Spectrométrie de masse et les approches fondées luminogène à la phase I Caractériser métabolique des compétences In vitro Cell Cultures

Le but de cette procédure est de déterminer l’activité des cytochromes P450, ou CYP, dans des cellules en culture. Les CYP sont des enzymes clés impliquées dans le métabolisme des médicaments et des toxiques et leur expression n’est pas souvent retenue in vitro. L’expression normale des enzymes CYP est souvent perdue lorsque les cellules sont cultivées in vitro.

Par conséquent, de nombreux modèles in vitro sont susceptibles de limiter leur pertinence pour la compréhension du métabolisme des médicaments et des substances toxiques. Le principal avantage de cette méthode est sa simplicité lors de l’évaluation de l’activité du CYP dans les cellules en culture. À l’aide de substrats de sondes et d’inhibiteurs, différentes plateformes de quantification sont présentées, dont la spectrométrie de masse.

Pour commencer, procurez-vous des flacons cryogéniques avec des cellules comme décrit dans le protocole textuel. Le protocole fourni utilise une lignée de cellules hépatiques comme exemple. Lorsque vous travaillez dans des conditions stériles, ouvrez soigneusement le flacon cryogénique pour libérer tout excès de pression, puis pipetez le contenu du flacon cryogénique dans un tube de 10 millilitres rempli de neuf millilitres de milieu Williams’E préchauffé à 37 degrés Celsius.

Centrifuger la solution pendant 10 minutes à 400 fois g à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu de décongélation exclusif, préchauffé à 37 degrés Celsius et complété par de la glutamine. Après avoir compté les cellules viables comme décrit dans le protocole de texte, ensemencez les cellules dans une plaque recouverte de collagène à 24 puits à une densité de 60 000 cellules viables par puits et un volume final de 0,5 millilitre de milieu de décongélation.

Après quelques jours de culture, les cellules forment une structure trabéculaire subconfluente. L’activité métabolique optimale est généralement observée entre le septième et le dixième jour et est la plus basse au quatrième jour. Pour préparer les cultures d’épithélium différencié des voies respiratoires, utilisez des épithéliums primaires des voies respiratoires entièrement différenciés disponibles dans le commerce qui ont été cultivés à l’interface air-liquide sur un insert.

À l’aide d’une pince à épiler stérile, délogez doucement l’insert cellulaire de la matrice d’agarose et transférez-le sur la nouvelle plaque préchargée de 700 microlitres de milieu de culture exclusif. Évaluez l’intégrité du tissu des voies respiratoires à l’aide de méthodes référencées dans le protocole textuel, telles que la résistance transépithéliale ou la fréquence des battements des cils. Avant l’expérience, préparez deux séries d’inserts cellulaires pour les cellules des voies respiratoires et des puits pour les cellules hépatiques avec un minimum de trois répétitions.

Utilisez une série pour l’expérience d’inhibition et l’autre pour la sonde métabolique uniquement. Préparez une troisième série de cellules en tant que contrôle de vide de support. Le jour de l’expérience, remplacez le milieu de culture cellulaire par 450 microlitres de milieu frais.

Ajoutez 50 microlitres de milieu contenant l’inhibiteur 10x CYP à la série de cellules préparées pour l’expérience d’inhibition et pré-incubez pendant 30 minutes. Ensuite, remplacez le milieu de la série d’inhibition par 450 microlitres de milieu frais, et ajoutez 50 microlitres de milieu contenant à la fois l’inhibiteur 10x CYP et le substrat de la sonde 10x. Ajoutez 50 microlitres de milieu avec le substrat de la sonde 10x aux autres cellules, puis ajoutez une quantité équivalente de véhicule dilué dans le milieu aux commandes de cellules vierges.

Après avoir incubé les cellules pendant zéro à cinq minutes pour le point un, zéro contrôle de l’arrière-plan, collectez le milieu dans des tubes étiquetés séparés et congelez-le pour un traitement ultérieur. Ensuite, incubez le point temporel deux cellules pendant 16 heures dans l’incubateur de cellules. À la fin de la période d’incubation, prélever le milieu en utilisant la même méthode de quantification du produit métabolique.

Transférez 250 microlitres de milieu d’incubation dans un microtube de 1,5 millilitre et ajoutez une solution mère étalon interne de 4-méthylombelliférone pour atteindre une concentration finale de 100 nanomolaires. Ajustez le pH du milieu entre 4,5 et 5,0 en ajoutant une molaire de HCl, un microlitre à la fois. Vérifiez le pH en pipetant deux à 10 microlitres de milieu sur une bandelette de pH, puis ajoutez 150 unités de bêta-glucuronidase arylsulfatase d’Helix pamatia.

Après une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius, arrêtez la réaction en ajoutant 250 microlitres de méthanol froid. Évaporez le solvant à l’aide d’une centrifugeuse à vide à 45 degrés Celsius. Reconstituez les échantillons avec 500 microlitres d’une solution d’acétonitrile à 30 % dans l’eau.

Pour effectuer une quantification basée sur la spectrométrie de masse, ajoutez 250 microlitres de chaque étalon de dilution en série dans un flacon en verre de chromatographie liquide ambré à ultra haute performance pour injection dans l’échantillonneur automatique UPLC-MS. Ajoutez également les échantillons de test dans des flacons UPLC ambrés et placez-les dans l’échantillonneur automatique UPLC. Après avoir randomisé tous les flacons, exécutez l’UPLC-MS en utilisant les paramètres détaillés dans le protocole texte en fonction de la sonde spécifique à quantifier.

Utilisez l’outil Quantifier, construire une méthode de quantification dans les outils de quantification du spectromètre de masse pour générer la courbe d’étalonnage à partir de l’étalon synthétique et de l’étalon interne acquis, puis utilisez l’Assistant Quantification pour sélectionner le lot d’échantillons et les échantillons à quantifier et exécuter la méthode de quantification. Pour induire CYP1A1, CYP1B1, utilisez la disposition des plaques trouvée dans le protocole texte. Incuber les cellules désignées pour l’induction avec une concentration finale de 10 nanomolaires de TCDD dans le milieu pendant une période de 72 heures.

Après cette période, retirez le milieu, rincez les puits avec du PBS trois fois et ajoutez un peu de milieu frais. Avant d’incuber les cellules avec la sonde rapporteure luminogène, pré-incubez le sous-ensemble désigné de cellules induites pendant 30 minutes avec l’inhibiteur du CYP1A1, CYP1B1 dans le milieu. Ajouter l’éther chloroéthylique 6' de propène luminogène, la luciférine, à une concentration finale de 50 micromolaires, aux cellules inhibitrices non induites, induites et induites plus.

Incuber pendant quatre heures, puis transférer 25 microlitres de milieu de culture dans une plaque blanche opaque à 96 puits et ajouter 25 microlitres de réactif de détection de luciférine fourni par le fabricant. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, lire immédiatement la plaque à l’aide d’un luminomètre. La luminescence relative produite par la désalkylation de la luciférine 6' chloroéthyl éther, qui est catalysée par le CYP1A1, le CYP1B1, est présentée ici.

L’exemple ne montre aucune activité enzymatique en l’absence d’induction de TCDD. Après l’induction de la TCDD, l’activité du CYP1A1 et du CYP1B1 est observée dans les types de cellules hépatiques et respiratoires. Enfin, l’ajout de l’alpha-naphtoflavone, inhibiteur du CYP1B1, réduit ou élimine l’activité du CYP.

Pour évaluer l’activité des CYP2A6 et 2A13 dans les cellules hépatiques et des voies respiratoires, la quantité de 7-hydroxycoumarine produite par l’hydroxylation de la coumarine par l’enzyme a été mesurée à l’aide de l’UPLC LC-MS. À zéro minute d’incubation avec la coumarine, seul le bruit de fond est détecté. Après 16 heures, l’hydroxylation de la coumarine est observée avec la formation de 7-hydroxycoumarine dans les deux types de cellules.

Enfin, l’ajout de l’inhibiteur du CYP2A, 2A13 empêche la formation de la 7-hydroxycoumarine. Une fois maîtrisée, les parties d’incubation et de quantification de la sonde de cette technique peuvent être réalisées en quelques heures à une journée dans la plupart des cas. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer divers tests métaboliques de phase un en utilisant différents types de cellules, en confirmant la spécificité de l’enzyme en utilisant l’inhibition et/ou l’induction si nécessaire.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que différents types de cellules peuvent nécessiter des temps d’incubation plus longs, et il est essentiel d’inclure un type de cellule qui peut être utilisé comme contrôle positif. N’oubliez pas que travailler avec la TCDD peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles qu’un équipement de protection individuelle complet, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Les implications de cette technique s’étendent à l’utilisation de modèles in vitro appropriés pour l’évaluation préclinique de nouveaux médicaments et l’évaluation des risques des produits chimiques et des ingrédients utilisés dans les produits de consommation.