Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la sélectivité du chlorure de nouveaux canaux ioniques photocommandés. Cette méthode peut répondre à des questions clés de la biophysique des channelrhodopsines telles que les amplitudes des courants photoélectriques, la cinétique et la sélectivité des ions. Le principal avantage de cette technique est la lecture directe de l’activité biophysique des canaux, qui est rapide et facile à reproduire.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car chaque étape de la procédure expérimentale, de la préparation des cellules HEK à l’enregistrement des photocourants, doit être optimisée. L’ensemencement et la section des cellules HEK seront démontrés par Altina Klein. Pour commencer cette procédure, pesez les composants solides pour 100 millilitres de solutions tamponnées intracellulaires et 500 millilitres de solutions tamponnées extracellulaires dans des béchers séparés.

Et puis ajoutez la quantité respective de solutions mères préparées. Ensuite, ajoutez de l’eau ultra-pure et ajustez soigneusement le pH à l’aide d’acides et de bases. Ajustez ensuite l’osmolarité avec le glucose à 290 milliosmoles et 320 milliosmoles pour les solutions intracellulaires et extracellulaires, respectivement.

Dans cette procédure, placez jusqu’à trois lamelles de verre recouvertes de lysine côte à côte dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Ensuite, ensemencez 1,5 fois 10 à la cinquième cellules HEK dans deux millilitres de DMEM standard complété par 10 % de FBS et un rétinol micromolaire dans chaque plat. Pour transfecter les cellules de chaque boîte, préparez une solution de deux microgrammes d’ADN plasmidique dans 250 microlitres de DMEM sans FBS et six microlitres de réactif de transfection.

Après 15 minutes d’incubation, ajoutez délicatement la solution aux cellules. Avant de mesurer, tirez des pipettes patch à faible résistance à l’aide d’un extracteur de micropipettes et polissez-les au feu. Conservez les pipettes dans un récipient à l’abri de la poussière pour le jour de la mesure.

30 minutes avant les enregistrements, allumez tous les composants de configuration pour chauffer jusqu’à la température de fonctionnement. Assurez-vous que les tampons sont à température ambiante. Pour commencer, scellez la chambre de mesure avec du silicone pour éviter les fuites du tampon externe.

Placez ensuite une lamelle dans la chambre et fermez-la. Remplissez soigneusement la chambre avec un tampon extracellulaire pour éviter que les cellules ne se détachent. Conservez la boîte de Pétri avec les autres lamelles dans un incubateur pour la prochaine série d’expériences.

Placez ensuite la chambre de mesure sous le microscope à l’aide de l’objectif 40X pour la visualisation des cellules. Ensuite, placez un pont Auger sur l’électrode du bain et placez-le dans la chambre avec le capteur de niveau de liquide et la sortie de perfusion du manipulateur de bain. Remplacez la solution extracellulaire deux fois par un millilitre de solution externe fraîche pour éliminer le milieu de culture résiduel et les cellules détachées.

Faites la mise au point sur les cellules et recherchez une cellule transfectée qui doit être isolée des autres cellules. Utilisez ensuite un ensemble de filtres à trois bandes et une lumière orange pour exciter et visualiser mCherry. Ensuite, remplissez l’une des pipettes tirées avec la solution intracellulaire.

Et éliminez les bulles d’air en retournant la pipette plusieurs fois. Ensuite, montez la pipette sur le support de pipette et appliquez une pression positive pour éviter le colmatage de la pointe. Localisez l’extrémité de la pipette patch sous le microscope et faites-la naviguer près de la cellule à l’aide du micromanipulateur.

Dans le logiciel d’acquisition de données, démarrez le test de membrane en mode Bain et appliquez un pas de tension. Vérifiez si la résistance de la pipette se situe dans la plage souhaitée de 1,3 à 3,0 mégaohms. Ensuite, mettez à zéro les courants de décalage et ajustez le potentiel de la pipette en tournant le bouton de décalage de la pipette sur l’amplificateur.

Pour établir un patch dans la configuration de la cellule entière, approchez-vous lentement de la cellule avec la pipette patch par le haut et relâchez la pression positive juste avant de toucher la cellule. Parfois, la configuration attachée à la cellule se forme après cela. Après vous être approché de la cellule, passez du mode Bain au mode Patch.

Compensez la capacité de la pipette en tournant le bouton de compensation de capacité de la pipette pour obtenir une réponse plate de l’impulsion de test. Basculez le test de membrane en mode cellulaire. Ensuite, rompez le patch sans détruire l’étanchéité en appliquant de courtes impulsions de pression négative ou de pression négative avec une force croissante pour obtenir une confirmation de la cellule entière.

Démarrez la compensation de résistance en série en réglant les deux paramètres de la cellule entière, la capacité de la cellule et la résistance en série. Dans le panneau de compensation de résistance en série, activez la prédiction et la correction jusqu’à 90 %Ensuite, allumez l’interrupteur de compensation de la cellule entière et ajustez les paramètres de la cellule entière de manière itérative pour obtenir une réponse d’étanchéité de test idéalement plate. Après avoir établi la configuration de la cellule entière, attendez au moins deux minutes avant d’enregistrer pour vous assurer que la solution intracellulaire est suffisamment remplacée par la pipette patch.

Enregistrez les courants induits par la lumière à différents potentiels de maintien. Ensuite, remplacez le tampon extracellulaire par un faible taux de chlorure dans la chambre au moins cinq fois sans détruire le patch et enregistrez une autre relation de tension de courant à la nouvelle concentration de chlorure. Cette figure montre que lors de l’éclairage avec une lumière verte, PsACR1 présente un courant transitoire rapide qui décroît rapidement jusqu’à un niveau de courant stationnaire.

Une fois la lumière éteinte, les photocourants tombent à zéro en quelques millisecondes. La réduction de la concentration de chlorure extracellulaire abolit complètement les photocourants dirigés vers l’extérieur. L’échange de la concentration extracellulaire de chlorure provoque un décalage du potentiel d’inversion qui peut être déduit d’un graphique de tension de courant.

L’évaluation des potentiels d’inversion à partir de plusieurs mesures quantifie le décalage spectaculaire du potentiel d’inversion causé par la variation de la concentration externe de chlorure. Il est frappant de constater que les potentiels d’inversion mesurés correspondent directement aux potentiels de Nernst calculés pour le chlorure, ce qui confirme la sélectivité élevée du chlorure PsACR1. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques de photocourants induits par la lumière sur des cellules HEK exprimant la channelrhodopsine.

Une fois maîtrisée, l’ensemble de la procédure peut être réalisé en quatre jours alors que l’enregistrement des photocourants prend plusieurs heures. En complément de cette procédure, des méthodes de mutagenèse dirigée et de spectroscopie peuvent être effectuées pour élucider davantage les caractéristiques structurelles et les mécanismes cellulaires des channelrhodopsines. La caractérisation et l’ingénierie moléculaire de la channelrhodopsine ont ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences pour manipuler l’excitabilité de neurones sélectionnés par la lumière.