenté.

Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Conception, production et purification

Ici, nous présentons une méthode pour exprimer et purifier S100A12 (calgranuline C). Nous décrivons un protocole pour mesurer son activité antimicrobienne contre le pathogène humain H. pylori .

Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Découvrez une méthode de purification de la G4 Resolvase1 par affinité G-quadruplex ADN utilisant une étape dépendante de l'ATP. Cette technique isole une enzyme catalytiquement active pour divers essais biochimiques in vitro.

Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l'activité enzymatique G4 Resolvase1

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