Spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase I Caractériser métabolique des compétences

L'objectif de cette procédure est de déterminer l'activité des cytochromes P450, ou CYP, dans des cellules en culture. Les CYP sont des enzymes clés impliquées dans le métabolisme des médicaments et des substances toxiques, et leur expression n'est souvent pas maintenue in vitro. L'expression normale des enzymes CYP est fréquemment perdue lorsque les cellules sont cultivées in vitro.

Par conséquent, de nombreux modèles in vitro ont une pertinence potentiellement limitée pour comprendre le métabolisme des médicaments et des substances toxiques. Le principal avantage de cette méthode réside dans sa simplicité lors de l'évaluation de l'activité des CYP dans des cellules en culture. À l'aide de substrats indicateurs et d'inhibiteurs, différentes plateformes de quantification sont présentées, notamment la spectrométrie de masse.

Pour commencer, récupérez des cryotubes contenant des cellules comme décrit dans le protocole écrit. Le protocole fourni utilise comme exemple une lignée cellulaire hépatique. En travaillant dans des conditions stériles, ouvrez soigneusement le cryotube pour relâcher toute pression excédentaire, puis pipetez le contenu du cryotube dans un tube de 10 millilitres contenant neuf millilitres de milieu Williams'E préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius.

Centrifuger la solution pendant 10 minutes à 400 × g à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre les cellules dans 5 mL de milieu de décongélation propriétaire, préchauffé à 37 °C et supplémenté en glutamine. Après avoir dénombré les cellules viables selon le protocole décrit dans le texte, ensemencer les cellules dans une plaque de 24 puits revêtue de collagène à une densité de 60 000 cellules viables par puits et un volume final de 0,5 mL de milieu de décongélation.

Après quelques jours en culture, les cellules forment une structure trabéculaire subconfluente. L'activité métabolique optimale est généralement observée entre les jours sept et dix, et est minimale au jour quatre. Pour préparer les cultures d'épithélium bronchique différencié, utilisez un épithélium bronchique primaire différencié entièrement disponible dans le commerce, cultivé à l'interface air-liquide sur un insert.

À l’aide de pinces stériles, déloger délicatement l’insert cellulaire de la matrice d’agarose et le transférer dans la nouvelle plaque préchargée avec 700 microlitres de milieu de culture propriétaire. Évaluer l’intégrité du tissu respiratoire à l’aide de méthodes référencées dans le protocole textuel, telles que la résistance transepithéliale ou la fréquence de battement des cils. Avant l’expérience, préparer deux séries d’inserts cellulaires pour les cellules respiratoires et des puits pour les cellules hépatiques, avec un minimum de trois réplicats.

Utilisez une série pour l'expérience d'inhibition et l'autre uniquement pour la sonde métabolique. Préparez une troisième série de cellules comme témoin de milieu. Le jour de l'expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par 450 microlitres de milieu frais.

Ajouter 50 microlitres de milieu contenant l'inhibiteur de la CYP 10x aux séries de cellules préparées pour l'expérience d'inhibition et pré-incuber pendant 30 minutes. Ensuite, remplacer le milieu dans la série d'inhibition par 450 microlitres de milieu frais, puis ajouter 50 microlitres de milieu contenant à la fois l'inhibiteur de la CYP 10x et le substrat traceur 10x. Ajouter 50 microlitres de milieu contenant le substrat traceur 10x aux autres cellules, puis ajouter une quantité équivalente de véhicule dilué dans le milieu aux témoins cellulaires (contrôles blancs).

Après une incubation des cellules de zéro à cinq minutes pour le point temporel un, contrôle zéro du fond, recueillir le milieu dans des tubes étiquetés séparés et congeler le milieu en vue d'un traitement ultérieur. Ensuite, incuber les cellules du point temporel deux pendant 16 heures dans l'incubateur cellulaire. À la fin de la période d'incubation, recueillir le milieu en utilisant la même méthode pour la quantification du produit métabolique.

Transférez 250 microlitres de milieu d'incubation dans un microtube de 1,5 millilitre et ajoutez une solution mère d'étalon interne de 4-méthylumbelliférone afin d'obtenir une concentration finale de 100 nanomolaire. Ajustez le pH du milieu entre 4,5 et 5,0 en ajoutant de l'acide chlorhydrique un molaire, un microlitre à la fois. Vérifiez le pH en pipetant deux à dix microlitres de milieu sur une bandelette de pH, puis ajoutez 150 unités de bêtaglucuronidase arylsulfatase provenant de Helix pomatia.

Après une incubation d'une heure à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction en ajoutant 250 microlitres de méthanol froid. Évaporer le solvant à l'aide d'une centrifugeuse à vide à 45 degrés Celsius. Reconstituer les échantillons avec 500 microlitres d'une solution d'acétonitrile à l'eau à 30 %.

Pour effectuer la quantification par spectrométrie de masse, ajouter 250 microlitres de chaque standard de dilution sérielle dans un flacon en verre chromatographique ultra-performant de couleur ambrée pour injection dans le système d'échantillonnage automatique UPLC-MS. Ajouter également les échantillons à tester dans des flacons UPLC ambrés et les placer dans le système d'échantillonnage automatique UPLC. Après avoir randomisé tous les flacons, exécuter l'UPLC-MS en utilisant les paramètres détaillés dans le protocole écrit, selon la sonde spécifique à quantifier.

Utilisez l'outil Quantitate, Build Quantitation Method dans les outils de quantification du spectromètre de masse pour générer la courbe d'étalonnage à partir de l'étalon synthétique et de l'étalon interne acquis, puis utilisez l'assistant de quantification (Quantitation Wizard) pour sélectionner le lot d'échantillons et les échantillons à quantifier, et exécuter la méthode de quantification. Pour induire CYP1A1, CYP1B1, utilisez la disposition de la plaque indiquée dans le protocole écrit. Incubez les cellules désignées pour l'induction avec une concentration finale de 10 nanomolaire de TCDD dans le milieu pendant une période de 72 heures.

À la fin de cette période, retirez le milieu, rincez les puits avec du PBS trois fois, puis ajoutez du milieu frais. Avant d'incuber les cellules avec la sonde rapporteur luminogène, pré-incubez le sous-ensemble désigné de cellules induites pendant 30 minutes avec l'inhibiteur de la CYP1A1 et de la CYP1B1 dans le milieu. Ajoutez la sonde luminogène, l'éther 6'-chloroéthylique de la luciférine, à une concentration finale de 50 micromolaire dans les cellules non induites, induites et induites en présence de l'inhibiteur.

Incuber pendant quatre heures, puis transférer 25 microlitres de milieu de culture dans une plaque opaque blanche à 96 puits et ajouter 25 microlitres du réactif de détection de la luciférine fourni par le fabricant. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, lire immédiatement la plaque à l’aide d’un luminomètre. La luminiscence relative produite par la déalkylation de l’éther 6’-chloroéthylique de la luciférine, catalysée par les CYP1A1 et CYP1B1, est présentée ici.

L'exemple montre une absence d'activité enzymatique en l'absence d'induction par le TCDD. Après induction par le TCDD, une activité de CYP1A1, CYP1B1 est observée dans les deux types cellulaires, hépatique et respiratoire. Enfin, l'ajout de l'inhibiteur de CYP1A1, CYP1B1, l'alpha-naphtoflavone, réduit ou élimine l'activité CYP.

Pour évaluer l'activité de CYP2A6 et de CYP2A13 dans les types cellulaires hépatiques et des voies respiratoires, la quantité de 7-hydroxycoumarine produite par hydroxylation de la coumarine par l'enzyme a été mesurée à l'aide de la CLUP ou LC-MS. À zéro minute d'incubation avec la coumarine, seul un signal de fond est détecté. Après 16 heures, une hydroxylation de la coumarine est observée, avec la formation de 7-hydroxycoumarine dans les deux types cellulaires.

Enfin, l'ajout de l'inhibiteur de la CYP2A, 2A13 empêche la formation de la 7-hydroxycoumarine. Une fois maîtrisées, les étapes d'incubation avec la sonde et de quantification de cette technique peuvent être réalisées en quelques heures à un jour dans la plupart des cas. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer divers dosages du métabolisme de phase I en utilisant différents types cellulaires, et de confirmer la spécificité de l'enzyme par inhibition et/ou induction selon les besoins.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que différents types cellulaires peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs, et il est essentiel d'inclure un type cellulaire pouvant servir de contrôle positif. N'oubliez pas que le travail avec le TCDD peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle complets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Les implications de cette technique s'étendent à l'utilisation de modèles in vitro appropriés pour l'évaluation préclinique de nouveaux médicaments ainsi que pour l'évaluation des risques liés aux produits chimiques et ingrédients utilisés dans les produits de consommation.