Microscopie de la force atomique Enquêtes sur la reconnaissance des lésions de l'ADN dans la réparation de l'excision des nucléotides

L’objectif global de cette expérience de microscopie à force atomique est de résoudre les interactions des protéines de réparation de l’ADN avec les sites de dommages dans l’ADN et de distinguer les différentes interactions de l’ADN par divers complexes protéiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réparation de l’ADN, telles que la façon dont un système particulier de réparation de l’ADN parvient à reconnaître ses lésions cibles dans l’ADN. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons voir et analyser directement les différents types de complexes qui sont impliqués dans le processus de reconnaissance des lésions de l’ADN.

La démonstration de la procédure sera assurée par Nicolas Wirth, qui a utilisé cette approche lors de ses recherches de licence. Pour commencer, préparez un substrat d’ADN approprié en générant un espace d’ADN simple brin dans un plasmide. Remplissez le vide avec des oligonucléotides d’ADN monocaténaire modifiés et, enfin, linéarisez l’ADN plasmatique à l’aide d’enzymes de restriction appropriées.

Pour ces expériences, les substrats d’ADN double brin ont une longueur d’environ 1 000 paires de bases et contiennent une lésion de l’ADN ainsi qu’une région non appariée appelée bulle d’ADN pour le chargement des protéines sur l’ADN. Ensuite, préparez un échantillon d’ADN protéique pour l’analyse AFM en pipetant d’abord 10x Reaction Buffer et de l’eau dans un tube de microréaction. Ensuite, ajoutez l’ADN et les protéines à l’étude.

Par exemple, ici, 100 nanomolaires de l’échantillon d’ADN et une micromolaire ou chacune des protéines de réparation d’excision de nucléotides eucaryotes XPD et p44. Ensuite, incubez la réaction pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un bloc de chaleur. Après l’incubation, faites tourner brièvement l’échantillon.

Ensuite, préparez un substrat de mica sur lequel placer l’échantillon. À l’aide d’un scalpel, vous découpez un morceau de mica d’un centimètre sur un centimètre à partir d’une bande plus grande. Ensuite, utilisez un morceau de ruban adhésif pour enlever les couches supérieures du mica afin de révéler une surface de substrat propre, plate et anatomiquement lisse.

Dilater l’échantillon d’ADN protéique de cinquante à cent fois dans le tampon de dépôt AFM, et déposer immédiatement 20 microlitres de l’échantillon dilué sur la surface du mica. Le facteur de dilution dépend de la concentration de l’échantillon. Immédiatement après avoir déposé l’échantillon sur la surface du mica, rincez l’échantillon trois à quatre fois avec quelques millilitres d’eau filtrée et désionisée et épongez l’excès de liquide.

Utilisez un léger jet d’azote pour sécher l’échantillon. Enfin, utilisez du ruban adhésif pour fixer l’échantillon sur ses bords sur une lame de microscope. Placez l’échantillon au milieu de la platine AFM et utilisez des pastilles magnétiques pour fixer la lame de microscope sur la platine.

Ensuite, insérez l’embout AFM dans le porte-embout. Fixez l’embout dans le support sous une pince en serrant la vis de manière à ce qu’elle soit serrée à la main. Une fois fixé, entrez le porte-pointe dans la tête de mesure AFM.

Utilisez les vis de positionnement pour déplacer l’échantillon en position centrale. Placez la tête de mesure AFM sur l’échantillon, en vous assurant que la tête se tient de manière stable avec ses pattes à l’intérieur des indentations de la platine. Ensuite, alignez le laser AFM à l’arrière du cantilever pour une intensité de signal optimale.

Regardez le signal de réflexion dans la fenêtre vidéo de l’AFM pour positionner grossièrement le laser. Pour ce modèle AFM, tournez les roues du côté droit et de l’arrière de la tête de mesure AFM pour ajuster les positions X et Y du laser AFM afin de le diriger au centre de l’extrémité du cantilever. Ensuite, optimisez le signal de somme du détecteur en ajustant avec précision la position du laser avec les deux roues.

Dirigez la réflexion laser AFM sur le centre du détecteur en mettant à zéro les différents signaux des diodes supérieure et inférieure du réseau de détecteurs. Pour cette étape, tournez la vis sur le côté gauche de la tête de mesure pour ce modèle AFM. Ensuite, déterminez la fréquence de résidence en porte-à-faux en accédant à la fenêtre de réglage du panneau principal dans le logiciel.

Choisissez une amplitude correspondant à une entrée d’un volt pour le piézo qui entraîne l’oscillation en porte-à-faux, puis réglez la fréquence d’oscillation à moins 5 %, légèrement inférieure à la fréquence de résidence. Effectuez maintenant un réglage automatique de la fréquence et mettez à zéro la phase de l’oscillation. Laissez le système atteindre l’équilibre thermique pendant environ une heure avant de commencer l’imagerie, afin d’éviter la dérive.

Lorsque vous êtes prêt à commencer l’imagerie, dans le panneau principal du logiciel, définissez un point de consigne de protection et préparez-vous à approcher la pointe de la surface de l’échantillon en sélectionnant engager. Abaissez manuellement la roue avant de la tête AFM jusqu’à ce que le réglage de protection, ou point de consigne, soit atteint. Ensuite, abaissez soigneusement la roue avant jusqu’à ce que le signal du capteur Z soit complètement déployé vers la gauche.

Activez la table oscillante vibrante et fermez l’enceinte d’isolation acoustique. Ensuite, abaissez le point de consigne dans le logiciel AFM à l’aide de la roue de hamster pour engager finement la pointe de l’AFM avec l’échantillon. Pour effectuer une imagerie en mode de tapotement en régime répulsif, abaissez le point de consigne jusqu’à ce que le signal de phase devienne légèrement inférieur à la phase de niveau libre.

Ensuite, commencez à scanner l’échantillon. Utilisez la vitesse de balayage de 2,5 micromètres par seconde dans des surfaces d’image de quatre micromètres sur quatre micromètres ou de huit micromètres sur huit micromètres carrés avec des résolutions de pixels de 2 048 ou 4 096, respectivement ; et appuyez sur le bouton Effectuer l’analyse. Présélectionner les complexes d’ADN protéique pertinents par inspection visuelle directe des images dans le logiciel AFM.

Pour les échantillons XPD, les complexes possibles incluent l’ADN XPD p44, ainsi que l’ADN XPD et l’ADN p44 avec des tailles nettement différentes en raison des différentes masses moléculaires de XPD et p44. Mesurez les volumes de pics de protéines individuels sur l’ADN à l’aide de l’outil de section dans la fenêtre d’analyse pour mesurer la hauteur et le diamètre des sections de pics de protéines à l’aide des curseurs de la fenêtre de section. Utilisez ces valeurs pour déterminer le volume des pics à l’aide de modèles mathématiques simples afin de vérifier le type complexe.

Enfin, calibrez votre système AFM avec une gamme de protéines dont les poids moléculaires sont connus afin de traduire ces volumes en poids moléculaires approximatifs de protéines et de complexes protéiques. Afin de déterminer des caractéristiques supplémentaires, telles que la longueur des fragments d’ADN, les positions des complexes protéiques sur l’ADN et leurs spécificités du site cible ou les angles de bande d’ADN, voir le protocole de texte ci-joint. Voici une image AFM avec trois types différents de complexes liés à l’ADN qui peuvent être distingués en fonction de leurs différentes tailles.

Les complexes de classe un ne sont compatibles qu’avec le cofacteur d’activation de l’hélicase p44, les complexes de classe deux ne sont constitués que de la protéine XPD et les complexes de classe trois sont constitués à la fois de XPD et de p44, car la reconnaissance de la légion par XPD nécessite l’activation de son activité hélicase par p44, et seuls les complexes de classe trois montrent la reconnaissance des lésions. Afin d’identifier différentes stratégies de reconnaissance des lésions, les emplacements des protéines sur les substrats d’ADN ont été mesurés pour la charge protéique au niveau d’une bulle d’ADN dans les cinq directions premières ou les trois premières directions d’une lésion d’ADN indiquée en rouge pour les hélicases NER procaryotes et eucaryotes. Dans les distributions de position des protéines, la reconnaissance des lésions de l’ADN peut être considérée comme un pic en raison d’une liaison accrue à la position de la lésion de l’ADN.

Le procaryote NER hélicase UVRB et son homologue eucaryote, XPD, présentent différentes stratégies de reconnaissance des lésions CPD qui indiquent différentes préférences en matière de brins d’ADN. Plus précisément, les lésions CPD sont reconnues sur le brin transloqué par UVRB, mais préférentiellement sur le brin opposé, non transloqué, par XPD. Une fois maîtrisée, cette méthode peut se faire en quelques heures ou quelques jours incluant l’analyse.

Il est important de travailler avec des échantillons de protéines et d’ADN très purs pour pouvoir interpréter les caractéristiques des images AFM et concevoir soigneusement le substrat d’ADN en fonction du système biologique et de la question que vous souhaitez aborder. De plus, les méthodes d’ensemble, telles que l’électrophorèse sur gel, le déplacement de l’électromobilité ou les tests d’incision de l’ADN sont, bien sûr, très complémentaires à ces expériences AFM ; et ces méthodes peuvent aider à répondre à d’autres questions, telles que les affinités de liaison à l’ADN ou les activités d’excision des lésions d’ADN. Cette technique est une approche relativement rapide et simple pour visualiser directement les complexes d’ADN des protéines, et ces complexes nous donnent une bonne image des processus qui se produisent dans un système biologique.

Bien sûr, cela n’est pas seulement utile pour comprendre les processus de réparation de l’ADN, mais cela peut également être appliqué à d’autres systèmes d’ADN protéique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une assez bonne idée de la façon de préparer un échantillon sur votre système d’ADN protéique préféré, de l’imager par AFM et de la façon d’extraire des paramètres utiles pour une interprétation de vos données.