Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l'activité enzymatique G4 Resolvase1

L’objectif global de cette méthode est d’isoler la protéine G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 à partir d’un système d’expression bactérien en utilisant une étape de purification unique dépendante de l’ATP pour isoler une enzyme presque pure et catalytiquement active. Cette méthode peut aider les chercheurs à obtenir pour nous la protéine recombinante G4 Resolvase1 presque pure et catalytiquement active dans un large éventail d’essais biochimiques in vitro. Le principal avantage de cette technique est qu’elle exclut de la préparation protéique les enzymes mal repliées ou inactives sur le plan catalytique.

L’idée d’utiliser l’ATP pour éluer l’hélicase G-quadruplex est née après avoir été incapable d’éluer l’enzyme catalytiquement active des billes G4, même à des concentrations de sel exceptionnellement élevées. Préparer et cultiver de grandes cultures bactériennes exprimant G-quadruplex Resolvase1 ou G4R1 comme décrit dans le protocole textuel. Décongelez la pastille bactérienne dans trois millilitres de tampon TN à température ambiante.

Tenez les bouteilles à la main et agitez-les pour décongeler et remettre en suspension la pastille bactérienne. Une fois décongelé et relativement uniformément suspendu, portez le volume à cinq millilitres avec un tampon TN. Ensuite, dissolvez 20 milligrammes de lysozyme dans 250 microlitres d’eau par culture et ajoutez-les aux bactéries remises en suspension.

Laissez le lysozyme digérer les bactéries pendant environ cinq à 10 minutes tout en faisant tourner les bouteilles à la main. La couleur de la suspension commencera à s’éclaircir légèrement au fur et à mesure de la digestion, et la suspension sera relativement peu visqueuse. Ajouter 250 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase abrégé PIC.

Ensuite, ajoutez une aliquote de 10 microlitres de leupeptine et mélangez soigneusement. Placez la suspension sur de la glace et ajoutez 10 millilitres de tampon TN froid et 22 microlitres de bêta-mercaptoéthanol ou BME. Transférez la suspension dans un tube de 50 millilitres.

Sonicez les bactéries sur de la glace avec un sonicateur numérique réglé à 30 % d’amplitude. Pulsez à deux secondes de marche et deux secondes d’arrêt pendant une minute. Répétez la sonication trois fois, en laissant les échantillons refroidir sur de la glace pendant au moins deux minutes entre les étapes de sonication.

Ensuite, ajoutez un volume égal de citrate de sodium salin froid quatre X ou SSC plus BME, PIC et leupeptine et mélangez la suspension. Dans une centrifugeuse de table pré-refroidie à quatre degrés Celsius, centrifugez les lysats à 2, 300 fois G pendant 20 minutes. Transférez ensuite le surnageant dans des tubes de 50 millilitres fraîchement refroidis.

Prenez un millilitre de billes paramagnétiques de streptavidine, ou suspension SPB par culture, et transférez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Granulez le SPB avec un aimant. Ensuite, lavez le SPB deux fois avec deux X SSC plus cinq millimolaires EDTA PH8.

Ensuite, mettez en suspension le SPB lavé dans 200 microlitres de la même solution. Ajouter une aliquote de trois OD d’ADN G4 à la suspension de SPB. Mélangez rapidement en pipetant de haut en bas plusieurs fois.

Ensuite, placez les tubes sur un rotateur et faites-les tourner à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Après cette période de rotation, bloquez le SPB lié à G4 en ajoutant un millilitre de lactalbumine à 0,4 %, et maintenez-le sur de la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour lier l’histidine recombinante G4R1 aux billes de cobalt, ajoutez un millilitre de suspension de billes de cobalt à chaque tube de 50 millilitres contenant le lysat bactérien clarifié.

Incuber le mélange pendant 20 minutes à température ambiante sur un rotateur. Après l’incubation, faites tourner des billes de cobalt à 110 fois G pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de table à quatre degrés Celsius. Aspirez le liquide avec précaution et laissez quelques millilitres de liquide afin de ne pas déranger les billes de cobalt granulées.

Ensuite, lavez les perles avec 10 à 15 millilitres de froid quatre X SSC plus BME, et granulez les billes comme précédemment. Versez le lysat clarifié suivant sur les billes de cobalt granulées. Incuber pendant 20 minutes supplémentaires à température ambiante sur le rotateur et laver les billes avec 10 à 15 millilitres de quatre X SSC plus BME.

Ensuite, granulez les billes à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après un deuxième lavage, aspirez le liquide et laissez environ deux millilitres de billes et de liquide au fond du tube. Transférez les billes de cobalt liées aux protéines dans un tube de deux millilitres prérefroidi à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre de large.

Centrifugez brièvement les billes dans le tube de deux millilitres à grande vitesse dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius. Retirez délicatement et jetez le surnageant par pipetage en prenant soin de ne pas perdre les billes de cobalt liées aux protéines. Pipetez 0,5 millilitre de tampon d’élution d’histidine, ou HEB, sur les billes et remettez-les en suspension en inversant le tube.

Ensuite, incubez les billes de cobalt dans HEB sur un rotateur pendant cinq minutes dans une chambre froide. Ensuite, centrifugez la suspension à 18 000 fois G dans une microcentrifugeuse à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirez délicatement la protéine contenant le surnageant par pipetage soigneux en laissant une petite quantité de liquide sur les billes de cobalt.

Transférez le surnageant dans un tube pré-refroidi de 15 millilitres. Répétez ces étapes pour un total de trois élutions HEB. Ensuite, éluer une fois avec 0,2 molaire d’EDTA à PH 6,0.

La couleur des billes de cobalt passera du rose au blanc au fur et à mesure que l’EDTA chélate le cobalt. Une fois que cette quatrième et dernière élution a été transférée dans le tube de 15 millilitres, pipetez le tampon d’élution résiduel des billes de cobalt à l’aide d’une pointe de chargement de gel située à l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre. En plongeant l’extrémité au fond du tube, la protéine résiduelle contenant le tampon d’élution peut être collectée.

Pilotez le G4 SPB préparé sur le côté du tube à l’aide d’un aimant et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon à trois X res dans le SPB G4 et pipetez pour mélanger. Pipetez le G4 SPB en suspension dans trois tampons X res dans le tube de 15 millilitres contenant environ deux millilitres de protéines contenant de l’EDTA HEB.

Incuber pendant 15 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avec agitation occasionnelle afin que les billes ne se déposent pas. Après avoir lavé le G4 SPB lié aux protéines comme décrit dans le protocole de texte, granulez le G4 SPB avec un aimant sur de la glace et remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de tampon d’élution préchauffé. Transférez immédiatement les billes dans un tube PCR préchauffé et incubez pendant 30 secondes à 37 degrés Celsius.

Ajoutez rapidement 12 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et pipetez vigoureusement de haut en bas 20 à 30 fois. La combinaison de la teneur élevée en sel et de l’ATP contenue dans le tampon d’élution sert à éluer le G4R1 recombinant des billes G4. Granulez immédiatement le G4 SPB avec un aimant et transférez la protéine contenant l’élu dans un tube PCR frais sur de la glace.

Après avoir répété l’élution et le transfert, le produit final est d’environ 200 microlitres de tampon d’élution contenant du G4R1 recombinant purifié. Enfin, effectuez le test d’activité enzymatique de contrôle de la qualité pour vérifier si le recombinant hautement actif G4R1 a été purifié comme décrit dans le protocole textuel. Le test G4 fournit une mesure de l’activité enzymatique recombinante de G4R1.

Dans la gamme de 0,2 à 0,013 microlitre de l’enzyme, on observe généralement que 50 % des 0,2 picomoles de l’ADN tétramoléculaire G4 marqué à la tétraméthylrhodamine sont convertis en monomères. Le peuplement de G4R1 recombinant purifié de Coomassie indique une seule bande à la taille attendue de 120 kilodaltons avec une bande contaminante mineure à environ 75 kilodaltons. Cette bande peut représenter le G4R1 recombinant tronqué qui a maintenu sa capacité à lier les billes d’ADN G4 en élué d’une manière dépendante de l’ATP.

La bande d’intérêt est quantifiée par rapport à une courbe standard de protéines. Ce protocole permet généralement d’obtenir 200 microlitres de 20 à 100 enzymes purifiées nanomolaires par litre de culture bactérienne. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier la protéine G4 Resolvase1 à partir d’un système d’expression bactérien en utilisant une étape de purification unique dépendante de l’ATP pour isoler une enzyme presque pure et catalytiquement active.

Une fois maîtrisé, et avec une préparation préalable des granulés de bactéries congelées, la purification de G4R1 recombinant peut être réalisée en six heures environ. Pour maintenir l’activité catalytique optimale de l’enzyme, il est important de garder la préparation sur de la glace, sauf indication contraire. Utilisez toujours des inhibiteurs de protéase.

Évitez la formation de bulles dans les tubes. Congelez rapidement l’enzyme purifiée et évitez les cycles de congélation et de décongélation inutiles. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine pour définir avec précision les affinités de liaison et les activités hélicases de cette protéine à un large éventail de substrats d’ADN et d’ARN.

Cette méthode peut également être adaptée pour la purification d’autres enzymes d’acide nucléique dépendantes de l’ATP pour lesquelles le produit de la réaction enzymatique n’est plus un substrat de liaison pour l’enzyme.