Name: Spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase I Caractériser métabolique des compétences In vitro Cell Cultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez une méthode simple pour évaluer l'activité des cytochromes P450 dans des cultures cellulaires in vitro. Cette approche utilise la spectrométrie de masse et des sondes luminogènes pour caractériser le métabolisme de phase I.

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Les auteurs remercient Epithelix Sarl et Biopredic International pour la fourniture des micrographies des cellules des voies respiratoires et des cellules hépatiques et Neil Smith pour la figure illustrant la procédure expérimentale.

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AB et EM étaient des employés de British American Tobacco au moment où ce manuscrit a été écrit. Les travaux décrits dans ce manuscrit a été financé par British American Tobacco, et les frais de publication de cette vidéo article a été payé par British American Tobacco.

À l&#39; heure actuelle, de nombreux systèmes de test toxicologiques standardisés utilisent des bactéries Engineered, des lignées cellulaires ou des cellules embryonnaires qui ne sont pas représentatives du métabolisme humain normal 1. Cela peut conduire à des prévisions inexactes de l&#39;activité potentielle toxique d&#39;un produit chimique ou de la médecine. Innovante dans les modèles in vitro, tels que des cultures de cellules 3D et organes sur une puce, sont en cours d&#39; élaboration dans le but de mieux reproduire la morphologie normale et l&#39; activité métabolique des tissus humains 21, 22, 23. compétence métabolique est un critère qui peut être utilisé pour déchiffrer les modèles sont mieux adaptés pour une évaluation toxicologique et des études biotransformation des médicaments. Le protocole que nous avons décrit dans le présent document est conçu pour mesurer l&#39;activité des enzymes CYP en utilisant des cellules vivantes. Il est flexible et peut être utilisé pour les systèmes cellulaires différents cultur 2D ou 3Des et offre la possibilité d&#39;utiliser un Probe- ou luminogène une approche basée sur la spectrométrie de masse. Les deux méthodes sont assez sensibles pour détecter des quantités de nanogrammes de matériaux et ne nécessitent qu&#39;un petit nombre de cellules cultivées dans un format multipuits. Ils peuvent également être appliqués à sphéroïde ou des cellules cultivées dans des matrices complexes. Le choix du substrat de sonde est évidemment un élément critique du protocole. La spécificité du dosage repose sur la sonde étant sélective de l&#39;enzyme CYP et une autre couche d&#39;assurance peut être obtenue par l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur de CYP sélective. Les substrats et inhibiteurs mentionnés dans le présent document ne sont que quelques exemples, mais d&#39;autres se trouvent dans la littérature. Il est important de considérer plusieurs temps d&#39;incubation lorsque vous travaillez avec un nouveau type de cellule à la suite de l&#39;activité de CYP négative pourrait être due à l&#39;enzyme exprimée à un faible niveau. L&#39;ajout d&#39;un type cellulaire qui peut être utilisé comme témoin positif est conseillé de veiller à ce qu&#39;unrésultat négatif est pas lié à un problème technique et d&#39;aider avec des procédures de dépannage. cellules hépatiques primaires sont métaboliquement compétentes et peuvent être utilisés comme contrôle, par exemple les hépatocytes primaires en suspension sont très faciles à utiliser, mais leur viabilité est limitée dans le temps. Des lignées de cellules hépatiques sont des alternatives possibles qui sont relativement faciles à utiliser comme décrit dans ce protocole, mais certains sont mieux que d&#39; autres en termes d&#39;activité métabolique 6, 21. Étant donné que le test est non destructive, à moins que la protéine totale est quantifiée, il est possible de suivre l&#39;activité de CYP au fil du temps dans les études longitudinales 20. Ceci est un point important parce que certaines cellules auront variables activité CYP au fil du temps dans la culture. Un résultat négatif peut être associé à l&#39;absence de confluence, des progrès avec la différenciation ou dédifférenciation in vitro. Dans ce cas, l&#39;approche est semi-quantitative puisque les données ne sont pas normalisée par la quantité totale de protéine dans chaque culture cellulaire. Il est pas toujours possible ou recommandé de réutiliser le tissu après avoir mesuré l&#39;activité de CYP que l&#39;exposition à des sondes, des inhibiteurs ou inducteurs peuvent avoir un effet toxique sur le tissu comme est le cas pour la TCDD. Les fractions cellulaires tels que les microsomes pourraient également être utilisées pour caractériser l&#39;activité de CYP d&#39;un type cellulaire donné. Microsomes préparatifs, cependant, nécessitent beaucoup de matériel cellulaire, l&#39;ajout de cofacteurs adéquates et un tampon pour assurer que les enzymes restent actives. L&#39;utilisation de cellules vivantes élimine l&#39;étape délicate de préparation de microsomes et de travail qui tamponne et cofacteurs fonctionnent le mieux. Comme recommandation générale, il est recommandé de caractériser le profil d&#39;expression de CYP dans des cultures de cellules pour vérifier qu&#39;il correspond à l&#39;activité enzymatique. Ce niveau supplémentaire de vérification est recommandée étant donné que les sondes métaboliques ne sont pas Enticompter spécifique à un seul CYP et lui donne une confiance accrue que l&#39;activité métabolique mesurée est compensée par l&#39;expression de l&#39;enzyme correspondante. Depuis CYP sont des protéines membranaires , ils sont relativement difficiles à préparer western blots, donc a été l&#39;approche privilégiée RT-PCR quantitative au profil de ces enzymes 20. Il est important de noter que ce protocole décrit une méthode pour tester l&#39;activité enzymatique CYP qui ne représente qu&#39;une famille d&#39;enzymes métaboliques, certes importante. La flexibilité d&#39;une approche par spectrométrie de masse permet le développement de méthodes d&#39;acquisition pour d&#39;autres transformations métaboliques de substrats de sonde. Cependant, celles-ci doivent être mis au point un à la fois et il y a actuellement moins de sondes spécifiques connues et des inhibiteurs sélectifs pour d&#39;autres familles d&#39;enzymes métaboliques. Cet écart doit être adressée à permettre une évaluation complète de la compétence métabolique in vitro systè cellulaireMme.

Le métabolisme des xénobiotiques est le processus par lequel des produits chimiques étrangers au corps sont modifiés par l&#39;ajout de groupes hydrophiles et conjugués pour faciliter leur excrétion 1. Typiquement , le métabolisme des xénobiotiques est un processus en deux étapes avec la première phase composée principalement d&#39;une oxydation avec l&#39;addition d&#39;un ou plusieurs groupes hydroxyle, 1 2. Lors de la phase II, les groupes hydroxyle sont utilisés comme accepteurs pour un conjugué hydrophile tel que le glucuronide ou un groupement sulfate 1, 2. Si un groupe accepteur est déjà présent sur les molécules, l&#39;étape de conjugaison peut se produire indépendamment du métabolisme de la phase I. Chaque réaction est réalisée par un groupe d&#39;enzymes spécifiques, par exemple, CYP (cytochromes P450), qui catalysent l&#39;hydroxylation (Figure 1) et la désalkylation de substrats chimiques 3. Conjugation est catalysée par des sulfotransférases, UDP-glucuronosyltransferases (figure 1), la glutathion-S-transférases et les N-acétyltransférases 4. Chaque tissu et organe auront un profil d&#39;expression de l&#39;enzyme métabolique spécifique, avec le foie exprimant la plupart de ces protéines. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figure 1: Exemple de phase I et de métabolisme de la coumarine Phase II. CYP2A6 / CYP2A13 catalyser la 7-hydroxylation de la coumarine. 7-hydroxycoumarine est conjugué à un fragment glucuronide par des enzymes de phase II UGT, avec UGT1A6 et UGT1A9 montrant la plus forte activité. Comprendre le métabolisme des xénobiotiques est essentiel dans l&#39;évaluation de l&#39;innocuité des médicaments et pour l&#39;évaluation des risques chimiques pour deux raisons: la cinétique de réaction détermineront combien de temps un médicament ou chimique restent dans le corps sous une forme active ou inactive bexcrétion vant; et le composé d&#39;origine peut être modifié pour une espèce plus réactive, instable et toxique par des enzymes métaboliques. De telles réactions aussi connu sous le nom « bioactivation » sont principalement motivés par la phase I CYP enzymes mais aussi plus rarement par la conjugaison de phase II 5. Sur cette base, la capacité d&#39;un modèle in vitro pour prédire avec précision le risque associé à un médicament ou d&#39; un produit chimique est très dépendante de la compétence métabolique du système cellulaire. Les lignées cellulaires dérivées de tissus malades ou de la transformation de cellules normales perdent souvent partie sinon la totalité du représentant de profil d&#39;enzyme métabolique de leur tissu d&#39;origine 6. Le maintien du profil d&#39;enzyme métabolique normal apparaît mieux dans les cultures de cellules primaires (au moins dans des cultures à court terme) et est encore améliorée si le tissu est mis en culture dans une matrice qui lui permet de conserver sa structure 3D 1. Par conséquent, l&#39;omble chevalieracterization de la compétence d&#39;un système métabolique cellulaire in vitro est une étape préliminaire importante pour guider la décision en ce qui concerne le modèle de la cellule est appropriée pour effectuer des évaluations de sécurité chimique. Dans cet article , nous présentons un protocole de profil de l&#39;activité et de l&#39; expression des enzymes de phase I CYP in vitro avec des exemples de leur application avec une lignée de cellules hépatiques et 7 des cultures de cellules pulmonaires primaires 3D 8. CYP substrats spécifiques, leurs produits métaboliques et l&#39;inhibiteur de contrôle sont décrits avec spectrometry- de masse et des méthodes de quantification sur la base luminogène. Étant donné que certains CYP sont inductibles et d&#39;autres sont constitutives, des exemples seront également donnés pour ces deux scénarios.

<table><tbody><tr><td><fort>réactif & Cellules </fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu ; m filtre seringue</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>24 puits</td><td>plaque Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-méthylombelliférone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-phényl pentyne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxybupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hydroxychlorzoxazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-éthoxycoumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hydroxycoumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-méthoxypsoralène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>acide acétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-naphtoflavone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidase/arylsulfatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazépine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>chlorzoxasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>collagène</td><td>Cell Systems</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>coumarine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfirame</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (supplément de glutamine)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG métabolisme supplément</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG décongélation supplément de média</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Cellules des voies respiratoires MucilAir</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>Cellules des voies respiratoires MucilAir Média d’entretien</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu ; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro ; m 2,1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</strong</td><td>>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp ;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS logiciel</td><td>Sciex&nbsp ;</td><td>Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td>luminomètre</td><td>Molecular Devices</td><td>Spectrophotomètre SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td> Compteur de cellules <td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>évaporateur rotatif</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase i caractériser métabolique des compétences<em&gt; in vitro</em&gt; cell cultures

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

enzymes métabolisant des xénobiotiques jouent un rôle clé dans la biotransformation de médicaments et de substances toxiques en ajoutant des groupes fonctionnels qui augmentent la solubilité et faciliter l&#39;excrétion. À certaines occasions, ces modifications structurelles conduisent à la formation de nouveaux produits toxiques. Afin de réduire les tests sur les animaux, le risque chimique peut être évaluée en utilisant des cellules métaboliquement compétentes. L&#39;expression des enzymes métaboliques, cependant, ne sont pas stables dans le temps dans de nombreux systèmes in vitro de culture primaire et est souvent partielle ou absente dans des lignées cellulaires. Par conséquent, l&#39;étude des médicaments, des additifs et le métabolisme des polluants de l&#39; environnement in vitro devrait idéalement être réalisée dans des systèmes cellulaires où l&#39; activité métabolique a été caractérisée. Nous expliquons ici une approche pour mesurer l&#39;activité d&#39;une classe d&#39;enzymes métaboliques (phase I humaine) dans des lignées cellulaires 2D et 3D cultures primaires utilisant des sondes chimiques et leurs produits métaboliques quantifiables par spectrométrie de masse et UPLCluminométrie. Le procédé peut être mis en oeuvre pour tester l&#39;activité métabolique dans des lignées cellulaires et des cellules primaires dérivées d&#39;une variété de tissus.

Des exemples de l&#39; activité métabolique mesurées pour deux paires de CYP (CYP1A1 / 1B1 et CYP2A6 / 2A13) dans les cultures de cellules des voies respiratoires provenant de trois donneurs différents (voies aériennes M360, M370, M417) et la lignée cellulaire hépatique (ligne Hep) sont représentés sur la figure 6 20. Activité CYP mesurée par luminométrie La figure 6A montre la luminescence par rapport produit par le CYP1A1 / 1B1 activité O-désalkylation de Luc-CEE (luciférine éther 6&#39;-chloroéthyl) dans les cellules des voies respiratoires (3 donneurs) et des cellules hépatiques avec ou sans induction TCDD. CYP1A1 / 1B1 sont des enzymes très inductibles et ne sont généralement pas exprimé à un niveau constitutif dans la plupart des tissus. Comme on peut le voir sur la figure 6A, aucun signal luminescent est détectée lorsque les cellules ne sont pas induits. Lorsque les deux types de cellules sont pré-incubées avec TCDD, un puissant inducteur du CYP1A1 / 1B1, une marquele signal ED est détectée par rapport au témoin (figure 6A). Ceci indique que la sonde Luc-CEE a été métabolisé conduisant à la libération de la fraction de la luciférine, qui est quantifié par la suite. Dans l&#39;ensemble de l&#39;activité de la lignée cellulaire hépatique traitée TCDD est plus faible que pour les cellules des voies respiratoires, même après la normalisation des protéines totales. Ce n&#39;est pas rare puisque les lignées cellulaires ont tendance à être moins actives que les cellules métaboliquement primaires. L&#39;addition d&#39;α-naphtoflavone a un effet inhibiteur net sur l&#39;activité CYP1A1 / de 1B1 dans tous les types cellulaires qui confirme en outre l&#39;CYP-dépendance du métabolisme Luc-CEE. Quantification des métabolites du CYP450 en utilisant UPLC-MS La figure 6B illustre la quantification de l&#39; activité de la CYP2A6 / 2A13 dans les cellules des voies respiratoires de 3 donneurs (Airway M343, M345, M347) et des cellules hépatiques (ligne Hep) après incubation avec de la coumarine en présence et en absence de l&#39;INHIbitor 8-méthoxypsoralène. Les données sont normalisées pour la protéine totale. Dans le contrôle d&#39;incubation de coumarine 0 min, on ne détecte 7-hydroxycoumarine (Figure 6B). CYP2A6 / 2A13 sont exprimés de manière constitutive dans certains tissus et donc après 16 h d&#39;incubation avec la formation de la coumarine de la 7-hydroxycoumarine est détectée dans les différents types de cellules testées, même sans induction. Lorsque 8-méthoxypsoralène, un inhibiteur de la CYP2A est ajouté (Figure 6B), la formation de la 7-hydroxycoumarine est considérablement réduit. Il convient de noter que, en présence de l&#39;inhibiteur de CYP, il est normal de détecter encore une activité résiduelle d&#39;inhibition est rarement complète et que d&#39;autres CYP pourrait également être en mesure de reconnaître le substrat, mais le traiter beaucoup moins efficace. On peut aussi observer que l&#39;activité métabolique enregistrée peut être différente entre les bailleurs de fonds lors de l&#39;utilisation des cellules primaires comme il est visible CYP2A6 dans les cellules des voies respiratoires(Figure 6B). Cela devrait l&#39;activité CYP est responsable au génotype de chaque donneur et polymorphismes. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figure 6: Dosage de l&#39; activité de résultats pour l&#39; activité CYP1A1 / 1B1 (A) et l&#39; activité de la CYP2A6 / 2A13 (B) dans la lignée de cellules hépatiques et en trois voies aériennes donneurs de téléphone mobile (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE activité de désalkylation est disponible avec et sans induction de CYP1A1 / 1B1 par TCDD. α-naphtoflavone a été utilisé comme inhibiteur de CYP1A1 / de 1B1. L&#39;activité est exprimée en unités de luminescence relatives (RLU) normalisée par la durée d&#39;incubation en minutes (min) et de la protéine totale (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ne nécessitent pas l&#39; induction car ils sont exprimés constitutivement. Coumarine activité 7-hydroxylation en protéines pmol / min / mg est représenté à différents points de temps avec ou sans l&#39;inhibiteur de 8-methoxypsorAlen. Tous les résultats sont présentés comme une valeur moyenne de trois mesures indépendantes avec des écarts types de la moyenne. Ce chiffre a été modifié de Baxter 20. Tableau supplémentaire 1: UPLC et Spectromètre de masse Paramètres. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Compétence métabolique des systèmes in vitro est une condition essentielle pour la biotransformation et l&#39; élimination des médicaments et produits toxiques. Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;application des sondes métaboliques de référence pour évaluer métabolisme de phase I dans les cultures cellulaires.

Spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase I Caractériser métabolique des compétences<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

L'objectif de cette procédure est de déterminer l'activité des cytochromes P450, ou CYP, dans des cellules en culture. Les CYP sont des enzymes clés impliquées dans le métabolisme des médicaments et des substances toxiques, et leur expression n'est souvent pas maintenue in vitro. L'expression normale des enzymes CYP est fréquemment perdue lorsque les cellules sont cultivées in vitro.Par conséquent, de nombreux modèles in vitro ont une pertinence potentiellement limitée pour comprendre le métabolisme des médicaments et des substances toxiques. Le principal avantage de cette méthode réside dans sa simplicité lors de l'évaluation de l'activité des CYP dans des cellules en culture. À l'aide de substrats indicateurs et d'inhibiteurs, différentes plateformes de quantification sont présentées, notamment la spectrométrie de masse.Pour commencer, récupérez des cryotubes contenant des cellules comme décrit dans le protocole écrit. Le protocole fourni utilise comme exemple une lignée cellulaire hépatique. En travaillant dans des conditions stériles, ouvrez soigneusement le cryotube pour relâcher toute pression excédentaire, puis pipetez le contenu du cryotube dans un tube de 10 millilitres contenant neuf millilitres de milieu Williams'E préalablement réchauffé à 37 degrés Celsius.Centrifuger la solution pendant 10 minutes à 400 × g à température ambiante. Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre les cellules dans 5 mL de milieu de décongélation propriétaire, préchauffé à 37 °C et supplémenté en glutamine. Après avoir dénombré les cellules viables selon le protocole décrit dans le texte, ensemencer les cellules dans une plaque de 24 puits revêtue de collagène à une densité de 60 000 cellules viables par puits et un volume final de 0,5 mL de milieu de décongélation.Après quelques jours en culture, les cellules forment une structure trabéculaire subconfluente. L'activité métabolique optimale est généralement observée entre les jours sept et dix, et est minimale au jour quatre. Pour préparer les cultures d'épithélium bronchique différencié, utilisez un épithélium bronchique primaire différencié entièrement disponible dans le commerce, cultivé à l'interface air-liquide sur un insert.À l’aide de pinces stériles, déloger délicatement l’insert cellulaire de la matrice d’agarose et le transférer dans la nouvelle plaque préchargée avec 700 microlitres de milieu de culture propriétaire. Évaluer l’intégrité du tissu respiratoire à l’aide de méthodes référencées dans le protocole textuel, telles que la résistance transepithéliale ou la fréquence de battement des cils. Avant l’expérience, préparer deux séries d’inserts cellulaires pour les cellules respiratoires et des puits pour les cellules hépatiques, avec un minimum de trois réplicats.Utilisez une série pour l'expérience d'inhibition et l'autre uniquement pour la sonde métabolique. Préparez une troisième série de cellules comme témoin de milieu. Le jour de l'expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par 450 microlitres de milieu frais.Ajouter 50 microlitres de milieu contenant l'inhibiteur de la CYP 10x aux séries de cellules préparées pour l'expérience d'inhibition et pré-incuber pendant 30 minutes. Ensuite, remplacer le milieu dans la série d'inhibition par 450 microlitres de milieu frais, puis ajouter 50 microlitres de milieu contenant à la fois l'inhibiteur de la CYP 10x et le substrat traceur 10x. Ajouter 50 microlitres de milieu contenant le substrat traceur 10x aux autres cellules, puis ajouter une quantité équivalente de véhicule dilué dans le milieu aux témoins cellulaires (contrôles blancs).Après une incubation des cellules de zéro à cinq minutes pour le point temporel un, contrôle zéro du fond, recueillir le milieu dans des tubes étiquetés séparés et congeler le milieu en vue d'un traitement ultérieur. Ensuite, incuber les cellules du point temporel deux pendant 16 heures dans l'incubateur cellulaire. À la fin de la période d'incubation, recueillir le milieu en utilisant la même méthode pour la quantification du produit métabolique.Transférez 250 microlitres de milieu d'incubation dans un microtube de 1,5 millilitre et ajoutez une solution mère d'étalon interne de 4-méthylumbelliférone afin d'obtenir une concentration finale de 100 nanomolaire. Ajustez le pH du milieu entre 4,5 et 5,0 en ajoutant de l'acide chlorhydrique un molaire, un microlitre à la fois. Vérifiez le pH en pipetant deux à dix microlitres de milieu sur une bandelette de pH, puis ajoutez 150 unités de bêtaglucuronidase arylsulfatase provenant de Helix pomatia.Après une incubation d'une heure à 37 degrés Celsius, arrêter la réaction en ajoutant 250 microlitres de méthanol froid. Évaporer le solvant à l'aide d'une centrifugeuse à vide à 45 degrés Celsius. Reconstituer les échantillons avec 500 microlitres d'une solution d'acétonitrile à l'eau à 30 %.Pour effectuer la quantification par spectrométrie de masse, ajouter 250 microlitres de chaque standard de dilution sérielle dans un flacon en verre chromatographique ultra-performant de couleur ambrée pour injection dans le système d'échantillonnage automatique UPLC-MS. Ajouter également les échantillons à tester dans des flacons UPLC ambrés et les placer dans le système d'échantillonnage automatique UPLC. Après avoir randomisé tous les flacons, exécuter l'UPLC-MS en utilisant les paramètres détaillés dans le protocole écrit, selon la sonde spécifique à quantifier.Utilisez l'outil Quantitate, Build Quantitation Method dans les outils de quantification du spectromètre de masse pour générer la courbe d'étalonnage à partir de l'étalon synthétique et de l'étalon interne acquis, puis utilisez l'assistant de quantification (Quantitation Wizard) pour sélectionner le lot d'échantillons et les échantillons à quantifier, et exécuter la méthode de quantification. Pour induire CYP1A1, CYP1B1, utilisez la disposition de la plaque indiquée dans le protocole écrit. Incubez les cellules désignées pour l'induction avec une concentration finale de 10 nanomolaire de TCDD dans le milieu pendant une période de 72 heures.À la fin de cette période, retirez le milieu, rincez les puits avec du PBS trois fois, puis ajoutez du milieu frais. Avant d'incuber les cellules avec la sonde rapporteur luminogène, pré-incubez le sous-ensemble désigné de cellules induites pendant 30 minutes avec l'inhibiteur de la CYP1A1 et de la CYP1B1 dans le milieu. Ajoutez la sonde luminogène, l'éther 6'-chloroéthylique de la luciférine, à une concentration finale de 50 micromolaire dans les cellules non induites, induites et induites en présence de l'inhibiteur.Incuber pendant quatre heures, puis transférer 25 microlitres de milieu de culture dans une plaque opaque blanche à 96 puits et ajouter 25 microlitres du réactif de détection de la luciférine fourni par le fabricant. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, lire immédiatement la plaque à l’aide d’un luminomètre. La luminiscence relative produite par la déalkylation de l’éther 6’-chloroéthylique de la luciférine, catalysée par les CYP1A1 et CYP1B1, est présentée ici.L'exemple montre une absence d'activité enzymatique en l'absence d'induction par le TCDD. Après induction par le TCDD, une activité de CYP1A1, CYP1B1 est observée dans les deux types cellulaires, hépatique et respiratoire. Enfin, l'ajout de l'inhibiteur de CYP1A1, CYP1B1, l'alpha-naphtoflavone, réduit ou élimine l'activité CYP.Pour évaluer l'activité de CYP2A6 et de CYP2A13 dans les types cellulaires hépatiques et des voies respiratoires, la quantité de 7-hydroxycoumarine produite par hydroxylation de la coumarine par l'enzyme a été mesurée à l'aide de la CLUP ou LC-MS. À zéro minute d'incubation avec la coumarine, seul un signal de fond est détecté. Après 16 heures, une hydroxylation de la coumarine est observée, avec la formation de 7-hydroxycoumarine dans les deux types cellulaires.Enfin, l'ajout de l'inhibiteur de la CYP2A, 2A13 empêche la formation de la 7-hydroxycoumarine. Une fois maîtrisées, les étapes d'incubation avec la sonde et de quantification de cette technique peuvent être réalisées en quelques heures à un jour dans la plupart des cas. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer divers dosages du métabolisme de phase I en utilisant différents types cellulaires, et de confirmer la spécificité de l'enzyme par inhibition et/ou induction selon les besoins.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que différents types cellulaires peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs, et il est essentiel d'inclure un type cellulaire pouvant servir de contrôle positif. N'oubliez pas que le travail avec le TCDD peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle complets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure. Les implications de cette technique s'étendent à l'utilisation de modèles in vitro appropriés pour l'évaluation préclinique de nouveaux médicaments ainsi que pour l'évaluation des risques liés aux produits chimiques et ingrédients utilisés dans les produits de consommation.

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