Name: Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Apprenez à déterminer la sélectivité ionique des channelrhodopsines par enregistrements patch-clamp à cellules entières sur cellules HEK293. Cette méthode électrophysiologie fournit des données précises sur les photocourants et la biophysique des canaux.

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Nous remercions Maila Reh, Tharsana Tharmalingam et surtout Altina Klein pour une excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 à PH) et le Cluster of Excellence Unifying Concepts in Catalysis, UniCat, BIG-NSE (JV) et E4 (PH).

<ol><li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+contractile+function+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of contractile function in skeletal muscle.</a> Nat. Commun. 6 (7153), 1-8 (2015).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nat. Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr. Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+noninvasive+activation+and+inhibition+of+neural+and+network+activity+by+vertebrate+rhodopsin+and+green+algae+channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (49), 17816-17821 (2005).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci. Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+foundations+of+optogenetics%3A+Determinants+of+channelrhodopsin+ion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113 (4), 822-829 (2016).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85 (2), 564-569 (2009).</li>
<li>Schneider, F., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+selectivity+and+competition+in+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ion selectivity and competition in channelrhodopsins.</a> Biophys. J. 105 (1), 91-100 (2013).</li>
<li>Prigge, M. Über die elektrophysiologische Untersuchung und Entwicklung von farbverschobenen Kanalrhodopsinchimären aus der Grünalge Volvox carteri. , Diss. Humboldt-Universität zu Berlin. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476">http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:11-100203476</a> (2012).</li>
<li>Govorunova, E. G., Spudich, E. N., Lane, C. E., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Channelrhodopsin+with+a+Red-Shifted+Spectrum+and+Rapid+Kinetics+from+Mesostigma+viride%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">New Channelrhodopsin with a Red-Shifted Spectrum and Rapid Kinetics from Mesostigma viride.</a> MBio. 2 (3), 1-9 (2011).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Janz, R., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+highly+efficient+blue-shifted+channelrhodopsin+from+the+marine+alga+Platymonas+subcordiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis.</a> J. Biol. Chem. 288 (41), 29911-29922 (2013).</li>
<li>Hou, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+Chlamydomonas+Channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of Chlamydomonas Channelrhodopsins.</a> Photochem. Photobiol. 88 (1), 119-128 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat. Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys. J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477 (7363), 171-178 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L. a, Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-stable+neural+state+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bi-stable neural state switches.</a> Nat. Neurosci. 12 (2), 229-234 (2009).</li>
<li>Berndt, A., Lee, S. Y., Ramakrishnan, C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation+of+Channelrhodopsin+into+a+Light-Activated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation of Channelrhodopsin into a Light-Activated Chloride Channel.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomonas+sulcata+ACR1%3A+A+Fast+Anion+Channelrhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Proteomonas sulcata ACR1: A Fast Anion Channelrhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. 92 (2), 257-263 (2016).</li>
<li>Wietek, J., Broser, M., Krause, B. S., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Natural+Green+Light+Absorbing+Chloride+Conducting+Channelrhodopsin+from+Proteomonas+sulcata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a Natural Green Light Absorbing Chloride Conducting Channelrhodopsin from Proteomonas sulcata.</a> J. Biol. Chem. 291 (8), 4121-4127 (2016).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
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<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/neuro/journal/v14/n4/full/nn.2776.html">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nat. Neurosci. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+differentiating+photocurrent+properties+of+two+channelrhodopsins+from+chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants differentiating photocurrent properties of two channelrhodopsins from chlamydomonas.</a> J. Biol. Chem. 284 (9), 5685-5696 (2009).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 129-139 (2008).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La détermination des potentiels de renversement dans des conditions ioniques et électriques définies fournit des informations sur les espèces d&#39;ions transportées après activation légère de ChRs. Si exclusivement, une espèce d&#39;ions varie dans un milieu physiologique complexe et les changements de potentiel d&#39;inversion obtenus selon le potentiel théorique de Nernst, cette espèce ionique est la seule transportée. Cependant, pour les ChR, les changements de potentiel d&#39;inversion ...

Les canarhodopsines (ChR) sont des canaux ioniques à lumière qui se produisent dans l&#39;oeil des algues vertes mobiles et servent de photosensors primaires pour la phototaxie et les réponses phobies 1 . Depuis leur première description en 2002 2 , les ChR ont ouvert la voie au domaine émergent de l&#39;optogenèse et peuvent être appliqués dans une variété de cellules excitables, par exemple dans les muscles squelettiques, le cœur ou le cerveau 3 , 4 , 5 . L&#39;expression des ChR dans les cellules cibles entraîne une perméabilité aux ions pouvant être contrôlée par la lumière de la cellule respective. Dans un contexte neuronal, cela permet l&#39;activation 6 , 7 , 8 ou l&#39;inhibition 9 , 10 du déclenchement du potentiel d&#39;action (AP) - en fonction de l&#39;ion conduit - avec l&#39;espace et le tempsPrécision de la lumière en soulignant comment la sélectivité ionique d&#39;un variant de ChR détermine son application optogénétique. Les premiers ChR découverts de Chlamydomonas reinhardtii et Volvox carteri sont perméables aux protons, mais aussi aux cations monovalents comme le sodium, le potassium et, dans une moindre mesure, les cations divalents tels que le calcium et le magnésium 11 , 12 , 13 . Aujourd&#39;hui, plus de 70 channelrhodopsins (CCR) 14 , 15 , 16 , 17 et plusieurs variantes conçues 18 , 19 , 20 avec des propriétés différentes telles que La taille du photocourant, la sensibilité spectrale, la cinétique et la sélectivité des cations sont disponibles. Alors qu&#39;en neuroscience, les CCR sontSont utilisés pour activer les cellules et déclencher des AP, les pompes microbiennes à lumière ont été les seuls antagonistes disponibles pour faire diminuer les neurones pendant des années. En 2014, deux groupes ont simultanément montré que les CCR peuvent être transformés en canal-triopsines conductrices d&#39;anions (ACR) par altération de la polarité le long du pore porteur d&#39;ions putatif via l&#39;ingénierie moléculaire 9 , 21 . Par la suite, des ACR naturels ont été identifiés dans plusieurs algues cryptophytes 22 , 23 , 24 . Plus important encore, l&#39;activation légère des ACR médiatise les courants de chlorure dans les neurones adultes, ce qui permet d&#39;inhiber l&#39;activité neuronale à des intensités lumineuses beaucoup plus faibles que les pompes microbiennes qui ne transportent que des charges individuelles par photon absorbé. L&#39;activité ChR peut être directement traitée par des enregistrements électrophysiologiques de pinces de courants induits par la lumière dans des cellules HEK293. Le patch-clampLa technique a d&#39;abord été développée à la fin des années 1970 25 et améliorée par Hamill et al. , Permettant l&#39;enregistrement de l&#39;entité des courants à partir d&#39;une petite cellule (mode cellule entière) avec une résolution de courant élevée et une commande directe de la tension de la membrane 26 . Appliquée dans la culture cellulaire, cette technique assure un contrôle précis des conditions d&#39;enregistrement ioniques et électriques et permet d&#39;étudier la sélectivité ionique ainsi que la contribution relative des ions au courant total. Ici, nous illustrons l&#39;examen de la sélectivité ionique pour la canalodromycine conductrice d&#39;anion de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) 22 , 23 via l&#39;enregistrement des relations tension-tension sous différentes concentrations de chlorure extracellulaire pour prouver une forte conductance du chlorure.

<table><tbody><tr><td>Cellules HEK293</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85120602</td><td>Cellules rénales embryonnaires humaines</td></tr><tr><td>Rétinienne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2500</td><td>all-trans retinal</td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrome</td><td>FG 0445</td><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>3810</td><td>Ponts gélifiés</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239</td><td>CaCl2 2H2O</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Biomol</td><td>2452</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Roth</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Biochrome</td><td>S0615</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Roth</td><td>HN06</td><td>D(+)-Glucose</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189</td><td>MgCl2 6H2O</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>NMG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>N-Methyl-D-glucamine</td></tr><tr><td>Na-Aspartate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6683</td><td>Acide L-aspartique sel de sodium monohydraté</td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Roth</td><td>6490</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER1462</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0695</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ThermoFischerScientific</td><td>ER0975</td><td>Enzyme de restriction</td></tr><tr><td>XL1Blue E. coli</td><td>Agilent Technologies</td><td>200249</td><td>Chemocompetent E. coli</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de lysogénie</td><td>moyen Roth</td><td>X964</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Roth</td><td>6494</td><td>Plaques de gélose</td></tr><tr><td>Kit de purification du plasmide</td><td>Marchery-Nagel</td><td>740727.25</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline/Streptomycine</td><td>Biochrome</td><td>A 2213</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Poly-D-bromhydrate de lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>Revêtement de recouvrement</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Polissage</td><td></td> de feu sur mesure <td>Pipettes</td></tr><tr><td>sérologiques</td><td>TPP</td><td></td><td>Différentes tailles</td></tr><tr><td>Banc propre</td><td>Kojair</td><td>Biowizard SL130</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur</td><td>IKA</td><td>RCT classique</td><td></td></tr><tr><td>Fil d’argent</td><td>Produits scientifiques</td><td>AG-T25 ; AG-T10</td><td>Électrodes, 0,64 mm (bain) ; pH-mètre 0,25 mm (électrode)</td></tr> <tr><td></td><td>Knick</td><td>765 Osmomètre calimétrique</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vogel</td><td>OM 815</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>ID03</td><td>Polissage au feu</td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Liant</td><td>CB150</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire</td><td>TPP</td><td>93040</td><td>34 mm interne diamètre</td></tr><tr><td>Couvercles</td><td>Roth</td><td>P232</td><td>15 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>R&ouml ; ssel Messtechnik</td><td>MTM12</td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21011</td><td>90/10</td></tr><tr><td>transmission Porte-pipette</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>PPH-1P-AXU-0-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>AxoPatch200B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digitizer Molecular Devices</td><td>DigiData1400</td><td>Convertisseur analogique numérique</td></tr> Source <tr><td>lumineuse</td><td>TILL Photonics</td><td>Polychrome V</td><td>Réglé sur 540 nm pleine intensité</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Obturateur</td><td>Vincent Associates</td><td>VS25</td><td></td></tr><tr><td>Pilote d’obturateur</td><td>Vincent Associates</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Magasins en verre</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-3</td><td>Capillaires en boresilicate avec extrémités polies au feu OD 1,5 mm ID&nbsp ; 0,86 mm</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instruments</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur de bain</td><td>Lorenz Messger&auml ; tebau</td><td>MPCU</td><td></td></tr><tr><td>Tripleband filterset</td><td>Chroma</td><td>69008</td><td>Filtre de fluorescence&nbsp ; ECFP/EYFP/mCherry&nbsp ;</td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Watec</td><td>Wat-221SCCD</td><td></td></tr><tr><td>Optomètre</td><td>Gigahertz Optik</td><td>P9710</td><td>Mesure des intensités lumineuses</td></tr><tr><td>Objectif</td><td>Carl Zeiss</td><td>421462-9900-000</td><td>W Plan-Apochromat 40X/1.0</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>DIC Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’enregistrement</td><td>Alimentation</td> sur <td></td><td></td>mesure</tr><tr><td></td><td>Manson</td><td>HCS-3202</td><td>Évite le bruit électrique du microscope Alimentation intégrée</td></tr><tr><td>Table isolée des vibrations</td><td>Newport</td><td>M-VW-3636-OPT-01</td><td></td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Table d’adaptation</td><td></td><td></td>sur mesure ou commerciale</tr><tr><td>Tuyaux</td><td>N’importe quel commercial ; par exemple Roth</td><td></td><td>Différentes tailles et matériaux pour la manipulation du bain et l’application de la pression des pipettes ; ponts en gélose</td></tr><tr><td>Linéaire shaker</td><td>Sunlab Instruments</td><td>SU 1000</td><td></td></tr><tr><td>Calculateur de potentiel de jonction liquide</td><td>Molecular Devices ou directement auprès de Peter H. Barry</td><td></td><td>Le programme est inclus dans le logiciel d’acquisition Clampex ou peut être obtenu auprès de&nbsp ; p.barry@unsw.edu.au</td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10.X</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’évaluation des données</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampfit 10.X</td><td></td></tr><tr><td>PsACR1</td><td>GenBank ou Addgene</td><td>KF992074.1 ou Addgene plasmide #85465</td><td>Codage du gène pour PsACR1</td></tr><tr><td>Guide de l’amplificateur</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Le guide</td><td></td> de l’axone</tr></tbody></table>

enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Au cours de la dernière décennie, les canal-rhodopsines sont devenues indispensables dans la recherche neuro-scientifique où elles sont utilisées comme outils pour manipuler des processus électriques de manière non invasive dans des cellules cibles. Dans ce contexte, la sélectivité ionique d&#39;une canalrhodopsine revêt une importance particulière. Cet article décrit l&#39;étude de la sélectivité des chlorures pour une canalisation de chrysomies de Proteomonas sulcata, récemment identifiée, par des enregistrements électrophysiologiques sur les cellules HEK293. La procédure expérimentale pour la mesure des photocourteurs à lumière modérée nécessite une source de lumière rapide commutable - idéalement monochromatique - couplée au microscope d&#39;une configuration pare-brise conventionnelle. Les procédures préparatoires avant l&#39;expérience sont décrites impliquant la préparation de solutions tamponnées, des considérations sur les potentiels de jonction liquide, l&#39;ensemencement et la transfection des cellules, et le tirage des pipettes patch. L&#39;enregistrement réel de la relation courant-tensionS pour déterminer les potentiels d&#39;inversion pour différentes concentrations de chlorure se déroule de 24 h à 48 h après la transfection. Enfin, les données électrophysiologiques sont analysées en fonction des considérations théoriques de la conduction du chlorure.

<html> La figure 2 montre les résultats représentatifs obtenus à partir des mesures suivant le protocole décrit. Pendant l&#39;illumination avec lumière verte, Ps ACR1 comporte un courant transitoire rapide qui se décompose rapidement en un niveau de courant stationnaire. Une fois la lumière éteinte, les photocourents se décomposent à zéro en millisecondes ( Figure 2A ). L&#39;échange de la concentration de chlorure extracellulaire entraîne un dé...

Cet article décrit comment la sélectivité ionique de la channelrhodopsine est déterminée à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques de cellules entières à l’aide de cellules HEK293. Ici, la procédure expérimentale d’étude de la sélectivité du chlorure d’une channelrhodopsine sélective par anion est démontrée. Cependant, la procédure est transférable à d’autres channelrhodopsines de sélectivité distincte.

Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la sélectivité du chlorure de nouveaux canaux ioniques photocommandés. Cette méthode peut répondre à des questions clés de la biophysique des channelrhodopsines telles que les amplitudes des courants photoélectriques, la cinétique et la sélectivité des ions. Le principal avantage de cette technique est la lecture directe de l’activité biophysique des canaux, qui est rapide et facile à reproduire.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car chaque étape de la procédure expérimentale, de la préparation des cellules HEK à l’enregistrement des photocourants, doit être optimisée. L’ensemencement et la section des cellules HEK seront démontrés par Altina Klein. Pour commencer cette procédure, pesez les composants solides pour 100 millilitres de solutions tamponnées intracellulaires et 500 millilitres de solutions tamponnées extracellulaires dans des béchers séparés.Et puis ajoutez la quantité respective de solutions mères préparées. Ensuite, ajoutez de l’eau ultra-pure et ajustez soigneusement le pH à l’aide d’acides et de bases. Ajustez ensuite l’osmolarité avec le glucose à 290 milliosmoles et 320 milliosmoles pour les solutions intracellulaires et extracellulaires, respectivement.Dans cette procédure, placez jusqu’à trois lamelles de verre recouvertes de lysine côte à côte dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Ensuite, ensemencez 1,5 fois 10 à la cinquième cellules HEK dans deux millilitres de DMEM standard complété par 10 % de FBS et un rétinol micromolaire dans chaque plat. Pour transfecter les cellules de chaque boîte, préparez une solution de deux microgrammes d’ADN plasmidique dans 250 microlitres de DMEM sans FBS et six microlitres de réactif de transfection.Après 15 minutes d’incubation, ajoutez délicatement la solution aux cellules. Avant de mesurer, tirez des pipettes patch à faible résistance à l’aide d’un extracteur de micropipettes et polissez-les au feu. Conservez les pipettes dans un récipient à l’abri de la poussière pour le jour de la mesure.30 minutes avant les enregistrements, allumez tous les composants de configuration pour chauffer jusqu’à la température de fonctionnement. Assurez-vous que les tampons sont à température ambiante. Pour commencer, scellez la chambre de mesure avec du silicone pour éviter les fuites du tampon externe.Placez ensuite une lamelle dans la chambre et fermez-la. Remplissez soigneusement la chambre avec un tampon extracellulaire pour éviter que les cellules ne se détachent. Conservez la boîte de Pétri avec les autres lamelles dans un incubateur pour la prochaine série d’expériences.Placez ensuite la chambre de mesure sous le microscope à l’aide de l’objectif 40X pour la visualisation des cellules. Ensuite, placez un pont Auger sur l’électrode du bain et placez-le dans la chambre avec le capteur de niveau de liquide et la sortie de perfusion du manipulateur de bain. Remplacez la solution extracellulaire deux fois par un millilitre de solution externe fraîche pour éliminer le milieu de culture résiduel et les cellules détachées.Faites la mise au point sur les cellules et recherchez une cellule transfectée qui doit être isolée des autres cellules. Utilisez ensuite un ensemble de filtres à trois bandes et une lumière orange pour exciter et visualiser mCherry. Ensuite, remplissez l’une des pipettes tirées avec la solution intracellulaire.Et éliminez les bulles d’air en retournant la pipette plusieurs fois. Ensuite, montez la pipette sur le support de pipette et appliquez une pression positive pour éviter le colmatage de la pointe. Localisez l’extrémité de la pipette patch sous le microscope et faites-la naviguer près de la cellule à l’aide du micromanipulateur.Dans le logiciel d’acquisition de données, démarrez le test de membrane en mode Bain et appliquez un pas de tension. Vérifiez si la résistance de la pipette se situe dans la plage souhaitée de 1,3 à 3,0 mégaohms. Ensuite, mettez à zéro les courants de décalage et ajustez le potentiel de la pipette en tournant le bouton de décalage de la pipette sur l’amplificateur.Pour établir un patch dans la configuration de la cellule entière, approchez-vous lentement de la cellule avec la pipette patch par le haut et relâchez la pression positive juste avant de toucher la cellule. Parfois, la configuration attachée à la cellule se forme après cela. Après vous être approché de la cellule, passez du mode Bain au mode Patch.Compensez la capacité de la pipette en tournant le bouton de compensation de capacité de la pipette pour obtenir une réponse plate de l’impulsion de test. Basculez le test de membrane en mode cellulaire. Ensuite, rompez le patch sans détruire l’étanchéité en appliquant de courtes impulsions de pression négative ou de pression négative avec une force croissante pour obtenir une confirmation de la cellule entière.Démarrez la compensation de résistance en série en réglant les deux paramètres de la cellule entière, la capacité de la cellule et la résistance en série. Dans le panneau de compensation de résistance en série, activez la prédiction et la correction jusqu’à 90 %Ensuite, allumez l’interrupteur de compensation de la cellule entière et ajustez les paramètres de la cellule entière de manière itérative pour obtenir une réponse d’étanchéité de test idéalement plate. Après avoir établi la configuration de la cellule entière, attendez au moins deux minutes avant d’enregistrer pour vous assurer que la solution intracellulaire est suffisamment remplacée par la pipette patch.Enregistrez les courants induits par la lumière à différents potentiels de maintien. Ensuite, remplacez le tampon extracellulaire par un faible taux de chlorure dans la chambre au moins cinq fois sans détruire le patch et enregistrez une autre relation de tension de courant à la nouvelle concentration de chlorure. Cette figure montre que lors de l’éclairage avec une lumière verte, PsACR1 présente un courant transitoire rapide qui décroît rapidement jusqu’à un niveau de courant stationnaire.Une fois la lumière éteinte, les photocourants tombent à zéro en quelques millisecondes. La réduction de la concentration de chlorure extracellulaire abolit complètement les photocourants dirigés vers l’extérieur. L’échange de la concentration extracellulaire de chlorure provoque un décalage du potentiel d’inversion qui peut être déduit d’un graphique de tension de courant.L’évaluation des potentiels d’inversion à partir de plusieurs mesures quantifie le décalage spectaculaire du potentiel d’inversion causé par la variation de la concentration externe de chlorure. Il est frappant de constater que les potentiels d’inversion mesurés correspondent directement aux potentiels de Nernst calculés pour le chlorure, ce qui confirme la sélectivité élevée du chlorure PsACR1. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques de photocourants induits par la lumière sur des cellules HEK exprimant la channelrhodopsine.Une fois maîtrisée, l’ensemble de la procédure peut être réalisé en quatre jours alors que l’enregistrement des photocourants prend plusieurs heures. En complément de cette procédure, des méthodes de mutagenèse dirigée et de spectroscopie peuvent être effectuées pour élucider davantage les caractéristiques structurelles et les mécanismes cellulaires des channelrhodopsines. La caractérisation et l’ingénierie moléculaire de la channelrhodopsine ont ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences pour manipuler l’excitabilité de neurones sélectionnés par la lumière.

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Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

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